Un modelo de xenoinjerto murino de Ommaya para estudiar la terapia dirigida directamente de la enfermedad leptomeningeal

La enfermedad leptomeningeal (LMD) es una metástasis agresiva en etapa tardía del SNC, en la que las células tumorales acceden al LÍQUIDO CEFA y se infiltran en la superficie del cerebro y la médula espinal¹. Los cánceres más comunes que causan LMD incluyen los de mama y pulmón, así como el melanoma². La LMD da lugar a una serie de síntomas y signos neurológicos como dolores de cabeza, parálisis de los nervios craneales, rigidez en el cuello y radiculopatías. El pronóstico para los pacientes con LMD es generalmente muy pobre (la supervivencia promedio se mide en semanas) y es universalmente fatal^3,4,5,6,7. El tratamiento con cirugía, radiación y quimioterapia sistémica es paliativo. La terapia sistémica para la LMD puede fallar debido a la penetración inadecuada del fármaco en el CSF a través de una barrera intacta BBB o CSF sanguíneo a través del plexo^{coroideo 1}.

Por lo tanto, la administración de terapias contra el cáncer (por ejemplo, medicamentos y tratamientos basados en anticuerpos, incluidos inhibidores de puntos de control y terapias celulares) directamente en el LCR puede superar esta limitación⁸. El acceso y la toma de muestras de líquido lectivo a los pacientes es posible a través de un reservorio de Ommaya que se implanta debajo del cuero cabelludo. Este dispositivo permite la administración de agentes cancerígenos (por ejemplo, metotrexato y trastuzumab), así como la toma de muestras de CSF para estudios de diagnóstico (por ejemplo, el diagnóstico citológico de LMD para monitorear las respuestas al tratamiento) sin realizar una punción lumbar. Un reservorio murino de Ommaya fue diseñado para imitar los utilizados clínicamente. El depósito requiere el ensamblaje de un puerto de acceso y piezas espaciadores y una modificación de la técnica de canulación del ratón, que permite que el dispositivo permanezca permanentemente intacto durante toda la duración del estudio del fármaco. Este dispositivo ha sido designado como el "Ommaya murino".

En contraste con la técnica de bomba de infusión osmótica, que requiere la preparación de volúmenes líquidos excesivos para rellenar previamente el espacio vacío en el tubo y la infusión continua sobre inyecciones frecuentes^9,el Ommaya murino minimiza el desperdicio de soluciones farmacológicas. Permite la administración efectiva de múltiples dosis únicas de tratamientos en un momento dado en pequeñas cantidades (3-7 μL) en el CSF utilizando una jeringa Hamilton, un puerto de acceso en miniatura y un inyector automático. En tiempo real, la eficacia de los medicamentos de prueba contra la LMD se puede determinar mediante imágenes. Usando este enfoque, una variedad de quimioterapias, anticuerpos e inmunoterapias celulares (como agentes únicos o combinados) se pueden probar contra LMD para traducir los hallazgos in vivo en estrategias de tratamiento racionales para los pacientes. Para mejorar aún más la capacidad de imagen de un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de LMD, se llevó a cabo una colaboración con un fabricante para desarrollar una versión compatible con imágenes de resonancia magnética (MRI) del Murine Ommaya, que no requiere ensamblaje y está listo para usar. La capacidad de resonancia magnética es beneficiosa, especialmente para los modelos PDX en los que la cantidad de células tumorales circulantes (CTC) del CSF es a veces el factor limitante, y a menudo cuando el preetiquetado de CTC es inviable.

Este artículo describe un protocolo detallado que comienza con la inyección de CTC para renderizar ratones con LMD. El Ommaya murino se implanta quirúrgicamente y se realizan múltiples pasos de tratamiento farmacológico a través del Ommaya murino. Como prueba de concepto para la demostración, se realizó una comparación in vivo lado a lado, en la que se entregó el anticuerpo murino del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2) llamado clon 7.16.4 (el equivalente humano de trastuzumab)¹⁰. El anticuerpo se dirige a las células de cáncer de mama Her2^+, ya sea a través de la Ommaya murina (terapia dirigida directamente o intratecal) o por inyección intraperitoneal (terapia sistémica). Los resultados mostraron que los ratones con LMD que recibieron inmunoterapia intratecal directa vivieron significativamente más tiempo que los tratados con la misma terapia sistémicamente. Las metástasis del SNC en ratones tratados a través del Murine Ommaya fueron casi completamente regresadas por la tercera dosis de la tercera semana de tratamiento, lo que resultó en una mejor supervivencia general.

El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de Florida (IS00005974).

1. Inyección de CTC en CSF para generar un modelo LMD de ratón

1. Preparación de los COMITÉS contra el Terrorismo
   1. Calcule el número de CTC necesarios para la inyección y prepare una suspensión unicelular a 1,0 × 10⁴ células/μL en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Coloque la suspensión celular sobre hielo o a 4 °C durante todo el procedimiento.
      NOTA: Cuando use líneas celulares que requieran tripsinización, asegúrese de lavar las células dos veces con PBS estéril para eliminar la tripsina. Realice el recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado. Si se utiliza una cohorte grande (>50 ratones), haga un recuento de las células y valide la viabilidad celular entre inyecciones para garantizar que se administre un número constante de células por ratón.
2. Procedimiento prequirúrgico
   1. Inyecte al ratón por vía subcutánea 1 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (Bup-SR).
      NOTA: No inyecte el área de la incisión propuesta; elija un sitio de inyección bien alejado de la escápula.
   2. Anestesiar al ratón con 2-3% de isoflurano hasta que no muestre signos del reflejo de enrugamiento. Además, verifique si hay reflejo de pellizco de la cola y / o la pata para confirmar el estado de la anestesia.
   3. Prepare al ratón para la cirugía en un lugar alejado del área de operación. Recorte el sitio quirúrgico (es decir, la superficie dorsal del cráneo) con suficiente área de borde para evitar que el pelaje contamine el sitio de la incisión; luego, saturar el sitio con antiséptico de la piel germicida, trabajando desde el centro del sitio hasta la periferia, y luego dejar secar. Aplique una cortina estéril o un material de cortina plástica estéril con respaldo adhesivo para proteger el sitio quirúrgico de la contaminación.
      NOTA: Los instrumentos deben ser esterilizados en autoclave por adelantado y las puntas reesterilización entre los animales utilizando un esterilizador de cuentas de vidrio.
   4. Afeitar el pelaje de toda la superficie ventral de la cabeza y preparar la piel con técnica estéril.
   5. Coloque la nariz con un cono nasal modificado en forma de L del aparato estereotáctico, asegurando que las narinas permanezcan claras y abiertas. Usando cinta adhesiva a través de las superficies ventrales de ambas pinnas, tire suavemente de la piel hacia adelante para asegurarla al cono de la nariz y doble el cuello en un ángulo de aproximadamente 90 ° una vez asegurado. Administrar isoflurano al 1,5% para mantener la anestesia.
      NOTA: El posicionamiento adecuado dará como resultado que el área de la incisión se presente de una manera que permita la fácil identificación de la cresta caudal del hueso occipital.
   6. Coloque el cuerpo para asegurarse de que la columna vertebral se mantenga nivelada con la cisterna magna, y mientras aplica una ligera tracción a la cola, coloque cinta adhesiva en la base de la cola para asegurar.
3. Cisterna quirúrgica inyección magna
   1. Con el cuello en plena extensión, y comenzando justo entre las pinnas, corra las puntas de la tijera quirúrgica hacia abajo con una ligera presión a través del hueso occipital.
      NOTA: Mientras que en esta posición de la línea media, se nota una pequeña depresión cuando las puntas de la tijera se sumergen en el área cóncava sobre la cisterna magna.
   2. Haga una pequeña incisión en la línea media de 3-5 mm justo encima de la concavidad palpada. Extraiga 5 μL de suspensión celular a 1,0 × 10⁴ células/μL (total 5,0 × 10⁴ células) en una jeringa Hamilton de 30 G.
   3. Use fórceps de punta roma con puntas de 1-2 mm para presionar suavemente la cisterna magna. Introduce las puntas en una posición cerrada y ábrelas mientras aplicas presión hacia abajo sobre la duramadre.
   4. Repita la disección contundente descrita en el paso anterior hasta que la membrana dural se identifique fácilmente y los vasos sanguíneos asociados sean visibles en el área expuesta.
      NOTA: La ventana de inyección resultante garantiza que los vasos sanguíneos no se dañan durante la inserción de la aguja.
   5. Mientras mantiene las fórceps abiertas para retraer la musculatura circundante, introduzca una aguja sin corsuras de 30 G debajo de la duramadre para visualizar el bisel. Asegúrese de que la aguja solo se introduzca justo más allá del bisel. Despliegue lentamente un émbolo de jeringa y entregue células justo debajo de la duramadre.
   6. Coloque correctamente el bisel para observar la inyección debajo de la duramadre. Administre cuidadosamente la técnica y use la aguja sin perforación de 30 G para evitar daños en la membrana y garantizar una fuga mínima. Si se observan fugas, aplique una presión suave con un aplicador con punta de algodón.
   7. Cierre la piel aplicando un clip para heridas o una microbaja de adhesivo para la piel. Una vez que la inyección se realiza con éxito, permita que los ratones se recuperen de la anestesia en una manta caliente, observándolos continuamente hasta que puedan mantener la posición esternal y demostrar un movimiento intencional.
   8. Monitoree a los ratones diariamente después de la cirugía durante la primera semana. Si un ratón parece tener dolor o angustia, trátelo con 10 mg / kg de inyección subcutánea de carprofeno una vez cada 12 a 24 h durante un aumento de 5 días según la consulta veterinaria y la directiva. Permita que los ratones se recuperen y monitoréelos durante al menos 48 a 72 h antes de continuar con el siguiente paso.
      NOTA: Bup-SR, administrado preventivamente, durará hasta 72 h, por lo que normalmente no son necesarios analgésicos adicionales. Sin embargo, a los animales se les proporcionará analgésico adicional según sea necesario (si están letárgicos, no comen, se agitan). Si un sitio quirúrgico desarrolla signos de infección postoperatoria (es decir, enrojecimiento, hinchazón, sensibilidad, alodinia, hiperalgesia, hiperpatía o supuración), o si el ratón está protegiendo el área afectada, eutanasia al ratón. Si las células cancerosas se inyectan con éxito en el CSF, la LMD y la progresión del tumor se desarrollarán en el SNC dentro de 1 o 2 semanas (dependiendo de los tipos de CTC o línea celular utilizada) (Figura 1).

2. Montaje e implantación de Ommaya murino

1. Preparación de la estación
   1. Desinfectar la superficie de la estación. Coloque una cubierta azul sobre la superficie y mantenga listas todas las herramientas y suministros esterilizados indicados en la Figura 2.
2. Procedimiento prequirúrgico
   1. Aplicar analgesia (Bup-SR) y mantener la técnica estéril descrita en la sección 1.2.
3. Implantación quirúrgica de Ommaya murina
   1. Ensamble el dispositivo de inyección Murine Ommaya utilizando un puerto de inyección en miniatura de 25 G (0,51 mm de diámetro exterior) y un disco espaciador de 1 mm. Utilice un adhesivo estéril de cianoacrilato para asegurar la penetración de aproximadamente 2,5 mm de la cánula metálica en el hemisferio cerebral derecho(Figura 3A-C).
      NOTA: En este laboratorio se desarrolló un prototipo de Mouse Ommaya compatible con MRI, que ya tiene ambas partes (puerto de inyección en miniatura y espaciador) impresas en 3D juntas como una sola unidad(Figura 3D). La versión de una sola unidad fue probada por resonancia magnética y puede ahorrar tiempo al eliminar el paso de ensamblaje.
   2. Anestesiar al ratón con 2-3% de isoflurano hasta que no haya signos del reflejo de enrugamiento. Además, verifique si hay reflejo de pellizco de la cola y / o la pata para confirmar el estado de la anestesia.
   3. Afeitar toda la superficie ventral de la cabeza del pelaje y preparar la piel de acuerdo con la técnica estéril, como se describió anteriormente en el paso 1.2.3. Coloque el ratón en el aparato estereotáctico con un cono nasal para continuar la administración de isoflurano durante el procedimiento; disminuir el isoflurano al 1,5%. Apriete suavemente las barras de los oídos para asegurar la cabeza y aplique lubricante para los ojos para cubrir los ojos del ratón.
   4. Haga una pequeña incisión en la piel (3 mm), seguida de una disección contundente de los tejidos subcutáneos subyacentes para exponer el cráneo. Seque el cráneo con barras aplicadoras de punta de algodón empapadas en peróxido de hidrógeno.
   5. Perfore un orificio de rebaba en el cráneo de 0,5 mm posterior y 1,1 mm lateral del bregma, el punto anatómico del cráneo donde la sutura coronal se cruza perpendicularmente por la sutura sagital(Figura 3A),así como un orificio de rebaba de 0,9 mm para exponer la duramadre. Mueva el microdrill a un lado y puntúe suavemente el hueso que rodea inmediatamente el orificio de rebaba antes de insertar un puerto de inyección (profundidad de aproximadamente 2,5 mm), fijado al cráneo con un adhesivo estéril de cianoacrilato. Sutura de estado alrededor del punto de inyección utilizando suturas de nylon sin absorbancia 4-0 en un patrón de puntada interrumpido o sutura de cuerda de bolso¹¹.
   6. Alojar ratones postoperatorios en jaulas individuales para la recuperación de la cirugía.
      NOTA: Es posible que el Ommaya murino pueda desprenderse cuando múltiples ratones recuperados por cirugía se alojan en la misma jaula, posiblemente debido a interacciones constantes de manipulación. Se recomienda que los ratones implantados con Ommaya murino se albergen individualmente (o no más de 2 ratones por jaula) en el transcurso del ensayo de eficacia del medicamento.

3. Tratamiento de Ommaya murino

1. Dosificación de ratones usando el Murine Ommaya
   1. Anestesiar al ratón con 2-3% de isoflurano, hasta que no haya signos de reflejo de enrugamiento. Además, verifique si hay reflejo de pellizco de la cola y / o la pata para confirmar el mantenimiento de la anestesia.
   2. Acceda al Murine Ommaya utilizando un adaptador de inyección de puerto y una jeringa Hamilton. Con pinzas, sostenga la parte superior del puerto de inyección en miniatura e inserte suavemente el adaptador del inyector de puerto completamente en el tabique del puerto.
      NOTA: El inyector de puerto perfora el tabique del puerto de una manera que reduce el espacio muerto al mínimo y permite la inyección controlada a través de una bomba de jeringa motorizada(Figura 4A). Los tratamientos dirigidos/novedosos se inyectan a un caudal de 1 μL/min bajo anestesia. El tratamiento debe administrarse a intervalos específicos (diario / semanal) durante una duración determinada (semanas / meses), de acuerdo con la discreción del investigador.
      Un volumen entre 3 y 7 μL es óptimo, ya que un volumen < 3 μL no es confiable, y un volumen > 7 μL puede causar demasiada presión. El tamaño de la jeringa Hamilton puede variar de 10 a 100 μL, dependiendo del número de ratones en cada brazo de tratamiento. La precarga del volumen apropiado en la jeringa Hamilton evitará el reemplazo repetido de la jeringa, minimizando así los errores. Lo mejor es dedicar 1 jeringa Hamilton por brazo de tratamiento.
   3. Una vez realizada la inyección, separe el Ommaya murino del adaptador de inyección de puerto con pórceps y devuelva el ratón a la jaula para recuperarse de la anestesia, como se describe anteriormente en el paso 1.3.7.
2. Eutanasia
   1. Sacrificar a los ratones por inhalación de dióxido de carbono (CO₂₎de una fuente de tanque comprimido. Exponer a los ratones a concentraciones crecientes de CO₂ (es decir, se debe usar una tasa de desplazamiento del 10% al 30% del volumen de la cámara / min) para evitar o minimizar la incomodidad o la angustia. Monitoree a los ratones hasta la garantía de cese de los movimientos cardiovasculares y respiratorios.

En ratones, el volumen total de CSF es de aproximadamente 35-40 μL y se produce a una velocidad de aproximadamente 350 nL / min; da vueltas 12-13 veces al día12. Con el fin de visualizar la ruta de la inyección, se inyectó un 2% de Evans Blue a través del modelo Murine Ommaya, tras lo cual se dejaron transcurcer 15 min y 30 min antes de cosechar los cerebros para su análisis. El tinte se infiltró con éxito en los ventrículos y el cerebro en 15 minutos. En 30 minutos, el tinte se hizo visible en la médula espinal(Figura 4).

Como prueba de concepto, a los ratones BALB/c se les inyectó una línea celular de cáncer de mama Her2+ TUBO etiquetada con luciferasa intratracisternalmente, y se implantaron las Ommayas murinas. Aproximadamente 1 semana después de la inyección de células cancerosas, los ratones comenzaron a desarrollar LMD. Estos ratones fueron tratados una vez a la semana durante un período de hasta 4 semanas con inmunoterapia con anticuerpos Her2, ya sea a través de terapia sistémica mediante inyección intraperitoneal o intratecalmente a través de la Ommaya murina(Figura 5A).

Aunque los ratones no tratados murieron en el día 19, todos los ratones que recibieron terapia intratecal a través de la Ommaya murina sobrevivieron(P = 0,004). En la semana 4, se observó una regresión completa de los tumores. En comparación con los ratones tratados con terapia sistémica, que tuvieron un éxito moderado en el tratamiento de la LMD, los ratones que recibieron terapia intratecal tuvieron una supervivencia general mucho más larga(Figura 5B).

Figura 1: Inyección de células tumorales circulantes en la cisterna magna en un modelo de xenoinjerto murino para estudiar la enfermedad leptomeníngeo y las metástasis del sistema nervioso central. (A) Ilustración que muestra la ubicación de la cisterna magna y el sitio de acceso al CSF, en el que se inyectan CTC utilizando una jeringa de Hamilton. (B) Una imagen IVIS representativa de ratones que habían desarrollado enfermedad leptomeníngeo y metástasis del sistema nervioso central (cerebro y a lo largo de la médula espinal) después de 2 semanas de inyección con células tumorales circulantes. Las células fueron etiquetadas con un gen reportero de luciferasa. Los animales de control inyectados con solución salina no desarrollaron tumores (n = 3), y el experimento se realizó por triplicado. Abreviaturas: CTCs = células tumorales circulantes; IVIS = sistema de imágenes in vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Un ejemplo de una configuración de estación de trabajo para realizar la implantación de Ommaya murino en ratones. (1) Máquina de anestesia de gas / vaporizador. (2) Cortina de papel azul estéril que cubre un soporte estereotáxico. (3) Dispositivo estereotáxico (soporte / escenario, barras para los oídos, cono de la nariz). (4) Microdrill. (5) Lupa con luz. (6) Aplicador de algodón estéril pegado con solución salina estéril envase. (7) Peróxido de hidrógeno. (8) Esterilizador de cuentas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La implantación del dispositivo murino Ommaya. (A) Ilustración con una flecha que apunta a la ubicación del bregma en el cráneo, y la distancia aproximada a la que se perfora un orificio de rebaba en el cráneo (0,5 mm posterior / 1,1 mm lateral) desde el bregma utilizando un microdrill. (B) Una Ommaya murina se ensambla combinando una cánula de metal y un espaciador de 1 mm como base para la fijación de pegamento al cráneo. (C) Imágenes representativas de ratones a los que se le implantaron Ommayas murinas; estos ratones son monitoreados para asegurarse de que son brillantes, alertas y reactivos antes de recibir cualquier inyección. (D) Un ejemplo del prototipo de resonancia magnética compatible con imágenes murinas Ommaya e imágenes representativas de imágenes de resonancia magnética cerebral de implantes murinos Ommaya. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Inyección intraventricular (sistema nervioso central) utilizando la Ommaya murina. (A) Imagen de una inyección, accediendo al ventrículo y al sistema nervioso central a través de la Ommaya murina. Los ratones permanecen bajo anestesia durante la inyección. En el ejemplo, el Murine Ommaya está conectado al puerto en miniatura que está unido a una jeringa Hamilton precargada. Las inyecciones se realizan utilizando un conjunto de inyección automática a una velocidad de perfusión de 1 μL/min y un volumen de 5-7 μL. Se muestra una imagen de un cerebro de ratón inyectado con Evans Blue. El círculo muestra dónde se unió el Ommaya murino. No se observó ninguna fuga del tinte en el exterior del cerebro. Una sección transversal del cerebro muestra que los ventrículos laterales se llenaron con el tinte; el tinte no penetró en el parénquima cerebral. (B) Imágenes de cerebros de ratón después de 15 y 30 min después de la inyección de tinte Evans Blue. El tinte se infiltró en el cerebro (15 min) y comenzó a circular sobre la médula espinal (30 min). De 5 ratones, 4 recibieron tinte para visualización, y 1 sirvió como control. El experimento se repitió por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: La inmunoterapia dirigida directamente con el Ommaya murino aumenta la supervivencia general de los ratones con enfermedad leptomeníngeo asociado al cáncer de mama. ( A )Losratones BALB/c fueron inyectados con células TUBO 2 positivas para el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano con luciferasa, una línea celular de cáncer de mama murino. Tres días después de las inyecciones de cisterna magna, se implantaron Ommayas murinas. Los ratones comenzaron a desarrollar enfermedad leptomeníngeo (LMD) 1 semana después de la inyección. Los ratones LMD fueron tratados con un anticuerpo receptor del factor de crecimiento epidérmico humano sistémicamente a través de inyección intraperitoneal o vía intratecal (Murine Ommaya) como un enfoque dirigido directamente. Las inyecciones se administraron una vez a la semana durante un hasta 4 semanas. En comparación con los ratones no tratados, los ratones que recibieron inmunoterapia sobrevivieron mucho más tiempo. Los ratones Ommaya murinos tuvieron una regresión completa de la enfermedad en la cuarta semana, y estos ratones finalmente se curaron de la enfermedad. (B) Estos ratones también tuvieron una mediana de supervivencia significativamente mejor (prueba de Mantel-Cox; P = 0,004; n = 5 ratones por brazo de tratamiento) y mejor supervivencia global que los ratones LMD tratados sistemáticamente. Abreviaturas: LMD = enfermedad leptomeningeal; IP = intraperitoneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Peter Forsyth es miembro de los Consejos Asesores de Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen y Ziopharm, fuera del trabajo presentado. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.