Aislamiento e imágenes de regiones de marcapasos intactas y vivas de la pelvis renal del ratón mediante seccionamiento del vibratomo

Resumen

El objetivo de este protocolo es aislar las regiones intactas del marcapasos de la pelvis renal del ratón mediante la sección del vibratomo. Estas secciones se pueden utilizar para obtener imágenes de Ca²⁺ in situ para dilucidar las propiedades transitorias de Ca²⁺ de las células marcapasos y otras células intersticiales en rodajas de vibratomo.

Resumen

La pelvis renal (RP) es una estructura muscular lisa en forma de embudo que facilita el transporte normal de orina desde el riñón hasta el uréter mediante contracciones regulares y propulsivas. Las contracciones regulares de RP dependen de la actividad del marcapasos, que se origina en la región más proximal de la RP en la unión pelvis-riñón (PKJ). Debido a la dificultad para acceder y preservar las preparaciones intactas del PKJ, la mayoría de las investigaciones sobre marcapasos RP se han centrado en la electrofisiología de una sola célula y los experimentos de imágenes de Ca^{2 +.} Aunque de este trabajo han surgido importantes revelaciones sobre el marcapasos de RP, estos experimentos tienen varias limitaciones intrínsecas, incluida la incapacidad de determinar con precisión la identidad celular en suspensiones mixtas y la falta de imágenes in situ de la actividad del marcapasos de RP. Estos factores han dado lugar a una comprensión limitada de los mecanismos que subyacen a las contracciones rítmicas normales de RP. En este artículo, se describe un protocolo para preparar segmentos intactos de PKJ de ratón utilizando una técnica de seccionamiento de vibratome. Al combinar este enfoque con ratones que expresan reporteros específicos de células e indicadores de Ca^{2 +} codificados genéticamente, los investigadores pueden estudiar con mayor precisión los tipos y mecanismos celulares específicos responsables de las contracciones de RP peristálticas que son vitales para el transporte normal de orina.

Introducción

La pelvis renal (RP) es una estructura muscular lisa en forma de embudo que transporta la orina desde el riñón hasta el uréter. El RP transporta la orina generando contracciones rítmicas regulares (peristalsis)^1,2,3,4,5,que impulsa un bolo de orina desde el riñón distalmente hasta el uréter y finalmente hasta la vejiga, donde se almacena hasta que se produce la^{micción 6,7.} La pérdida de esta actividad regular tiene consecuencias nefastas, incluyendo hidronefrosis e insuficiencia renal^1,3,8; por lo tanto, existe una necesidad crítica de estudiar los mecanismos subyacentes a las contracciones regulares y rítmicas de RP. Las contracciones peristálticas se originan en la región más proximal de la RP-en la unión pelvis-riñón (PKJ)^{9,10,11,12,13,14,15} ( Figura1A-C) y se propagan distalmente para empujar la orina desde la papila hacia la RP(Figura 1B). La actividad del marcapasos eléctricos se registra en el PKJ como despolarizaciones transitorias espontáneas^{10,11,12,13,15,16,17,}que se cree que surgen de células marcapasos especializadas. Se creeque estas células marcapasos, anteriormente llamadas células atípicas del músculo liso (ASMC), generan o coordinan la actividad del marcapasos e impulsan las contracciones de las células "típicas" del músculo liso (SME)^{9,10,11, 18, 19,20,21,22,23.}

Los ASMCs son más abundantes en la RP proximal, en el PKJ(Figura 1A-C),donde se originan las contracciones peristálticas y la actividad eléctrica de los marcapasos^{5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22}. Un estudio publicado recientemente por este grupo identificó el factor de crecimiento derivado de plaquetas receptor alfa (PDGFRα), en combinación con la cadena pesada de miosina del músculo liso (smMHC), como un biomarcador único para estas células intersticiales (ICs)^24,un hallazgo que ha sido corroborado por otros grupos^25. En base a su morfología y patrón de expresión proteica, estas células fueron denominadas PDGFRα⁺ IC tipo 1 (PIC1)^24,26. Los PIC1 residen en la capa muscular del PKJ, donde muestran transitorios ca²⁺ de alta frecuencia y corta duración, que se cree que subyacen a la generación de potenciales de marcapasos²⁴. Sin embargo, existen otros tipos de células en el PKJ, incluyendo PDGFRα⁺ ICs (PIC2s) que no expresan smMHC en la capa adventicia. Informes anteriores han sugerido que los CIC no smMHC pueden participar en la regulación de la actividad de los marcapasos¹⁹. Sin embargo, el estudio adicional de los CD no smMHC se ve obstaculizado por la mala distinción durante los estudios de imágenes de Ca² +. Por lo general, los tipos de células heterogéneas dentro de las preparaciones de RP se cargan indiscriminadamente con colorantes sensibles a Ca²⁺(por ejemplo, Fluo-4). Para superar estos desafíos y estudiar una variedad de tipos de células en el RP, se pueden utilizar indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI) para expresar selectivamente fluoróforos sensibles a Ca²⁺en tipos celulares de interés.

La mayoría de los estudios que dilucidan las propiedades transitorias de Ca²⁺ en PIC1s/ASMCs se lograron mediante la obtención de imágenes de preparaciones de tejido RP de hoja plana^19,21,27. Como los PIC1 son el único tipo de célula en el PKJ que expresa smMHC, la expresión condicional del GECI, GCaMP, en células smMHC⁺ es apropiada para estudiar PIC1 en esta configuración. Sin embargo, como PIC1s y PIC2s expresan PDGFRα, la expresión condicional de variantes de GCaMP en células PDGFRα⁺ prohíbe la distinción celular en preparaciones de lámina plana. Para evitar este problema, se utilizó un enfoque de seccionamiento del vibratomo para distinguir PIC1 y PIC2 a través de la pared de tejido PKJ²⁴. Para revelar estas poblaciones celulares discretas, el RP se seccionó coronalmente, lo que permite identificar PIC2 en la adventicia y PIC1 en la pared muscular en función del etiquetado inmunohistoquímico conocido y los patrones de expresión de GECI. Como resultado de este novedoso enfoque de imágenes PKJ, se encontró que PIC1s y PIC2 muestran distintas propiedades de señalización de Ca^{2+ 24}. Además, al aislar las secciones más proximales de la región PKJ(Figura 2),la región del marcapasos del RP se conservó de una manera que no se había logrado anteriormente. Aquí, se describe un protocolo para mostrar cómo aislar las preparaciones de PKJ del riñón del ratón utilizando la sección del vibratomo, cómo configurar estas preparaciones para experimentos de imágenes de Ca^{2 +} y cómo distinguir los diferentes tipos de células a través de la pared de PKJ.

Protocolo

Todos los ratones utilizados y los protocolos descritos en este estudio estaban de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Nevada, Reno, NV. Los experimentos y el uso de animales también se ajustaron a los principios y regulaciones descritos por Grundy²⁸.

1. Generar ratones PDGFRα-GCaMP6f y SMCGCaMP3

1. Cruze ratones GCaMP6f^lox/+ (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze}/J) con ratones PDGFRα^Cre (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) para generar ratones PDGFRα-GCaMP6f.
2. Cruze ratones GCaMP3^lox/+ (B6.129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm38(CAG-GCaMP3)Hze/J)}con ratones machos smMHC^CreERT2 (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ER^T2)1Soff/J) para generar ratones SMC-GCaMP3.
   NOTA: Solo los ratones machos de la cruz (ratonesGCaMP3^lox/+ y ratones smMHC^CreERT2) se pueden usar ya que la expresión de Cre se impulsa desde el cromosoma Y. Los ratones smMHC^CreERT2 también se pueden cruzar con ratones^lox/+ GCaMP6f para mejorar la relación señal-ruido Ca²⁺ y propiedades temporales de señal Ca²⁺ más rápidas.

2. Preparar e inyectar ratones transgénicos con tamoxifeno para inducir la expresión condicional de GCaMP

1. Activar la Cre recombinasa inducible para la expresión de GCaMP específico de la célula en tipos celulares específicos, como se describió anteriormente²⁹.

3.   Preparar soluciones

1. Preparar 1 L de solución de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) que contenga 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO₃, 1,2 mM Na₂HPO₄,1,2 mM MgCl₂, 11,5 mM glucosa y 2,5 mM CaCl₂. El día de su uso, mantenga la solución KRB en hielo.
   NOTA: KRB se puede almacenar a 4 °C durante un período de hasta una semana y debe preburbujarse con una mezcla de 97% O₂ y 3% de CO₂ durante al menos 10 minutos antes de su uso.

4. Prepare platos de disección y de imágenes de microscopio recubiertos con elastómero de silicio

1. Mezcle los componentes de elastómero de silicio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Llene una placa de Petri de 35 mm x 10 mm y una placa de Petri de 60 mm x 15 mm aproximadamente un cuarto lleno de elastómero de silicio líquido para experimentos de imágenes y disección, respectivamente. Polimerizar el elastómero de silicio a 37 °C durante 1 día antes de su uso.
   NOTA: Para mejorar el contraste de las secciones delgadas del riñón, aplique un pequeño círculo negro de papel en la base de la placa de Petri de imágenes antes de llenarla con elastómero de silicio.

5. Disección renal

1. Anestesiar ratones por inhalación de isoflurano al 3-4% en una campana ventilada. Confirmar la inducción de anestesia profunda por pérdida del reflejo de pellizco del dedo del dedo del dedo del tipo y/o de la cola, y luego sacrificar a los ratones por luxación cervical.
2. Aplique etanol al 70% en el pecho para humedecer el pelaje. Usando tijeras de disección externas, abra la cavidad abdominal a través de una incisión longitudinal, con cuchillas de tijera en ángulo lejos del animal para evitar daños a los órganos internos.
3. Usando pinzas de tejido interno y tijeras de disección interna, pellizque los intestinos y levántelos lejos de la pared abdominal. Mientras levanta los intestinos, corte la parte inferior de los intestinos libre del cuerpo en el duodeno proximal y el colon distal para obtener acceso al espacio retroperitoneal que contiene los riñones.
4. Una vez que los riñones están expuestos, extráigalos individualmente. Pellizque suavemente y levante el extremo distal del uréter (~ 4 mm de distancia del riñón) con fórceps de tejido. Usando las tijeras de disección, corte debajo del uréter pellizcado hacia el riñón. Continúe cortando debajo del riñón hasta que se haya liberado del tejido conectivo circundante.
   NOTA: Para maximizar la integridad del tejido y la consistencia del corte durante la sección del vibratoma, el riñón debe estar lo más intacto posible. Para asegurar esto, evite pellizcar o cortar el riñón con pinzas y tijeras de disección.
5. Coloque el riñón con el uréter conectado en una solución de KRB helada. Repita los pasos 5.4 y 5.5 con el riñón contralateral. Mantenga los riñones en solución de KRB sobre hielo.
   NOTA: Proceda inmediatamente a la siguiente sección del protocolo para preservar la viabilidad del tejido PKJ. Debido a su ubicación anatómica profunda en el parénquima renal, el PKJ se ve privado de contacto con la solución de KRB.

6. Prepare el riñón para la seccionamiento del vibratomo

1. Transfiera el riñón a una placa de disección recubierta de elastómero de silicio (60 mm x 15 mm) y llénelo con una solución de KRB helada hasta que el riñón esté completamente sumergido.
2. Bajo un microscopio de disección, ancle el riñón a la base del plato insertando alfileres minutien en el uréter proximal y a través de la delgada cápsula renal anterior o el tejido adiposo circundante.
   NOTA: Tenga cuidado de no perforar el tejido del parénquima renal.
3. Use tijeras de resorte fino y pórceps internos para eliminar el tejido adiposo de la base del riñón para exponer la RP distal y el uréter proximal.
4. Retire el uréter proximal y una parte de la RP distal de la base de RP con tijeras de resorte fino.
   NOTA: Tenga cuidado de no cortar el parénquima renal circundante. La línea discontinua negra de la Figura 1A indica la posición aproximada de este corte. Este corte crea una base plana en el riñón para una sección de tejido más uniforme. Al diseccionar el riñón, uno debe ser consciente de la posición anatómica de la región PKJ. La Figura 1B muestra que el riñón intacto se puede cortar a lo largo de un plano sagital para exponer la médula, la papila (médula distal donde convergen los conductos colgantes) y la RP proximal y distal. Si la papila se expusiera completamente, como en la Figura 1C, se puede visualizar el PKJ y el RP proximal (prox RP). Sin embargo, esto no debe hacerse para la técnica del vibratomo; esta descripción es para orientar al lector a la ubicación de PKJ en general, enfatizada en la diferencia anatómica mostrada en las imágenes de luz transmitidas de la región PKJ y la región RP media en la Figura 1D,E.
5. Perfore la cápsula renal externa con pórceps de punta fina, inclinando las puntas lejos del cuerpo renal. Usando pinzas con cada mano, pellizque los extremos sueltos de la cápsula y pélelos. Continúe pelando la membrana de la cápsula renal restante hasta que se elimine por completo.
   NOTA: La cápsula renal es una capa dura y fibrosa que rodea el riñón. Debe retirarse antes de la sección del vibratomo para un corte óptimo.

7. Preparar y calibrar el instrumento vibratome

1. Inserte una cuchilla de afeitar en el soporte de la cuchilla del instrumento vibratome y ajuste el ángulo de holgura de la cuchilla a ~ 18 °.
   NOTA: Como paso opcional para una sección de mayor calidad, se debe utilizar un bloque de calibración (provisto de algunos instrumentos de vibratomo) para ajustar la posición de la cuchilla para cada cuchilla nueva utilizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto asegurará un posicionamiento óptimo de la cuchilla y minimizará la vibración vertical.
2. Ajuste la velocidad de avance de la cuchilla a 0,2 mm/s, la vibración horizontal/escarpada de la cuchilla a una amplitud de 2,00 mm y el tamaño del paso Z de la cuchilla a ~100-150 μm. Asegúrese de que el grosor de la sección renal no exceda los 150 μm, ya que esto afectará negativamente a los experimentos de imágenes de Ca^{2 +} (porque la pared PKJ a menudo rodará y se doblará sobre sí misma si es demasiado gruesa).
   NOTA: El usuario debe ajustar estos parámetros de corte porque la configuración variará entre las preparaciones renales individuales y los instrumentos de vibratomo. El ajuste fino debe tener lugar durante la sección cuando el usuario puede inspeccionar visualmente las secciones bajo un microscopio, como se describe en el paso 7.2.
3. Instale un baño de hielo y una bandeja de amortiguación en el instrumento vibratome. Llene el baño de hielo con hielo picado y llene el área de la etapa interna con una solución de KRB helada (llene aproximadamente hasta la mitad). Durante la seccionamiento del vibratomo, monitoree y reemplace el hielo picado que se ha derretido.

8. Vibratome seccionando el riñón

1. Use forrórceps de extremo romo para agarrar y quitar suavemente el riñón preparado de la solución de KRB helada. Coloque inmediatamente el riñón sobre papel absorbente durante ~ 2-4 s para eliminar el exceso de humedad externa. Enrolle suavemente el riñón a través del papel absorbente para asegurarse de que todos los lados del parénquima se hayan secado para que haya una adhesión óptima del riñón a la etapa de vibratomo.
   NOTA: Como el RP se encuentra dentro del riñón y, por lo tanto, está protegido por el parénquima externo, este corto período de secado no sería perjudicial para la integridad del tejido.
2. Aplique inmediatamente una capa delgada de pegamento de cianoacrilato (~ 1 cm²) en la base de la placa de muestra de vibratome y use fórceps de extremo romo para colocar el riñón, el uréter hacia abajo, en el área cubierta de pegamento. Aplique suavemente presión hacia abajo en la parte superior del riñón con el borde plano de las pórceps durante aproximadamente 10-20 s para secar el pegamento.
   NOTA: Para estabilizar el riñón durante este procedimiento, use un par de pórceps adicionales para mantener el riñón erguido a medida que el pegamento se seca. Es fundamental que el riñón se adhiera a la placa de la muestra en posición vertical para que las secciones se corten rectas. Para asegurarse de que el riñón se haya adherido con éxito a la placa de muestra, empuje suavemente el lado del riñón. Si el riñón se ha adherido con éxito a la placa, la base del riñón debe permanecer asegurada a la placa.
3. Asegure firmemente la placa de muestra al fondo de la bandeja de amortiguación. Ajuste el nivel de la solución KRB para que la parte superior del riñón esté completamente sumergida. Durante los pasos de seccionamiento, a medida que la cuchilla vibratome se mueve más profundamente en la bandeja de búfer, retire la solución KRB para que el soporte de la cuchilla no se sumerja en la solución.
   NOTA: Si el pegamento no se ha secado completamente antes de continuar con este paso, el pegamento a menudo se moverá hacia arriba desde la base y hacia el parénquima renal. Este exceso de pegamento hará que la sección sea más variable. Si esto sucede, retire el riñón de la placa y proceda con una preparación renal fresca.
4. Para la sección automática del vibratomo, seleccione las posiciones de inicio y finalización del ciclo de corte de la cuchilla del vibratomo. Verifique que estas posiciones estén a ~ 0.5-1 cm del riñón para asegurarse de que con cada avance de la cuchilla, todo el plano del riñón se seccione.
5. Prepare una placa de múltiples oryes (24 o 48 pozos) llenando los pozos con solución KRB y coloque la placa sobre hielo.
   NOTA: Cuando se generan, las secciones individuales deben colocarse en pozos separados para realizar un seguimiento de la profundidad de la sección.
6. Inicie el proceso de corte automático. Durante el paso inicial de la cuchilla, asegúrese de que la cuchilla haga contacto con la parte superior del riñón. Si no se realiza contacto, ajuste la posición Z inicial de la cuchilla.
7. Usando forrórceps, recoja las secciones que se liberan del riñón. Transfiera inmediatamente las secciones a pozos individuales y observe la profundidad Z de las secciones para medir la ubicación aproximada de PKJ dentro de las secciones renales.
   NOTA: Dependiendo de los parámetros de corte, es posible que algunas secciones no se corten libres del bloqueo renal. Si esto ocurre, use cuidadosamente tijeras de resorte fino para cortar secciones del bloqueo renal. También se anima a los usuarios a visualizar activamente las secciones bajo un microscopio de luz mientras flotan libremente en pozos individuales para garantizar una configuración óptima del corte y la ubicación del tejido. Las secciones que contienen el PKJ generalmente se derivarán ~ 1000-1500 μm de la parte superior del riñón.
8. Continúe con el protocolo de seccionamiento hasta que las regiones PKJ se vuelvan más evidentes. Consulte la sección de resultados representativos para obtener una descripción de las regiones del PKJ a medida que avanza la sección.
9. En este punto, optimice los parámetros de seccionamiento para garantizar que las secciones se liberen del bloqueo renal de manera uniforme y estén intactas. Además, asegúrese de que las regiones PKJ sean continuas e ininterrumpidas porque las paredes PKJ rotas no permitirán imágenes adecuadas de las células dentro de la pared debido al colapso. Si las paredes se rompen, disminuya la velocidad de seccionamiento y aumente el grosor de la sección, y continúe observando las secciones bajo un microscopio de luz para ajustar los parámetros de corte.
10. Almacene las secciones a 4°C en la solución KRB hasta que comience la experimentación.

9. Adquisición de imágenes de Ca^{2+ en} rodajas de riñón

1. Transfiera una rebanada de riñón individual a un plato de imágenes recubierto de elastómero de silicio (35 mm x 10 mm) e inmediatamente llene el plato con una solución de KRB fresca y helada.
2. Inserte alfileres minutien alrededor de la periferia de una rebanada de riñón para asegurar la sección a la base de la placa de imágenes.
   NOTA: Este paso es fundamental para evitar que la sección se mueva cuando se perfunden soluciones fisiológicas sobre la rebanada durante la toma de imágenes.
3. Coloque la placa de imágenes en el escenario de un microscopio confocal de disco giratorio vertical e inmediatamente comience a perfundir con la solución KRB.
   NOTA: En este protocolo, se utilizó un microscopio vertical equipado con una unidad de escáner confocal de disco giratorio Nipkow de alta velocidad.
4. Mantenga la velocidad de perfusión a 3 ml/min y la temperatura de la solución KRB a 36 ± 1 °C. Antes de tomar la imagen, deje que la rebanada se equilibre durante 1 h.
5. Seleccione el cubo y los láseres de imagen dicroica apropiados. Adquiera imágenes con un dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD) o una cámara científica complementaria de metal-óxido-semiconductor.
   NOTA: El sistema confocal en este protocolo está equipado con un láser de 488 nm para excitar GCaMP6f o GCaMP3. Las imágenes se adquirieron utilizando una cámara EMCCD de 512 píxeles x 512 píxeles.
6. Use una lente de objetivo de inmersión en agua de bajo aumento (4x o 10x) para localizar la rebanada de riñón. Centrar el campo de imágenes en las áreas de la rebanada donde el PKJ está presente. Identifique puntos de referencia, como se muestra en la Figura 2D,para localizar el PKJ (es decir, semicírculos de tejidos musculares suspendidos entre el tejido parenquimatoso).
7. Una vez que se encuentre el PKJ, use una lente de objetivo de inmersión en agua de mayor aumento (20x, 40x o 60x) para ampliar el área de interés.
   NOTA: En este protocolo, la apertura numérica (NA) del objetivo 20x fue 1.0, la NA del objetivo 40x fue 0.8 y la NA del objetivo 60x fue 1.0.
8. Distinguir diferentes células de interés en la pared PKJ utilizando ratones transgénicos que expresan GCaMP6f o GCaMP3 en células PDGFRα+ o SME, respectivamente. Observe los diferentes tipos de duraciones transitorias de Ca²⁺ en células PDGFRα⁺ en la pared PKJ en PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ cortes de riñón(Figura 3C,ver resultados representativos para la descripción) y en GCaMP3⁺ SMC en SMC GCaMP3⁺ rebanadas de riñón(Figura 3D,ver resultados representativos para la descripción).
9. Una vez que se hayan identificado las células de interés en la pared PKJ, ajuste la intensidad del láser para producir una buena relación señal-ruido. Grabe imágenes a una frecuencia de muestreo temporal entre 16 Hz y 32 Hz utilizando el software de adquisición adecuado.
   NOTA: Dependiendo de la intensidad del láser utilizado durante la toma de imágenes, se recomienda limitar el número de grabaciones debido a los efectos blanqueadores en los fluoróforos Ca^2+. El usuario debe elegir la duración de la grabación en función de los objetivos experimentales específicos.

10. Análisis de imágenes Ca²⁺

1. Realizar análisis de imágenes de Ca²⁺ de diferentes tipos de células en regiones de marcapasos PKJ mediante mapeo espaciotemporal como se describió anteriormente para otras preparaciones de marcapasos intactos en el tracto gastrointestinal^29,30.

Resultados

Las imágenes in situ de Ca²⁺ del PKJ pueden revelar una importante actividad celular de las células marcapasos RP. Mediante el uso de ratones que expresan indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (como GCaMP), impulsados por promotores específicos de la célula, se puede obtener información sobre el marcapasos de RP con precisión y detalle que no es posible a partir de experimentos de imágenes de Ca²⁺ de preparaciones de RP de hoja plana. El comienzo de la PKJ se distingue por la aparición repentina de semicírculos de músculo suspendidos entre el tejido parenquimatoso renal(Figura 2C;PKJ proximal encerrado en una caja discontinua). Durante las rondas posteriores de seccionamiento, la médula interna se distingue del tejido cortical circundante. Bajo un microscopio de luz, la médula interna aparece estriada en regiones, de color más claro en comparación con el tejido cortical y discontinua en su eje largo con el resto del riñón(Figura 2B,D). En este punto, comenzarán a aparecer más regiones PKJ. Ejemplos de esto se muestran en la Figura 2D (rectángulos discontinuos, H y G) donde 3 semicírculos de músculo están suspendidos por tejido parenquimatoso. Estas bandas musculares se aplicarán estrechamente a la papila interna y típicamente se aproximarán a una arteriola renal(Figura 2D,rectángulos discontinuos; Figura 2F-H,puntas de flecha negras). A medida que se deriven más secciones distales, estas bandas de músculo se integrarán para formar una estructura más completa y unificada, indicando el final de la región PKJ(Figura 2E).
La Figura 3A,B muestra una sección PKJ a baja potencia (4-10x) de un ratón que expresa GCaMP en células PDGFRα+ (GCaMP6f expresada por Cre-recombinasa inducible impulsada por Pdgfra). Usando puntos de referencia como la arteriola renal(Figura 3A;asterisco), los experimentadores deben ser capaces de distinguir fácilmente la delgada pared PKJ suspendida entre el tejido parenquimatoso(Figura 3B;asteriscos). La expresión de GCaMP6f en este tejido transgénico específico se extiende a lo largo de todo el ancho del PKJ, tanto en la capa muscular como en la adventitial(Figura 3C).

En pdGFRα⁺ GCaMP6f⁺ cortes de riñón, una red de células que típicamente se extiende sobre el ancho de la pared PKJ será fluorescente(Figura 3C)y mostrará transitorios oscilantes de Ca²⁺ de varias duraciones y frecuencias. Las celdas PDGFRα⁺ en la pared PKJ muestran dos tipos diferentes de duraciones transitorias de Ca^2+. En la capa adventicia (orientada más cerca de la corteza), se definen las células PDGFRα+ presentes como una red de células y sus procesos. Las células adventicias PDGFRα⁺ exhiben transitorios de baja frecuencia (4 ± 2,7 Hz) y de larga duración (1 ± 0,67 s) Ca^2+. La segunda capa de células PDGFRα^+, presentes en la capa muscular (orientadas más cerca de la médula), exhiben frecuencias y duraciones transitorias de Ca²⁺ similares a las células SMC GCaMP3+ (descritas a continuación) ya que son del mismo tipo celular.

En SMC GCaMP3⁺ cortes de riñón, una capa de células GCaMP3⁺ está presente en la capa muscular ( Figura3D). No habrá señal fluorescente en la capa adventicia(Figura 3D;asterisco). Los GCaMP3⁺ SMIC en la capa muscular suelen exhibir^transitorios de alta frecuencia (10 ± 4 Hz) y de corta duración (632 ± 74 s). Las células PDGFRα⁺ ubicadas en la adventicia PKJ provocan transitorios Ca²⁺ de larga duración y baja frecuencia(Figura 3E,Video 1). Sin embargo, los experimentos de imágenes de Ca²⁺ a partir de tejidos que expresan GCaMP3 impulsados por el promotor Myh11 se restringen al aspecto muscular del PKJ(Figura 3D). En comparación con las células PDGFRα⁺ en la adventicia, los SMIC dispararon transitorios ca^{2+ de} menor duración con mayor frecuencia(Figura 3F,Video 2).

Además de comprender las propiedades de señalización en PKJ PDGFRα⁺ ICs, la aplicación de esta técnica para estudiar otros tipos de células en el riñón seccionado con vibratoma se ha demostrado en este trabajo. Tras un examen minucioso de la médula renal (en ratones que expresan GCaMP6f en células PDGFRα^+), se observó una serie de señales fluorescentes de Ca²⁺ dentro y alrededor de los conductos colgantes (Video 3). Las células MEDULARES PDGFRα+ dispararon transitorios espontáneos de Ca²⁺ de frecuencia y duración variables. Estos estudios de imágenes de Ca^{2 +} de secciones de vibratomo renal también podrían ampliarse para estudiar las arteriolas renales (~ 50-80 mm de diámetro) que a menudo se encuentran con segmentos musculares PKJ vecinos(Figura 2F,G; flechas blancas). Las imágenes de Ca²⁺ de arteriolas renales (a partir de tejido que expresa GCaMP en células musculares lisas) muestran transitorios oscilantes de Ca²⁺ en SMCs (Video 4).

Figura 1: Anatomía renal básica y ubicación de la región del marcapasos PKJ. (A) Diagrama del riñón intacto que muestra la orientación de la RP y el uréter. La arteria renal y la vena renal se muestran en rojo y azul, respectivamente. (B) El riñón intacto se puede cortar a lo largo de un plano sagital para exponer el aspecto interno del riñón, incluyendo la médula, la papila (médula distal donde convergen los conductos colgantes) y la RP proximal y distal. (C) La médula y la papila se pueden extirpar para exponer completamente el PKJ y el prox RP. (D y E) representan imágenes de luz transmitidas desde la región del marcapasos PKJ y la RP distal, respectivamente. La sección secuencial hacia el extremo distal de la pelvis da como resultado que los semicírculos de músculo en la región PKJ(Di)se combinen en un anillo muscular más grueso(Ei) que encapsula toda la papila. Los rectángulos negros y discontinuos en Di y Ei muestran áreas aproximadas en las secciones del riñón coronal donde se adquirieron imágenes de luz transmitidas. La orientación de las imágenes D y E es de 90° en sentido contrario a las agujas del reloj a los respectivos recuadros(Di y Ei). Barras de escala en D y E = 20 μm. Abreviaturas: RP = pelvis renal; prox RP = pelvis renal proximal; PKJ = unión pélvico-renal; PIC = células intersticiales receptoras alfa-positivas del factor de crecimiento derivado de plaquetas; SMC = célula del músculo liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Seccionamiento vibratome de riñones enteros para generar secciones delgadas. (A) Los riñones se montan de lado hacia abajo hasta la base del instrumento vibratome, y se utiliza una cuchilla estándar (unida a la cabeza del vibratomo) para cortar secciones secuenciales desde el extremo proximal al distal del riñón. (B) Representación esquemática de una sección delgada cortada de todo el riñón con puntos de referencia anotados. Los segmentos musculares PKJ (rectángulo discontinuo negro) a menudo se encuentran suspendidos entre el tejido parenquimatoso. (C) Imagen microscópica ligera de una sección renal proximal. La aparición de bandas musculares suspendidas entre el tejido parenquimatoso indica el comienzo de las proyecciones proximales de PKJ (indicadas dentro del rectángulo discontinuo blanco). (D) Imagen microscópica de luz que representa la región óptima donde se pueden encontrar múltiples (2-3) segmentos PKJ (áreas dentro de rectángulos discontinuos blancos). Las tiras musculares delgadas de PKJ se suspenden entre el parénquima renal y se alinean estrechamente con las arteriolas renales y la médula. (E) Imagen microscópica ligera de una sección renal distal. Los segmentos musculares individuales se han fusionado para formar una sola banda muscular continua (rectángulo discontinuo blanco) que rodea la papila interna (no presente en esta imagen). Las barras de escala C-E = 500 μm. F-H Las regiones ampliadas (20x) del panel D indican la ubicación del PKJ (puntas de flecha negras), las arteriolas renales (puntas de flecha blancas) y los sitios de corte para aislar el PKJ (líneas blancas discontinuas). Barras de escala F-H = 100 μm. Abreviatura: PKJ = unión pélvico-renal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:Imágenes Ca²⁺ de secciones de vibratomo. (A) Imagen representativa de baja potencia (4x) de una sección vibratótica que denota la ubicación de la arteriola renal (asterisco). Barra de escala = 200 μm. (B) Imagen representativa ampliada (20x) del PKJ (etiquetado) suspendido entre el tejido parenquimatoso renal que denota ubicaciones del músculo PKJ (punta de flecha blanca), arteriola renal (asterisco). Barra de escala = 50 μm. (C) Imagen de alta potencia (40x) del PKJ que expresa GCaMP en células PDGFRα^+. Barra de escala = 20 μm. (D) Imagen de alta potencia (20x) del PKJ que expresa GCaMP en células del músculo liso. Barra de escala = 20 μm. (E) Mapa espaciotemporal de transitorios ca²⁺ muestreados de una célula GCaMP⁺ PDGFRα⁺ indicada en el panel C. Busque la tabla codificada para F/F₀. (F) Mapa espaciotemporal de transitorios de Ca²⁺ muestreados a partir de una célula GCaMP⁺ PDGFRα⁺ indicada en el panel D. Busque la tabla codificada para F/F₀. (G) Datos representativos para ca²⁺ frecuencia transitoria (Hz) para células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ y células GCaMP⁺ smMHC. (H) Datos representativos para Ca²⁺ de duración transitoria (s) para células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ y GCaMP⁺ células smMHC. Abreviaturas: PKJ = unión pélvico-renal; PDGFRα⁺ = receptor alfa-positivo del factor de crecimiento derivado de plaquetas; smMHC = cadena pesada de miosina del músculo liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Transitorios espontáneos de Ca²⁺ en células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ en secciones de vibratomo PKJ. Abreviaturas: PKJ = unión pélvico-renal; PDGFRα⁺ = receptor alfa-positivo del factor de crecimiento derivado de plaquetas. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar).)

Vídeo 2: Transitorios espontáneos de Ca²⁺ en GCaMP⁺ células del músculo liso en secciones vibratome de unión pélvico-renal. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar).)

Vídeo 3: Transitorios espontáneos de Ca²⁺ en células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ en secciones de vibratomo medular renal. Abreviatura: PDGFRα⁺ = receptor alfa positivo del factor de crecimiento derivado de plaquetas. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar).)

Vídeo 4: Actividad transitoria de Ca²⁺ de baja amplitud en las secciones vibratóme de la arteriola renal. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar).)

Discusión

El RP consiste en una población heterogénea de células con densidades celulares diferenciales observadas en varias regiones de RP. Los PIC1 (anteriormente denominados ASMCs) son más abundantes en el PKJ, donde se origina la actividad de marcapasos²⁴. El protocolo, descrito aquí, permite a los investigadores aislar la región del marcapasos del resto del riñón del ratón. Al cortar secciones de PKJ utilizando un vibratomo, las regiones de marcapasos de la RP (identificadas como bandas musculares unidas al parénquima) se mantienen intactas, lo que permite el uso de imágenes in situ para estudiar con precisión las células de marcapasos rp cuando se combinan con reporteros de fluorescencia específicos de la célula.

Si bien este enfoque puede proporcionar nuevos conocimientos sobre el marcapasos de RP, hay algunas consideraciones con las que los experimentadores deben estar familiarizados para mejorar los resultados de las imágenes y la eficiencia de la seccionamiento. Para un usuario no capacitado, este método de aislamiento e imágenes de PKJ es más fácil de aprender que la disección aguda típica de preparaciones de RP de hoja plana. La disección aguda de RP de riñones enteros requiere semanas de práctica constante para aislar con éxito los tejidos viables para experimentos de fisiología. Como este protocolo de seccionamiento del vibratomo requiere poco conocimiento de disección nítido, es accesible para los usuarios que no tienen experiencia en la disección de otras estructuras musculares lisas.

Sin embargo, hay algunos puntos críticos a tener en cuenta para este protocolo. Adherir con éxito los riñones a la placa de muestra de vibratome requiere destreza y paciencia. Si el riñón está orientado incorrectamente y se inclina hacia un lado, se cortarán secciones oblicuas en lugar de rectas. Debido a la naturaleza delicada del PKJ, el ángulo oblicuo a menudo puede destruir las bandas musculares de la región del marcapasos. Además, la obtención de imágenes de secciones oblicuas da como resultado una adquisición deficiente de imágenes, ya que las redes celulares no suelen estar en el mismo plano focal. El procedimiento también requiere mucho tiempo, y la seccionamiento de un solo riñón a menudo tarda hasta una hora en completarse, tiempo durante el cual la configuración requiere monitoreo.

Si bien el movimiento del vibratome se puede acelerar, si la velocidad aumenta demasiado (>20% de lo recomendado en el protocolo), la cuchilla se triturará en lugar de cortar limpiamente el riñón, lo que resultará en la pérdida de delicadas estructuras PKJ. Del mismo modo, una velocidad de corte demasiado baja puede hacer que la sección se vuelva irregular. La optimización de la velocidad de corte y la amplitud de la cuchilla es esencial. También se debe tener cuidado en el manejo de las secciones de vibratomo. Debido a su naturaleza delicada, los músculos PKJ se interrumpen fácilmente durante el manejo y pueden romperse. Un usuario bien entrenado podrá cosechar aproximadamente 1-2 regiones PKJ por 4 cortes de riñón que son adecuadas para experimentos de imágenes de Ca^{2 +.} Por lo general, las secciones de PKJ que no cumplen con los criterios de imágenes de Ca^{2 +} tienen: 1) una expresión deficiente de GCaMP, 2) una pared de PKJ contorsionada o 3) una pared de PKJ rota. Para el análisis de datos, se podrían muestrear aproximadamente 3-4 celdas por campo de visión (FOV).

Si bien hay muchas células en el FOV de las secciones PDGFRα-GCaMP6f y SMC-GCaMP3 PKJ, los movimientos tisulares pequeños a menudo excluyen las células del análisis. Esto generalmente se puede resolver aplicando un protocolo de estabilización a las imágenes. En condiciones en las que las preparaciones no se mueven, se pueden muestrear al menos 3-5 células de las secciones PDGFRα-GCaMP6f y 5-6 células de las secciones SMC-GCaMP3. Por lo general, el tiempo necesario desde el sacrificio de animales (la edad óptima para los ratones es de 8 a 16 semanas) hasta la realización de experimentos de imágenes de Ca 2⁺ es de 2-3 h, lo que es adecuado para garantizar la integridad del tejido, si los tejidos se incuban en soluciones heladas durante todo el procedimiento cuando sea necesario. En resumen, aquí se ha descrito un protocolo de corte de vibratomo para generar preparaciones intactas de regiones RP PKJ del riñón del ratón. Esta técnica permite la preservación de las regiones de marcapasos RP para estudios de imágenes in situ de Ca²⁺ para investigar los mecanismos de marcapasos RP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
placa de cultivo de 24 pocillos	ThermoFisher Scientific	142485	Para almacenar cortes de riñón en
placas de Petri de 35 mm x 10 mm	Sigma Aldrich	CLS430165	Placa de imágenes de calcio para cortes de riñón
de 48 pocillos	ThermoFisher Scientific	152640	Para almacenar cortes de riñón en
una placa de Petri de 60 mm x 15 mm	Sigma Aldrich	P5481	Placa de disección afilada de riñón
Papel absorbente	Fisher Scientific	06-666A	Para secar el riñón antes de aplicar el pegamento
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	El Laboratorio Jackson	13148	GCaMP3 Ratones
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	El Laboratorio Jackson	24105	GCaMP6f Ratones
B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	El Laboratorio Jackson	19079	smMHC-CRE Ratones
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	El Laboratorio Jackson	13148	PDGFRa-CRE Ratones
Pegamento de cianoacrilato	Amazon B001PILFVY		Para adherir el riñón a la placa de muestra
Etanol	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	Para la disección
Tijeras Bonn extrafinas	Fine Science Tools	14083-08	Se utiliza para tijeras de disección internas
Tijeras finas	Fine Science Tools	14060-09	Se utiliza para tijeras de disección externas
Pinzas de punta fina	Fine Science Tools	11254-20	Se utiliza para la disección fina de riñón
Gillette Silver Blue Cuchillas de doble filo	Amazon	B009XHQGYO	Para la inserción en el soporte de la cuchilla del vibratomo
ImageJ	NIH		Para el análisis de imágenes de calcio
Isoflurano	Baxter	NDC 1001936060	Para la anestesia
Pines de minutienas	Fisher Scientific NC9677548		Los pines se cortaron por la mitad para reducir su longitud
Elastómero de silicona	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
Student Adson Pinzas	Fine Science Tools	91106-12	Para sujetar y mover suavemente el riñón
Pinzas Dumont	para estudiantes Fine Science Tools	91150-20	Se utiliza para pinzas de disección internas
Tijeras de resorte Vannas	Fine Science Tools	15000-03	Para la disección y limpieza agudas de riñón aislado
Vibrocheck	Leica	14048142075	Componente opcional para calibrar el movimiento de la cuchilla durante el corte
VT1200 S Microtomo de cuchilla vibratoria	Leica	14912000001	Configuración 1 se utiliza en nuestro protocolo