El presente artículo detalla un protocolo paso a paso para electroantennogramas exitosos y de bajo ruido en varios géneros de mosquitos, incluyendo hembras y machos.
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Artículo de método
Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los mosquitos hembra son los animales más mortales de la tierra, cobrando la vida de más de 1 millón de personas cada año debido a los patógenos que transmiten al adquirir una harina de sangre. Para localizar un huésped del que alimentarse, los mosquitos dependen de una amplia gama de señales sensoriales, incluidas visuales, mecánicas, térmicas y olfativas. El estudio detalla una técnica, la electroantenografía (EAG), que permite a los investigadores evaluar si los mosquitos pueden detectar sustancias químicas individuales y mezclas de sustancias químicas de una manera dependiente de la concentración. Cuando se combina con cromatografía de gases (GC-EAG), esta técnica permite exponer las antenas a una mezcla completa de espacio de cabeza / complejo y determina qué productos químicos presentes en la muestra de interés, el mosquito puede detectar. Esto es aplicable a los olores corporales del huésped, así como a los ramos florales de plantas u otros olores ecológicamente relevantes (por ejemplo, odorantes de sitios de oviposición). Aquí, describimos un protocolo que permite largas duraciones de tiempo de respuesta de preparación y es aplicable tanto a mosquitos hembras como machos de múltiples géneros, incluidos los mosquitos Aedes, Culex, Anopheles y Toxorhynchites . Como el olfato juega un papel importante en las interacciones mosquito-huésped y la biología del mosquito en general, los EAG y GC-EAG pueden revelar compuestos de interés para el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores de enfermedades (por ejemplo, cebos). Complementado con ensayos de comportamiento, se puede determinar la valencia (por ejemplo, atrayente, repelente) de cada sustancia química.
Introducción
Los mosquitos son los organismos más mortales de la tierra, cobran la vida de más de un millón de personas por año y ponen a más de la mitad de la población mundial en riesgo de exposición a los patógenos que transmiten, mientras pican1. Estos insectos dependen de una amplia gama de señales (es decir, térmicas, visuales, mecánicas, olfativas, auditivas) para localizar un huésped del que alimentarse (tanto vegetal como animal), para aparearse y oviponerse, así como para evitar depredadores tanto en la etapa larvaria como en la adulta 2,3. Entre estos sentidos, el olfato juega un papel cr....
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Protocolo
1. Preparación de la solución salina
- Preparar la solución salina con antelación y guardar en la nevera.
- Siga a Beyenbach y Masia26 para preparar la solución.
NOTA: Receta salina en mM: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 glucosa, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl 2 y 1.0 MgCl2. El pH se ajusta a 7,1 con 1 M NaOH. No agregue glucosa o sacarosa a la preparación en este momento para aumentar el almacenamiento en el estante. Agregue la cantidad necesaria a la solución salina justo antes de ejecutar los EAG (alrededor de 50 ml por experimento).
2. Preparación y almacenamient....
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Resultados
La electroantennografía es una herramienta poderosa para determinar si una antena de insectos detecta un producto químico o una mezcla de productos químicos. También se puede utilizar para determinar el umbral de detección para una sustancia química determinada utilizando un aumento gradual de la concentración (es decir, respuesta de la curva de dosis, Figura 4B). Además, es útil probar los efectos del repelente en la respuesta a los olores relacionados con el huésped29
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Discusión
Los comportamientos mediados olfativos se ven afectados por muchos factores, incluidos los fisiológicos (por ejemplo, edad, hora del día) y ambientales (por ejemplo, temperatura, humedad relativa)30. Por lo tanto, al realizar EAGs, es esencial utilizar insectos que se encuentren en el mismo estado fisiológico (es decir, monitorear la edad, morir de hambre, aparearse)31 y también mantener un ambiente cálido y húmedo alrededor de la preparación para evitar la desecación. Una .......
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Agradezco al Dr. Clément Vinauger y al Dr. Jeffrey Riffell por sus útiles discusiones. Los siguientes reactivos se obtuvieron a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, contribución de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribución de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, cepa JHB, huevos, NR-43025. El autor agradece al Dr. Jake Tu, a la Dra. Nisha Duggal, al Dr. James Weger y a Jeffrey Marano por proporcionar huevos de mosquito Culex quinquefasciatus y Anopheles stephensi (cepa: Liston). Aedes albopictus y Toxorhynchites rutilus septentrionalis
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mesa de aire Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Reductor de ruido |
| Placa analógica a digital | National Instruments | BNC-2090A | |
| Flowbuddy de sobremesa Completo | Genesee Scientific | 59-122BC | Para anestesiar mosquitos |
| Capilar de vidrio de borosilicato | Instrumento | SutterB100-78-10 | Para realizar el registro y referencias capilares |
| Productos químicos | Sigma Aldrich | Benzaldehído: 418099-100 mL; Ácido butírico: B103500-100 ml; 1-Hexanol: 471402-100mL; Aceite mineral: M8410-1L | Productos químicos utilizados para los experimentos presentados aquí |
| CO2 | Airgas o Praxair | N/A | Para anestesiar mosquitos |
| Fuente de luz fría | Volpi | NCL-150 | |
| Jeringas desechables | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Cables de electrodos | World Precision Instruments | 5371 | |
| Gel de electrodos sin sal | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Jaula de Faraday | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Reductor de ruido |
| Caudalímetros | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | Uno de cada |
| vial y tapón GCMS | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | Para preparar diluciones de odorantes |
| Jeringas de vidrio (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | Para la entrega de olores a la preparación EAG |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Reductor de ruido |
| mm Soporte de gato, estrecho, 90 grados, con cable | Sistemas A-M | 675748 | Portaelectrodos |
| Bases magnéticas | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Para la entrega de los pulsos |
| Aire medicinal | Airgas o Praxair | N/A | Para las principales líneas aéreas |
| Microscopio | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipuladores Micromanipulador compacto grueso/fino de tres ejes | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Amplificador de microelectrodo con cabecera | Sistemas A-M | Modelo 1800 | |
| Suministros para la cría de mosquitos | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Agujas | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pipetas Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6A | Para la entrega de olores a la preparación EAG |
| Tubos de PTFE de diferentes diámetros | Mc Master Carr | N/A | Para conectar la válvula solenoide, caudalímetro, línea aérea, etc. |
| Fuente de alimentación de 30 V/5 A CC | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R versión 3.5.1 | R proyecto | https://www.r-project.org/ | Para análisis de datos |
| Relé para electroválvula | N/A | hecho | |
| 0.01" | A-M Systems | 782500 | |
| Válvula solenoide (3 vías) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| Software WinEDR | Software de electrofisiología Strathclyde | WinEDR V3.9.1 | Para grabación EAG |
| Papel Whatman | Cole Parmer | UX-06648-03 | Para cargar productos químicos en jeringa de vidrio / pipeta Pasteur |
Referencias
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes....
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Reimpresiones y permisos
