Describimos la ingeniería de una nueva ARN polimerasa T7 atada al ADN para regular las reacciones de transcripción in vitro. Discutimos los pasos para la síntesis y caracterización de proteínas, validamos la regulación transcripcional de prueba de concepto y discutimos sus aplicaciones en computación molecular, diagnóstico y procesamiento de información molecular.
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Artículo de método
ARN polimerasa atado al ADN para transcripción in vitro programable y computación molecular
En este artículo
Resumen
Resumen
La nanotecnología del ADN permite el autoensamblaje programable de ácidos nucleicos en formas y dinámicas prescritas por el usuario para diversas aplicaciones. Este trabajo demuestra que los conceptos de la nanotecnología del ADN se pueden utilizar para programar la actividad enzimática de la ARN polimerasa T7 derivada de fagos (RNAP) y construir redes reguladoras de genes sintéticos escalables. En primer lugar, un RNAP T7 atado a oligonucleótidos se diseña a través de la expresión de un RNAP marcado con SNAP N-terminal y el posterior acoplamiento químico de la etiqueta SNAP con un oligonucleótido modificado con bencilguanina (BG). A continuación, el desplazamiento de la hebra de ácido nucleico se utiliza para programar la transcripción de la polimerasa bajo demanda. Además, los conjuntos auxiliares de ácidos nucleicos se pueden utilizar como "factores de transcripción artificiales" para regular las interacciones entre el RNAP T7 programado por ADN con sus plantillas de ADN. Este mecanismo regulador de la transcripción in vitro puede implementar una variedad de comportamientos de circuitos como la lógica digital, la retroalimentación, la cascada y la multiplexación. La componibilidad de esta arquitectura reguladora de genes facilita la abstracción, estandarización y escalado del diseño. Estas características permitirán la creación rápida de prototipos de dispositivos genéticos in vitro para aplicaciones como la biodetección, la detección de enfermedades y el almacenamiento de datos.
Introducción
La computación del ADN utiliza un conjunto de oligonucleótidos diseñados como medio para el cálculo. Estos oligonucleótidos están programados con secuencias para ensamblarse dinámicamente de acuerdo con la lógica especificada por el usuario y responder a entradas específicas de ácido nucleico. En los estudios de prueba de concepto, la salida del cálculo generalmente consiste en un conjunto de oligonucleótidos marcados fluorescentemente que se pueden detectar a través de electroforesis en gel o lectores de placas de fluorescencia. En los últimos 30 años, se han demostrado circuitos computacionales de ADN cada vez más complejos, como varias cascadas de lógica digital, r....
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Protocolo
1. Preparación del búfer
NOTA: La preparación del tampón de purificación de proteínas puede ocurrir en cualquier día; aquí, se hizo antes de comenzar los experimentos.
- Preparar tampón de lisis/equilibrio que contenga 50 mM de tris(hidroximetil)aminometano (Tris), 300 mM de cloruro de sodio (NaCl), 5% de glicerol y 5 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH 8. Agregue 1.5 mL de 1M Tris, 1.8 mL de 5M NaCl, 1.5 mL de glicerol, 25.2 mL de agua desionizada (ddH2O) en un tubo de centrífuga de 50 mL, y agregue 10.5 μL de 14.2 M BME justo antes de su uso.
NOTA: Tris puede causar toxicidad aguda; por lo tanto, evite respirar su polvo....
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Resultados
Figura 5:Análisis SDS-PAGE de la expresión de SNAP T7 RNAP y ensayo de transcripción in vitro. (A) Análisis de purificación de proteínas SNAP T7 RNAP, snap T7 RNAP peso molecular: 119.4kDa. FT = flujo a través de la columna, W1 = fracciones de elución del tampón de lavado que contiene impurezas, E1-3 = fracciones de elución que contienen prod.......
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Discusión
Este estudio demuestra un enfoque inspirado en la nanotecnología del ADN para controlar la actividad de la ARN polimerasa T7 mediante el acoplamiento covalente de un RNAP T7 recombinante marcado con SNAP N-terminal con un oligonucleótido funcionalizado de BG, que posteriormente se utilizó para programar reacciones TMDSD. Por diseño, la etiqueta SNAP se colocó en el extremo N de la polimerasa, ya que el extremo C del ARNP T7 de tipo salvaje está enterrado dentro del núcleo de la estructura de la proteína y hace contactos .......
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Divulgaciones
No hay intereses financieros en competencia que declarar por ninguno de los autores.
Agradecimientos
L.Y.T.C reconoce el generoso apoyo de New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), la Beca discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Iniciativa de Medicina por Diseño de la Universidad de Toronto, que recibe fondos del Fondo de Excelencia en Investigación de Canadá First (CFREF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,5% polisorbato 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM tampón de fosfato de sodio (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Tabletas utilizadas para hacer tampón de 10 mM |
| persulfato de amonio al 10% (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 Centrífuga Unidad de filtro | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetona | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% etanol (EtOH) | Marca de la casa | 39752-P016-EAAN | |
| 10x tampón de transcripción in vitro (IVT) | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE) | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropil β- d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M tampón de bicarbonato sódico | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hidroximetil)aminometano (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tampón Tris-EDTA (TE) | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazol | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoetanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M acetato de sodio | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% acrilamida (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x tampón de carga de muestras de proteínas LDS | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M cloruro de sodio (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM ditiotreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x colorante de carga de gel | New England Biolabs | B7024S | |
| agarosa B polvo | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competente E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye escalera de proteínas preteñida | FroggaBio | PM007-0500 | |
| azul de bromofenol | Bio Basic | BDB0001 | |
| azul de coomassie (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| colorante de cianina (tinción de gel de ácido nucleico SYBR Gold) | Fisher Scientific | S11494 | |
| colorante de cianina (SYBR Safe tinción de gel de ácido nucleico SYBR) | Fisher Scientific | S33102 | |
| dimetilsulfóxido seco (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamida | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glicerol | Bio Basic | GB0232 | |
| sulfato de kanamicina | BioShop | KAN201.5 | |
| caldo de lisogénia | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| malaquita oxalato verde | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS tampón de funcionamiento (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12 pocillos | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleótido (antisentido de jaula) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleótido ( sentido de la jaula) | IDT | N/A | TCAGTCACCTCTCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleótido (antisentido del aptámero verde de malaquita) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCTCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleótido (sentido del aptámero verde de malaquita) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleótido (Factor de Transcripción A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucleótido (Factor de Transcripción B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTCTCTGGCGATAA |
| Oligonucleótido TGGAACTG con 3' Modificación de aminas (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce columnas de espín de intercambio iónico fuerte | Fisher Scientific | 90008 | |
| plásmido que codifica genes de resistencia a SNAP T7 RNAP y kanamicina | Genscript | N/A | inserción de genes personalizados |
| (columna de espín HisPur Ni-NTA) | Fisher Scientific | 88226 | |
| Mezcla rNTP | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini columna de centrifugado rápido de ADN | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Escalera de ADN de rango ultra bajo | Fisher Scientific | ||
| urea | BioShop | URE001.1 |
Referencias
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 4....
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Reimpresiones y permisos
