Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.
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Artículo de método
Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal
En este artículo
Resumen
Resumen
En el pasado, los sistemas de modelos epiteliales intestinales se limitaban a líneas celulares transformadas y tejido primario. Estos sistemas modelo tienen limitaciones inherentes ya que los primeros no representan fielmente la fisiología tisular original, y la disponibilidad de los segundos es limitada. Por lo tanto, su aplicación dificulta la investigación fundamental y de desarrollo de fármacos. Los organoides adultos basados en células madre (en adelante denominados organoides) son miniaturas de tejido epitelial normal o enfermo del que se derivan. Se pueden establecer de manera muy eficiente a partir de diferentes regiones del tracto gastrointestinal (GI), tienen capacidad de expansión a largo plazo y simulan respuestas específicas de tejidos y pacientes a los tratamientos in vitro. Aquí, se ha demostrado el establecimiento de monocapas epiteliales derivadas de organoides intestinales junto con métodos para medir la integridad de la barrera epitelial, la permeabilidad y el transporte, la secreción de proteínas antimicrobianas, así como la histología. Además, las monocapas derivadas de organoides intestinales pueden enriquecerse con células madre proliferantes y amplificadoras de tránsito, así como con células epiteliales diferenciadas clave. Por lo tanto, representan un sistema modelo que se puede adaptar para estudiar los efectos de los compuestos en las células diana y su modo de acción. Aunque los cultivos organoides son técnicamente más exigentes que las líneas celulares, una vez establecidos, pueden reducir los fallos en las últimas etapas del desarrollo de fármacos, ya que realmente representan la complejidad del epitelio in vivo y la heterogeneidad entre pacientes.
Introducción
El epitelio intestinal actúa como una barrera física entre el contenido luminal de los intestinos y el tejido subyacente. Esta barrera comprende una sola capa epitelial de enterocitos principalmente absorbentes que están conectados por uniones estrechas, que establecen fuertes conexiones intercelulares entre las células adyacentes. Estas células forman un revestimiento epitelial polarizado que separa los lados apical (lumen) y basolateral del intestino, al tiempo que regula el transporte paracelular de nutrientes y metabolitos digeridos. Además de los enterocitos, otras células epiteliales importantes como las células caliciformes, paneth y enteroendocrinas también co....
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Protocolo
1. Preparación de reactivos para el cultivo
NOTA: Realice todos los pasos dentro de un gabinete de bioseguridad y siga las pautas estándar para trabajar con cultivos celulares. La luz ultravioleta se utiliza durante 10 minutos antes de poner en marcha el gabinete de bioseguridad. Antes y después de su uso, la superficie del gabinete de bioseguridad se limpia con un papel de seda empapado en etanol al 70%. Para facilitar la formación de gotas tridimensionales de matriz extracelular (ECM), mantenga un stock precalentado de placas de 96, 24 y 6 pocillos listas en la incubadora a 37 ° C.
- Preparación del medio basal
- Prepare el ....
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Resultados
La Figura 1A muestra una imagen representativa de campo brillante de organoides intestinales después de descongelarlos de un criovial. Es importante descongelar los organoides a una alta densidad para garantizar una recuperación óptima. Los organoides están chapados en placas de 24 o 6 pocillos en domos ECM de aproximadamente 10 μL (Figura 1B). La mayoría de los organoides intestinales normales tienen una morfología quística. Después de recuperarse del proceso d.......
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Discusión
Este protocolo describe la manipulación general y el mantenimiento de los organoides intestinales, así como la preparación y posibles aplicaciones de monocapas epiteliales derivadas de estos organoides. Hasta la fecha, las monocapas se han preparado con éxito a partir del duodeno, el íleon y diferentes regiones de organoides del colon derivados del tejido intestinal normal y previamente inflamado (datos no publicados). La aplicación de monocapas organoides derivadas del paciente facilita el estudio de la función de barre.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) public-private partnerships (PPP) allowance of the Dutch LSH sector with Project number LSHM16021 Organoids as novel tool for toxicology modelling to Hubrecht Organoid Technology (HUB) and HUB internal funding to Disease Modeling and Toxicology department. Agradecemos a los laboratorios de Sabine Middendorp (División de Gastroenterología Pediátrica, Wilhelmina Children's Hospital, UMC, Utrecht) y Hugo R. de Jonge y Marcel J.C. Bijvelds (Departamento de Gastroenterología y Hepatología, Erasmus MC, Rotterdam) por proporcionar ap....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100% etanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300 y 20 µ L puntas de filtro de baja retención | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| Tubos cónicos de 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| placas de cultivo celular de 24 pocillos | Greiner bio-one | 662160 | |
| Placa de transpodura HTS Fluoroblok de 24 pocillos de 24 pocillos (hermética a la luz) | Corning | 351156 | |
| Placas de transpodura HTS de 24 pocillos (Tabla 1) | Corning | 3378 | |
| Placa de 24 pocillos con insertos Transwell | Corning | 3470 | |
| 40 y micro; filtro de células m | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| Tubos cónicos de 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| placas de cultivo celular de 6 pocillos | Greiner bio-one | 657160 | |
| Placa negra de 96 pocillos Fondo transparente | Greiner bio-one | 655090 | |
| Life Technologies Europe BV | 4346907 | ||
| Placa de transpocillos HTS Fluoroblok de 96 pocillos | Corning | 351162 | |
| Placas de pocillos HTS Transwell de 96 pocillos (Tabla 1) | Corning | 7369 | |
| Placa de cultivo transparente de 96 pocillos | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Reactivo de disociación celular Accutase | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Célula reactivo de disociación 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV 12634028 | ||
| B27 suplemento | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Microscopio de cultivo celular (microscopio óptico / óptico) | Centrífuga Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Eppendorf | |||
| Incubadora <>2 | CPCI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| con tratamiento DEPC H2O | Life Technologies Europe BV 750024 | ||
| salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco con Ca2+ y Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, polvo, sin calcio, sin magnesio | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Kit de ensayo de lisozima | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| Medidor EVOM2 con electrodo STX | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Pipetas de vidrio | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europa BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europa BV | 15630056 | |
| Noggin Humano | Peprotech | 120-10C | |
| Humano Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 anticuerpo primario | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 anticuerpo secundario | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide con rejillas de recuento | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Campana de flujo laminar | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH sal de dilitio | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, factor de crecimiento reducido ( GFR) | Corning | 356231 | matriz extracelular (ECM) |
| MicroAmp Fast Tira de 8 tubos, 0,1 mL | Life Technologies Europe BV 4358293 | ||
| MicroAmp Tiras ópticas de 8 tapones | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Tubos de microcentrífuga | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipetas (1000, 200 y 20 µ L) | Gilson | ||
| Microtomo | Leica | ||
| MUC2 anticuerpo primario | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 anticuerpo secundario | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Pipeta multicanal (200 µ L) | Gilson | ||
| N-acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleótido ALPI1 / Adelante | Hecho a medida | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleótido ALPI1 / Reverso | Hecho | a medidaCTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleótido LGR5/Adelante | Hecho a medida | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleótido LGR5/Reverso | Hecho a medida | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleótido MUC2/Adelante | Hecho a medida | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleótido MUC2/Reverso | Hecho a medida | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleótido TBP/Directo | Hecho a medida | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleótido TBP/Reverso | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | ||
| Cubiertas adhesivas ópticas | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies Europa BV | 15140122 | |
| Agitador de placas | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | formulación antimicrobiana para células primarias |
| Qubit RNA HS Kit de ensayo | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Depósito de reactivos para pipeta multicanal | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler con 24 sondas o sondas de 96C | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| Juego de DNasa sin RNasa | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Pipetas serológicas | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Pipeta serológica (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Cuchilla de afeitar de un solo filo | GEM Scientific | ||
| Superscript Sistema de 1ª hebra para RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Lector de placas Spark 10M | Tecan | ||
| Solución de Trypan Blue, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| Enzima TrypLE Express (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Reactivo de disociación celular 1 |
| baño de agua | Grant | ||
| Y27632 (inhibidor de ROCK) | AbMole | M1817 |
Referencias
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permea....
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Reimpresiones y permisos
