Un sistema de purificación de proteínas de alto rendimiento económico y versátil que utiliza un adaptador de placa multicolumna

Resumen

Un adaptador de placa multicolumna permite que las columnas de cromatografía se interconectan con placas de recolección de múltiples pozos para la afinidad paralela o la purificación del intercambio iónico, proporcionando un método económico de purificación de proteínas de alto rendimiento. Se puede utilizar bajo gravedad o vacío produciendo cantidades de miligramos de proteína a través de instrumentación asequible.

Resumen

La purificación de proteínas es imprescindible para el estudio de la estructura y función de las proteínas y generalmente se utiliza en combinación con técnicas biofísicas. También es un componente clave en el desarrollo de nuevas terapias. La era en evolución de la proteómica funcional está alimentando la demanda de purificación de proteínas de alto rendimiento y técnicas mejoradas para facilitar esto. Se planteó la hipótesis de que un adaptador de placa de múltiples columnas (MCPA) puede interconectar múltiples columnas de cromatografía de diferentes resinas con placas de múltiples pozos para la purificación paralela. Este método ofrece un método económico y versátil de purificación de proteínas que se puede utilizar bajo gravedad o vacío, rivalizando con la velocidad de un sistema automatizado. El MCPA se puede utilizar para recuperar los rendimientos de miligramos de proteína por un método asequible y eficiente en el tiempo para su posterior caracterización y análisis. El MCPA se ha utilizado para la purificación de afinidad de alto rendimiento de dominios SH3. El intercambio iónico también se ha demostrado a través del MCPA para purificar la proteína post Ni-NTA cromatografía de afinidad, lo que indica cómo este sistema se puede adaptar a otros tipos de purificación. Debido a su configuración con múltiples columnas, la personalización individual de los parámetros se puede hacer en la misma purificación, inalcanzable por los métodos basados en placas actuales.

Introducción

Las técnicas de purificación de proteínas para lograr cantidades de miligramos de proteínas purificadas son imprescindibles para su caracterización y análisis, especialmente para métodos biofísicos como la RMN. La purificación de proteínas también es fundamental en otras áreas de estudio, como los procesos de descubrimiento de fármacos y los estudios de interacción proteína-proteína; sin embargo, alcanzar tales cantidades de proteína pura puede convertirse en un cuello de botella para estas técnicas^1,2,3. El método principal para la purificación de proteínas es la cromatograf....

Protocolo

1. Cromatografía de Ni-NTA desnaturalizante

1. Preparación de búferes
   Nota : consulte la tabla 1 para obtener detalles de todos los búferes.
   1. Ensañe 500 mL de NaOH de 0,5 M, asegurándose de añadir primero el agua Milli-Q y luego añadiendo el NaOH lentamente mientras el casto está en un agitador. Filtre utilizando un filtro de 0,22 μm.
   2. Preparar 100 mL de sulfato de níquel de 0,1 M y filtrar utilizando un filtro de 0,22 μm.
   3. Preparar 50 mL de imidazol de 2 M y filtrar con un filtro de 0,22 μm.
   4. Preparar y 0,22 μm de filtro 1,5 L de tampón desnaturalizante a pH 8,0 consistente en 5,3 mM de ....

Resultados

Como ejemplo, el MCPA ha purificado con éxito 14 mutantes AbpSH3 en condiciones de desnaturalización a través de Ni-NTA (Figura 2A). Un pequeño contaminante ~ 25 kDa se puede ver, sin embargo, la proteína sigue siendo en gran parte pura. Se cree que este contaminante es YodA, una proteína co-purificada común que se encuentra en E. coli^11. La Figura 2B muestra la purificación de 11 dominios SH3 diferentes en condiciones n.......

Discusión

El método es robusto y fácil de usar para bioquímicos de proteínas relativamente inexpertos, sin embargo, hay algunas consideraciones a tener en cuenta.

Precaución sobre el sobrellenado de placas de recogida

La placa de recolección de 48 pozos en sí solo tiene 5 mL por pozo, mientras que cada 96 pozos solo tiene 2 mL. Esto debe tenerse en cuenta al agregar el búfer y ejecutar la muestra a través de la columna, ya que existe el riesgo de llenar en ex.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2 mL/ placa colectora de pocillos	Agilent technologies	201240-100
5 mL/ placa colectora de pocillos	Agilent technologies	201238-100
Columnas de cromatografía de 12 mL	Bio-Rad	7311550
placa de goteo de 96 pocillos largos	Agilent technologies	200919-100	Viene con filtros de mmm de 0,25 que se deben quitar.
Sellado/estera de placa de 96 pocillos	Agilent technologies	201158-100	Debe ser peirceable
Resina His60 Ni Superflow	Takara Bio	635660
HiTrap Q Columna de intercambio aniónico HP	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lector de placas Lvis	BMG LABTECH		Compatible con el lector de placas FLUOstar Omega
Tapones leur macho	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep Colector de vacío de 96 pocillos Kit de inicio	Sigma-Aldrich	575650-U
Placa de recogida de depósito	Agilent technologies	201244-100
El repetidor Plus	Eppendorf	2226020	Con jeringas de 5 mL y 50 mL
Vacío VACUSAFE	INTEGRA	158 320	El aspirador vacusafe tiene un rango de vacío de 300 mBar a 600 mBar y una botella de recogida de residuos de 4 L