Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.
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Artículo de método
Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los avances recientes en la investigación del cáncer han ilustrado la naturaleza altamente compleja de la metástasis del cáncer. Se ha encontrado que múltiples genes o redes de genes están involucrados en la regulación diferencial de los genes en cascada metastásicos del cáncer y los productos genéticos que dependen del tipo de cáncer, el tejido y las características individuales del paciente. Estos representan objetivos potencialmente importantes para la terapéutica genética y los enfoques de medicina personalizada. El desarrollo de plataformas de detección rápida es esencial para la identificación de estas dianas genéticas.
La membrana corioalantoica (CAM) del pollito es una membrana altamente vascularizada y rica en colágeno ubicada debajo de la cáscara del huevo que permite el intercambio de gases en el embrión en desarrollo. Debido a la ubicación y vascularización del CAM, lo desarrollamos como un modelo de metástasis de cáncer humano intravital que permite un xenoinjerto robusto de células cancerosas humanas e imágenes en tiempo real de las interacciones de las células cancerosas con la matriz y la vasculatura ricas en colágeno.
Utilizando este modelo, se diseñó una plataforma de cribado cuantitativo para la identificación de nuevos impulsores o supresores de la metástasis del cáncer. Transducimos un grupo de células cancerosas HEp3 de cabeza y cuello con una biblioteca completa de genes shRNA del genoma humano, luego inyectamos las células, a baja densidad, en la vasculatura CAM. Las células proliferaron y formaron colonias de células tumorales únicas. Las colonias individuales que no pudieron invadir el tejido CAM fueron visibles como un fenotipo de colonia compacta y extirpadas para la identificación del SHRNA transducido presente en las células. Las imágenes de colonias individuales fueron evaluadas por su invasividad. Se realizaron múltiples rondas de selecciones para disminuir la tasa de falsos positivos. Los clones de células cancerosas individuales y aisladas o los clones recién diseñados que expresan genes de interés se sometieron a un ensayo de formación de tumores primarios o a un análisis de cooptación de la vasculatura de células cancerosas. En resumen presentamos una plataforma de cribado rápido que permite la identificación de dianas antitastásicas y el análisis intravital de una cascada dinámica y compleja de eventos.
Introducción
La metástasis es la principal causa de muerte de pacientes con cáncer1,2,3. Las células cancerosas metastásicas utilizan distintas vías de señalización, dependiendo del tipo de cáncer, a lo largo de los cinco pasos de la cascada metastásica: invasión local, intravasación, supervivencia en la circulación, extravasación y expansión de colonias en sitios metastásicos distantes. La comprensión actual de este proceso metastásico sugiere que hay dos pasos de cuello de botella, uno es la invasión direccional de la célula cancerosa desde el tumor primario, y el segundo es el establec....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las regulaciones y directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Alberta. Los embriones aviares no son considerados animales vivos por muchos institutos de investigación y no se requieren protocolos animales. Sin embargo, es una opinión aceptada que los embriones aviares pueden sentir dolor y, por lo tanto, deben ser tratados de la manera más humana posible. Se debe contactar a la autoridad local de investigación con animales antes de comenzar cualquier trabajo de investigación para garantizar que se sigan las regulaciones adecuadas.
1. Cultivo de hue....
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Resultados
La inyección de células cancerosas se considera exitosa si la mayoría de las células que se alojan en los capilares son únicas y se encuentran en una diferencia significativa entre sí (~ 0.05-0.1 cm) para que las colonias no se superpongan después de 5-6 días de período de incubación(Figura 3A). La inyección no tuvo éxito si se puede ver una acumulación de células cancerosas en la mayoría de los capilares, los embriones que muestran esto deben descartarse
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Discusión
Aquí describimos un protocolo de detección intravital basado en microscopía de fluorescencia rápida que se puede utilizar para aplicaciones importantes, como pruebas genéticas o candidatas a fármacos. Las células cancerosas que han sido transducidas con una biblioteca genética de interés o transfectadas con construcciones de expresión individual pueden ser rápidamente examinadas y cuantificadas en cuanto al fenotipo de interés utilizando este modelo CAM de pollitos. Dado que los protocolos de transducción o transfección .......
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Divulgaciones
Nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención del Instituto de Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer #702849 a JDL y KS. El Dr. Lewis ocupa la Cátedra Frank y Carla Sojonky en Investigación del Cáncer de Próstata con el apoyo de la Fundación del Cáncer de Alberta.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringas desechables BD | BD309659 | ||
| 15 mL tubos centrífugos cónicos. | Corning | CLS430791-500EA calibre | |
| 18 x 1 1/2 Aguja de precisión | BD BD | BD305196 | usamos 1.2 mm x 40 mm, es posible usar agujas más cortas si se prefiere |
| la solución de tripsina al 2.5%, | muchas fuentes están disponibles | ||
| 4T1 cáncer de mama en ratón | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 línea celular de melanoma de ratón | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrífuga de sobremesa. | Hay muchas fuentes disponibles | Cualquier centrífuga compatible con TC que se pueda utilizar para centrifugar las celdas es adecuada | |
| Cubreobjetos circulares, 22 mm. | Microscopio | ||
| Collagenasa | Sigma | C0130-100MG | |
| hisopos de algodón | fuentes están disponibles | Debe ser esterilizado antes de usar | |
| 10% FBS | |||
| media Incubadora de huevos | hay muchas fuentes disponibles | Un modelo exacto que es necesario depende de la escala de la pantalla. Las fuentes disponibles son MGF Company Inc., Savannah, GA, o Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| tubos de eppendor, 1,5 ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Huevos fertilizados de Leghorn blanco | proveedor | ||
| pinzas finas | muchas fuentes están disponibles | deben esterilizarse antes de su uso | |
| Hemocitómetro | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 línea celular de fibrosarcoma humano | ATCC | CCL-121 | |
| Software | Utilizamos Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Aglutinina (LCA) conjugada con Fluoresceína o Rodamina | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Culata diluida (5mg/ml) 50-100x dependiendo de la sensibilidad del microscopio. Debe ser de un color diferente al color de la línea celular utilizada para la detección |
| MDA-MB-468 cáncer de mama humano | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | hay muchas fuentes disponibles | ||
| Platos de pesaje de plástico | Simport | CA11006-614 | son 78x78x25 mm; muchas otras fuentes están disponibles |
| : tijeras quirúrgicas pequeñas | hay muchas fuentes disponibles | deben esterilizarse antes de su uso | |
| Tubos capilares de vidrio de borosilicato de sodio, diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,58 mm, 10 cm de longitud | Instrumento Sutter | BF100-58-10 | |
| Placas de Petri cuadradas (utilizadas como tapas para los platos de pesaje). | VWR | CA25378-115 | Las dimensiones son 100x100x15mm; hay muchas otras fuentes disponibles |
| Microscopio fluorescente estereoscópico | Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 de diámetro interior, 3/32 pulg. de diámetro exterior, 1/32 pulg. de espesor de pared |
| U-118 MG glioblastoma humano ATCC | HTB-15 | ||
| U-87 MG glioblastoma humano | ATCC | HTB-14 | |
| Extractor de pipetas vertical | hay muchas fuentes disponibles | , utilizamos David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Modelo 720 |
Referencias
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R.
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Reimpresiones y permisos
