Method Article

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

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1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

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Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Abstract

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La somitogénesis es un sello distintivo del desarrollo embrionario de vertebrados. Durante años, los investigadores han estado estudiando este proceso en una variedad de organismos utilizando una amplia gama de técnicas que abarcan enfoques ex vivo e in vitro. Sin embargo, la mayoría de los estudios aún se basan en el análisis de datos de imágenes bidimensionales (2D), lo que limita la evaluación adecuada de un proceso de desarrollo como la extensión axial y la somitogénesis que involucra interacciones altamente dinámicas en un espacio 3D complejo. Aquí describimos técnicas que permiten la adquisición de imágenes en vivo con ratones, el procesamiento de conjuntos de datos, la visualización y el análisis en 3D y 4D para estudiar las células (por ejemplo, progenitores neuromesodérmicos) involucradas en estos procesos de desarrollo. También proporcionamos un protocolo paso a paso para la tomografía de proyección óptica y la microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo en embriones de ratón (desde la preparación de la muestra hasta la adquisición de imágenes) y mostramos una tubería que desarrollamos para procesar y visualizar datos de imágenes 3D. Ampliamos el uso de algunas de estas técnicas y destacamos las características específicas de diferentes software disponibles (por ejemplo, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que se pueden utilizar para mejorar nuestra comprensión actual de la extensión axial y la formación de somita (por ejemplo, reconstrucciones 3D). En conjunto, las técnicas aquí descritas enfatizan la importancia de la visualización y el análisis de datos 3D en la biología del desarrollo, y podrían ayudar a otros investigadores a abordar mejor los datos de imágenes 3D y 4D en el contexto de la extensión y segmentación axial de vertebrados. Finalmente, el trabajo también emplea herramientas novedosas para facilitar la enseñanza del desarrollo embrionario de vertebrados.

Introduction

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La formación del eje del cuerpo de los vertebrados es un proceso altamente complejo y dinámico que ocurre durante el desarrollo embrionario. Al final de la gastrulación [en el ratón, alrededor del día embrionario (E) 8.0], un grupo de células progenitoras de epiblastos conocidas como progenitores neuromesodérmicos (NMP) se convierten en un impulsor clave de la extensión axial en una secuencia de cabeza a cola, generando el tubo neural y los tejidos mesodérmicos paraxiales durante la formación del cuello, el tronco y la cola 1,2,3,4 . Curios....

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Protocol

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Los experimentos con animales siguieron las legislaciones portuguesa (Portaria 1005/92) y europea (Directiva 2010/63 / UE) sobre vivienda, cría y bienestar. El proyecto fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Instituto Gulbenkian de Ciência y por la Entidad Nacional Portuguesa, "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (referencia de la licencia: 014308).

1. Preparación de muestras para imágenes 3D y 4D

NOTA: Aquí proporcionamos una descripción detallada sobre cómo diseccionar y preparar embriones de ratón E8.25 a E10.5 para imágenes vivas (1.1), embriones E7.5 a E11.5 para microscopía de inmunofluor....

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Results

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Los resultados representativos mostrados en este trabajo tanto para la imagen viva como para la inmunofluorescencia, se obtuvieron utilizando un sistema de dos fotones, con un objetivo de agua de 20 × 1.0 NA, el láser de excitación sintonizado a 960 nm y fotodetectores GaAsP (como se describe en Dias et al. (2020)43. La tomografía de proyección óptica se realizó utilizando un escáner OPenT personalizado (como se describe en Gualda et al. (2013)28.

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Discussion

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La elongación axial y la segmentación son dos de los procesos más complejos y dinámicos que ocurren durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. El uso de imágenes 3D y 4D con seguimiento unicelular se ha aplicado, desde hace algún tiempo, para estudiar estos procesos tanto en embriones de pez cebra como de pollo, para lo cual la accesibilidad y las condiciones de cultivo facilitan la obtención de imágenes complejas 19,44,45,46,47,48,49

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Disclosures

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Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgements

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Nos gustaría agradecer a Olivier Pourquié y Alexander Aulehla por la cepa reportera LuVeLu, al laboratorio SunJin para la muestra de prueba RapiClear, a Hugo Pereira por la ayuda utilizando BigStitcher, a Nuno Granjeiro por ayudar a configurar el aparato de imágenes en vivo, a la instalación de animales IGC y a los miembros pasados y presentes del laboratorio Mallo por sus útiles comentarios y apoyo durante el curso de este trabajo.

Agradecemos el apoyo técnico del Advanced Imaging Facility del CIG, que cuenta con el apoyo de la financiación portuguesa ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 y ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanciada por el P....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarosa a baja temperatura de gelificaciónSigmaA9414Utilizada para el montaje de embriones (por ejemplo, para OPT)
Software AmiraHerramienta de software Thermofisher-Commerial
Anti-Brachyury (Policlonal de cabra)Sistemas R y DAF2085 RRID:AB_2200235Para inmunofluorescencia
Anti-Sox2 (Monoclonal de conejo)Abcamab92494 RRID:AB_10585428Para inmunofluorescencia
Anti-Tbx6 (policlonal de cabra)Sistemas R y DAF4744 RRID:AB_2200834Para inmunofluorescencia
Anti-Laminina111 (Policlonal de conejo)SigmaL9393 RRID:AB_477163Para inmunofluorescencia
Anti-cabra 488 (policlonal de burro)Sondas molecularesA11055 RRID:AB_2534102Para inmunofluorescencia
Anti-conejo 568 (Policlonal de burro)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017Para inmunofluorescencia
Alcohol bencílico (99 + %)(cualquiera)-Utilizado para limpiar embriones (componente de BABB)
Benzoato de bencilo (99 + %)(cualquiera)-Utilizado para eliminar embriones (componente de BABB)
Albúmina sérica bovinaBiowestP6154Para inmunofluorescencia
Cubreobjetos 20x20 mm # 0(cualquiera)-Cubreobjetos de 100um de espesor
20x20 mm #1cualquiera)-170um de espesor
Cubertor de 20x60 mm #1.5cualquiera)-Para usar como " diapositivas"
DAPI (4',6-Diamidino-2-Diclorhidrato de Fenilindol)Life TechnologiesD3571Para inmunofluorescencia
Drishti software(código abierto)-Herramienta de software
libre EDTASigmaED2SSPara desmineralización
Fiji/ImageJ software(código abierto)-Herramienta de software libre
GlycineNZYtechMB01401Para el software de inmunofluorescencia
HuygensScientific Volume Imaging-Herramientade software comercial
HyClone suero bovino fetal definidoHealthcare#HYCLSH30070.03Para imágenes en vivo
Solución de peróxido de hidrógeno 30 %Milipore1085971000Para la limpieza
software ImarisBitplane / Oxford instruments-Herramienta de software comercial
iSpacersSunJin Lab(varía)Uso como espaciadores para preparaciones
L-glutaminaGibco#25030– 024Para medio de imagen en vivo
DMEM de baja glucosaGibco 11054020Para medio de imagen en vivo
M2 Medio SigmaM7167Para diseccionar embriones
MetanolVWRVWRC20847.307Para las etapas de deshidratación y rehidratación
Salicilato de metiloSigmaM6752Se utiliza para aclarar embriones
ParaformaldehídoSigmaP6148Se utiliza en solución para fijar embriones
Penicilina-estreptomicinaSigma#P0781Para medio de imagen en vivo
PBS (solución salina tamponada con fosfato)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52Se utiliza para aclarar embriones
Cámaras de hibridación Secure-SeaSigmaC5474Uso como espaciadores para preparaciones
simLab softwareSimLabsoft-Commerial herramienta de software
Portaobjetos, depresión cóncava vidrio - 75x25 mm(cualquiera)-Para montar embriones gruesos.
Triton X-100SigmaT8787para inmunofluorescencia
(( GE del

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

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Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

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