Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Summary

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Abstract

El desarrollo adecuado del cerebro de los mamíferos se basa en un fino equilibrio de proliferación de células madre neurales y diferenciación en diferentes tipos de células neuronales. Este equilibrio está estrictamente controlado por la expresión génica que está afinada en múltiples niveles, incluyendo transcripción, post-transcripción y traducción. En este sentido, un creciente cuerpo de evidencia destaca un papel crítico de la regulación traslacional en la coordinación de las decisiones sobre el destino de las células madre neurales. El fraccionamiento de polisomas es una poderosa herramienta para la evaluación del estado traslacional del ARNM tanto a nivel global como individual. Aquí, presentamos una tubería interna de perfiles de polisoma para evaluar la eficiencia traslacional en las células de la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Describimos los protocolos para la preparación del gradiente de sacarosa, lisis tisular, ultracentrifugación y análisis basado en fraccionamientos del estado traslacional del ARNm.

Introduction

Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, las células madre neurales proliferan y se diferencian para generar neuronas y glia^1,2. La perturbación de este proceso puede conducir a alteraciones en la estructura y función cerebral, como se ve en muchos trastornos del neurodesarrollo^3,4. El comportamiento adecuado de las células madre neurales requiere la expresión orquestada de genes específicos^5. Si bien el control epigenético y transcripcional de estos genes ha sido estudiado intensamente, hallazgos recientes sugieren q....

Protocol

Todo el uso de animales fue supervisado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Calgary. Los ratones CD1 utilizados para el experimento fueron comprados al proveedor comercial.

1. Preparación de soluciones

NOTA Para evitar la degradación del ARN, rocíe la mesa de trabajo y todos los equipos con solución de descontaminación RNase. Los consejos sin RNase se utilizan para el experimento. Todas las soluciones se preparan en agua sin RNase.

1. Preparar solución de material de cicloheximida (100 mg/ml) en DMSO y almacenar a -20 °C.
2. Prepare la solución de caldo de sacarosa de 2,2 M añadiend....

Results

Como demostración, el lisato cortical que contenía 75 μg de ARN (agrupado de 8 embriones) fue separado por el gradiente de sacarosa en 12 fracciones. Picos de absorbancia UV a 254 nm identificaron fracciones que contienen el subunidad 40S, subunidad 60S, monosoma 80S y polisomas (Figura 4A). Análisis de fracciones por mancha occidental para la gran subunidad ribosomal, Rpl10 mostró su presencia en la subunidad 60S (fracción 3), monosoma (fracción 4) y polisomas (fracciones 5-12) (

Discussion

El perfilado de polisomas es una técnica comúnmente utilizada y potente para evaluar el estado traslacional en niveles únicos de genes y de todo el genoma^14. En este informe, presentamos un protocolo de perfilado de polisoma utilizando una plataforma montada en casa y su aplicación para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Esta plataforma rentable es fácil de montar y generar gradientes de sacarosa robustos y reproducibles y perfiles de polisoma con alta sensibilidad.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL microtubos sin ARN	Axygen	MCT-150-C
Plato de 10 cm	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G	aguja BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL jeringa	BD	302832
Extremo romo aguja	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Azul de bromofenol	Sigma	115-39-9
	CD1	Charles River Laboratory
Pinzas de punta curva	Sigma	#Z168785
Cicloheximida	Sigma	66-81-9 Software de adquisición de
datos TracerDAQ	Computación de medición Convertidor
		Computación de medición	USB-1208LS
Kit de minipreparación de ARN Direct-zol	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Pinzas Dumont No.5	Sigma	#F6521
Colector de fracciones	Bio-Rad	Modelo 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Actuador de etapa lineal	Rattmmotor	CBX1605-100A
ARN de control de luciferasa	Promega	L4561
Maxima kit de síntesis de ADNc de primera cadena	Themo Fisher	M1681
Abrazadera en V en miniatura	Thorlabs	VH1/M
Mini-series Breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series poste óptico	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series Base de soporte de poste de pedestal	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Medios neurobasales	Gibco	21103-049
Ø Poste de aluminio de 12,7 mm	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR verde fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Abrazadera de ángulo recto	Thorlabs	RA90/M
Ángulo recto y Oslash; 1/2" a Ø Abrazadera de poste de 6 mm	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
Puntas sin RNasa	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
Agua sin RNasa		Wisent 809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Soporte de ángulo recto delgado	Thorlabs	AB90B/M
Abrazadera en V pequeña	Thorlabs	VC1/M
Desoxicolato de sodio	Sigma	302-95-4
Controlador de motor paso a paso	SongHe	TB6600
Sacarosa	Bioshop	57501
SW 41 Rotor Ti	Beckman Coulter	331362
Bomba de jeringa	Harvard Apparatus	70-4500
Bomba de jeringa	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Perforadora de tubos	Brandel	BR-184
Ultracentrífuga		Beckman Coulter	L8-70M
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
monitor UV	Bio-Rad	EM-1 Econo
Soporte vertical	Thorlabs	VB01A/M