Generación eficiente y escalable de astrocitos ventrales mesencéfalos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Resumen

Aquí, presentamos un método para la generación reproducible de astrocitos ventrales con patrón de mesencéfalo a partir de hiPSCs y protocolos para su caracterización para evaluar el fenotipo y la función.

Resumen

En la enfermedad de Parkinson, la disfunción progresiva y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo ventral causan síntomas que cambian la vida. La degeneración neuronal tiene diversas causas en el Parkinson, incluyendo mecanismos autónomos no celulares mediados por astrocitos. En todo el SNC, los astrocitos son esenciales para la supervivencia y la función neuronal, ya que mantienen la homeostasis metabólica en el entorno neuronal. Los astrocitos interactúan con las células inmunitarias del SNC, la microglía, para modular la neuroinflamación, que se observa desde las etapas más tempranas del Parkinson, y tiene un impacto directo en la progresión de su patología. En las enfermedades con un elemento neuroinflamatorio crónico, como el Parkinson, los astrocitos adquieren un fenotipo neurotóxico y, por lo tanto, potencian la neurodegeneración. En consecuencia, los astrocitos son un objetivo terapéutico potencial para retrasar o detener la enfermedad, pero esto requerirá una comprensión más profunda de sus propiedades y funciones en el Parkinson. Por lo tanto, se necesitan con urgencia modelos precisos de astrocitos ventrales mesencéfalos humanos para su estudio in vitro.

Hemos desarrollado un protocolo para generar cultivos de alta pureza de astrocitos ventrales específicos del mesencéfalo (vmAstros) a partir de hiPSCs que pueden ser utilizados para la investigación del Parkinson. Los vmAstros se pueden producir de forma rutinaria a partir de múltiples líneas hiPSC y expresan marcadores astrocíticos y ventrales específicos del mesencéfalo. Este protocolo es escalable y, por lo tanto, adecuado para aplicaciones de alto rendimiento, incluido el cribado de fármacos. De manera crucial, los vmAstros derivados de hiPSC demuestran características inmunomoduladoras típicas de sus contrapartes in vivo, lo que permite estudios mecanicistas de la señalización neuroinflamatoria en el Parkinson.

Introducción

La enfermedad de Parkinson afecta al 2%-3% de las personas mayores de 65 años, lo que la convierte en el trastorno neurodegenerativo del movimiento más prevalente¹. Es causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas ventrales del mesencéfalo dentro de la sustancia negra, lo que resulta en síntomas motores debilitantes, así como problemas cognitivos y psiquiátricos^frecuentes. La patología de Parkinson se caracteriza por agregados de la proteína, α-sinucleína, que son tóxicos para las neuronas y provocan su disfunción y muerte ^1,2,3

Protocolo

1. Descongelación, mantenimiento y criopreservación de la línea hiPSC humana

1. Para recubrir placas de cultivo de hiPSC, diluya la vitronectina a 5 μg/mL (1:100) en PBS a 1 mL por cada placa de cultivo celular de 10^cm2 de superficie de superficie. Dejar actuar 1 h a temperatura ambiente.
2. Retire la vitronectina y proceda inmediatamente a añadir hiPSCs/medios a la placa de cultivo.
   NOTA Al retirar la vitronectina de la placa, es crucial que no se permita que la superficie de cultivo se seque.
3. Para descongelar las hiPSC, retire los crioviales que contienen hiPSC del nitrógeno líquido y colóquel....

Resultados

Metodología de diferenciación y progresión
En este trabajo se presenta el detalle tanto de los métodos empleados para la generación de vmAstros como de los protocolos utilizados para su posterior caracterización fenotípica. El método para la generación de vmAstros se compone de varias etapas de diferenciación distintas, que pueden ser monitoreadas por microscopía e identificando características morfológicas distintas (Figura 1A-F). Un cul.......

Discusión

Este método para la generación de vmAstros a partir de hiPSCs es altamente eficiente, generando cultivos puros de vmAstros, y siendo reproducible para la generación de vmAstros a partir de diferentes líneas de hiPSCs. Este protocolo se desarrolló en torno a la recapitulación de los eventos de desarrollo necesarios en el embrión para modelar correctamente el mesencéfalo en desarrollo y generar astrocitos y comprende tres etapas definidas: 1) inducción neural ventral del mesencéfalo para g.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
0,2M Tris-Cl (pH 8,5)	n/a	n/a	Compuesto por Tris base y más HCl
0,5M EDTA, PH 8	ThermoFisher	15575-020	1:1000 en D-PBS a 0,5 mM final
1,4-diazabicilo[2.2.2]octano (DABCO)	Sigma	D27802-	25 mg/mL en solución de montaje Mowiol
cubreobjetos de 13 mm	VWR	631-0149
2-Mercaptoetanol (50 mM)	ThermoFisher	31350010
Accutase	ThermoFisher	13151014
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634010	Tiene 1x NEAA pero añadimos a la concentración final de 2x (0,2 mM)
Ácido ascórbico	Sigma	A5960	Stock de 200 mM, 1:1000 a 200 y micro; M final
B27 Suplemento	ThermoFisher	17504-044	50x stock
BSA	Sigma	5470
Medios de congelación celular	Sigma	C2874	Cryostor CS10
Recipiente de congelación celular	Nalgene	5100-0001
CHIR99021	Axon Medchem	1386	0,8 mM stock, dilución 1:1000 a 0,8 y micro; M
final Crioviales	Sigma	CLS430487
DAPI	Sigma	D9542	1 mg/mL, 1:10.000 a 100ng/mL final (en PBS)
DMEM/F12 + Glutamax	ThermoFisher	10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS sin Mg ni Ca)	ThermoFisher	14190144	pH 7,2
E8 Kit	Flex ThermoFisher A2858501
Formaldehído (solución al 36%)	Sigma	47608
Geltrex	ThermoFisher	A1413302	1:100 o 1:400 en stock frío DMEM/F12
Glutamax	ThermoFisher	35050038	2 mM (1:200 en N2B27, 1:100 en medios ASTRO a 20 &; M final)
Glicerol	Sigma	G5516
BDNF Humano	Peprotech	450-02	20 y micro; g/mL de culata, 1:1000 a 20 ng/mL final
Human BMP4	Peprotech	120-05	20 µ g/mL de caldo, 1:1000 a 20 ng/mL final
EGF humano	Peprotech	AF-100-15	20 y micro; g/mL de caldo, 1:1000 a 20 ng/mL final
GDNF humano	Peprotech	450-10	20 y micro; g/mL de stock, 1:1000 a 20 ng/mL de solución final de
insulina humana	Sigma	I9278	10 mg/mL de culata, 1:2000 a 5 y micro; g/mL final
LIF humano	Peprotech	300-05	20 µ g/mL de stock, 1:1000 a 20 ng/mL final
IL-6 ELISA kit	Biotechne	DY206
Isopropanol	Sigma	I9516-4L	Para llenar el recipiente de almacenamiento criogénico Mr Frosty
LDN193189	Sigma	SML0559	100 y micro; Culata M, dilución 1:10.000 a 10 nM final
Mowiol 40-88	Sigma	324590
N2 Suplemento	ThermoFisher	17502048	100x
Culata NEAA	ThermoFisher	11140035	10 mM, 1:100 a 0,1 mM final
Medios neurobasales	ThermoFisher	21103049
Suero de cabra normal	Vector Labs	S-1000-20
Revitacell	ThermoFisher A2644501		100x stock, 1:100 a 1x
final SB431542	Tocris	1614	10 mM stock, dilución 1:1000 a 10 µ M final
SHH-C24ii	Biotechne	1845-SH-025	200 µ g/mL de caldo, 1:1000 a 200 ng/mL final
Tris-HCl	Sigma	PHG0002
Triton-X	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P7949
Vitronectina	ThermoFisher	A14700	1:50 en D-PBS
Anticuerpos fuertes > para inmunocitoquímica	Company	>Número de catálogo	Especie huésped
Anticuerpo contra el ratón S100b	Sigma	SAB4200671	; 1:200
Anticuerpo contra el ratón FOXA2	SCBT	NB600501	; 1:50
Anticuerpo contra el conejo LMX1A	ProSci	7087	; 1:300
Anticuerpo contra LMX1A	Millipore	AB10533	conejo; 1:2000
Anticuerpo contra LMX1B	Proteintech	18278-1-AP	Conejo; 1:300
Anticuerpo contra GLAST	Proteintech	20785-1-AP	Conejo; 1:300
Anticuerpo contra GFAP	Dako	Z0334	Conejo; 1:400
Anticuerpo contra CD49f	Proteintech	27189-1-AP	Conejo; 1:100
Anticuerpo contra MSI1	Abcam	ab52865	Conejo; 1:400
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Conejo	ThermoFisher	A32731	Cabra; 1:500
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón	ThermoFisher	A32723	Cabra; 1:500
Alexa Fluor 568 Cabra Anti-Conejo	ThermoFisher	A11036	Cabra; 1:500
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón	ThermoFisher	A11031	Cabra; 1:500

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