Artículo de método

Generación eficiente y escalable de astrocitos ventrales mesencéfalos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

DOI:

10.3791/62095

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2 de octubre de 2021

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1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un método para la generación reproducible de astrocitos ventrales con patrón de mesencéfalo a partir de hiPSCs y protocolos para su caracterización para evaluar el fenotipo y la función.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la enfermedad de Parkinson, la disfunción progresiva y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo ventral causan síntomas que cambian la vida. La degeneración neuronal tiene diversas causas en el Parkinson, incluyendo mecanismos autónomos no celulares mediados por astrocitos. En todo el SNC, los astrocitos son esenciales para la supervivencia y la función neuronal, ya que mantienen la homeostasis metabólica en el entorno neuronal. Los astrocitos interactúan con las células inmunitarias del SNC, la microglía, para modular la neuroinflamación, que se observa desde las etapas más tempranas del Parkinson, y tiene un impacto directo en la progresión de su patología. En las enfermedades con un elemento neuroinflamatorio crónico, como el Parkinson, los astrocitos adquieren un fenotipo neurotóxico y, por lo tanto, potencian la neurodegeneración. En consecuencia, los astrocitos son un objetivo terapéutico potencial para retrasar o detener la enfermedad, pero esto requerirá una comprensión más profunda de sus propiedades y funciones en el Parkinson. Por lo tanto, se necesitan con urgencia modelos precisos de astrocitos ventrales mesencéfalos humanos para su estudio in vitro.

Hemos desarrollado un protocolo para generar cultivos de alta pureza de astrocitos ventrales específicos del mesencéfalo (vmAstros) a partir de hiPSCs que pueden ser utilizados para la investigación del Parkinson. Los vmAstros se pueden producir de forma rutinaria a partir de múltiples líneas hiPSC y expresan marcadores astrocíticos y ventrales específicos del mesencéfalo. Este protocolo es escalable y, por lo tanto, adecuado para aplicaciones de alto rendimiento, incluido el cribado de fármacos. De manera crucial, los vmAstros derivados de hiPSC demuestran características inmunomoduladoras típicas de sus contrapartes in vivo, lo que permite estudios mecanicistas de la señalización neuroinflamatoria en el Parkinson.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de Parkinson afecta al 2%-3% de las personas mayores de 65 años, lo que la convierte en el trastorno neurodegenerativo del movimiento más prevalente1. Es causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas ventrales del mesencéfalo dentro de la sustancia negra, lo que resulta en síntomas motores debilitantes, así como problemas cognitivos y psiquiátricosfrecuentes. La patología de Parkinson se caracteriza por agregados de la proteína, α-sinucleína, que son tóxicos para las neuronas y provocan su disfunción y muerte 1,2,3. Dado que las neuronas dopaminérgicas son la población degenerada en el Parkinson, históricamente fueron el foco de la investigación. Sin embargo, es evidente que otro tipo de célula en el cerebro, los astrocitos, también muestran anormalidades en el Parkinson, y se cree que contribuyen a la degeneración en modelos de Parkinson 4,5,6,7.

Los astrocitos son una población celular heterogénea que puede transformarse tanto física como funcionalmente según sea necesario. Apoyan la función neuronal y la salud a través de una gran cantidad de mecanismos, incluida la modulación de la señalización neuronal, la conformación de la arquitectura sináptica y el apoyo trófico de las poblaciones neuronales a través de la secreción de factores específicos 6,8,9,10. Sin embargo, los astrocitos también tienen un papel inmunomodulador sustancial, integral para el desarrollo y la propagación de la neuroinflamación10,11. La neuroinflamación se observa en el cerebro de los pacientes con Parkinson y, significativamente, recientemente se ha demostrado que previene la aparición de los síntomas del Parkinson 12,13,14,15, ocupando así un lugar central en la investigación del Parkinson.

A nivel celular, se dice que los astrocitos se vuelven reactivos en respuesta a una lesión, infección o enfermedad, en un intento de facilitar la neuroprotección 9,6,10,16. La reactividad describe un cambio en el fenotipo de los astrocitos caracterizado por cambios en la expresión génica, el secretoma, la morfología y los mecanismos de eliminación de restos celulares y subproductos tóxicos 9,10,11,17. Este cambio reactivo se produce en respuesta a las señales inductivas de la microglía, que son las células inmunitarias del SNC y las primeras en responder a las lesionesy enfermedades. Tanto los astrocitos como la microglía responden a las señales inflamatorias moderando su propia función y pueden transducir señales inflamatorias y, por lo tanto, influir directamente en la neuroinflamación 9,10. Sin embargo, la naturaleza crónica del Parkinson da lugar a una transición en la que los astrocitos reactivos se vuelven tóxicos para las neuronas y promueven la degeneración y la patología de la enfermedad 6,9,10,18,19. Significativamente, recientemente se demostró que el bloqueo de la transformación de los astrocitos en el fenotipo neurotóxico reactivo previene la progresión del Parkinson en modelos animales11. Por lo tanto, la reactividad de los astrocitos en el paradigma de la neuroinflamación se ha convertido en un foco importante de la investigación del Parkinson y, de manera similar, se relaciona con un amplio espectro de enfermedades del SNC. En conjunto, estos hallazgos construyen una imagen de la participación astrocítica significativa en la etiología del Parkinson, lo que enfatiza la necesidad de modelos de investigación precisos que recapitulen el fenotipo de las poblaciones de astrocitos humanos que están involucradas en el Parkinson.

En el cerebro embrionario, las neuronas aparecen primero, con el linaje astroglial, es decir, los astrocitos y los oligodendrocitos, apareciendo más tarde en el desarrollo6. Los estudios in vivo e in vitro han puesto de manifiesto una serie de vías de señalización que parecen controlar la potencia de las células progenitoras neurales, desde los derivados neuronales hasta los astrogliales. En particular, la señalización de JAK/STAT, EGF y BMP desempeña un papel en la proliferación, diferenciación y maduración de la astroglía20,21. Estas vías han sido el foco de los protocolos in vitro para la generación de astrocitos a partir de células pluripotentes, incluyendo hiPSC 6,22,23. Ha habido muchos ejemplos exitosos de generación de astrocitos a partir de hiPSCs 6,24,25. Sin embargo, es evidente que los astrocitos in vivo en el SNC poseen identidades regionales específicas, que se relacionan directamente con su función, de acuerdo con los requisitos específicos de esos astrocitos en relación con sus vecinos neuronales especializados 17,24,25,26. Por ejemplo, en relación específicamente con el mesencéfalo ventral, se ha demostrado que los astrocitos en esta región expresan conjuntos específicos de proteínas, incluidos los receptores de dopamina, lo que permite la comunicación con la población local de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo26. Además, los astrocitos ventrales del mesencéfalo muestran propiedades de señalización únicas26. Por lo tanto, para estudiar el papel de los astrocitos ventrales del mesencéfalo en el Parkinson, necesitamos un modelo in vitro que refleje su conjunto único de características.

Para abordar esto, hemos desarrollado un protocolo para generar astrocitos ventrales del mesencéfalo (vmAstros) a partir de hiPSCs. Los vmAstros resultantes exhiben características de sus homólogos ventrales del mesencéfalo in vivo, como la expresión de proteínas específicas, así como funciones inmunomoduladoras. Los resultados presentados provienen de la diferenciación de las líneas hiPSC NAS2 y AST23, que fueron derivadas y regaladas por el Dr. Tilo Kunath27. NAS2 se generó a partir de un sujeto de control sano, mientras que AST23 se deriva de un paciente con Parkinson portador de una triplicación en el locus que codifica la α-sinucleína (SNCA). Estas líneas de hiPSC han sido previamente caracterizadas y utilizadas en una serie de trabajos de investigación publicados, incluso para la generación de varios tipos de células neuronales 27,28,29,30,31.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Descongelación, mantenimiento y criopreservación de la línea hiPSC humana

  1. Para recubrir placas de cultivo de hiPSC, diluya la vitronectina a 5 μg/mL (1:100) en PBS a 1 mL por cada placa de cultivo celular de 10cm2 de superficie de superficie. Dejar actuar 1 h a temperatura ambiente.
  2. Retire la vitronectina y proceda inmediatamente a añadir hiPSCs/medios a la placa de cultivo.
    NOTA Al retirar la vitronectina de la placa, es crucial que no se permita que la superficie de cultivo se seque.
  3. Para descongelar las hiPSC, retire los crioviales que contienen hiPSC del nitrógeno líquido y colóquelos en un baño de agua a 37 °C hasta que el contenido se haya descongelado por completo.
  4. Prepare 9 mL de medio de cultivo celular precalentado (por ejemplo, E8 o E8 Flex) que contenga 1x suplemento celular (por ejemplo, Revitacell). Agregue 1 mL gota a gota al contenido del criovial. Coloque los 8 mL restantes en un tubo de centrífuga de 15 mL y a esto agregue el contenido diluido del criovial.
    ATENCIÓN: No triture el contenido.
  5. Centrifugar a 150 x g durante 3 min. Aspire el líquido sin alterar el pellet celular y vuelva a suspenderlo en un volumen adecuado de medio de cultivo celular (por ejemplo, E8 o E8 Flex) que contenga 1x suplemento celular (por ejemplo, Revitacell). Por ejemplo, 2 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos.
  6. Añada las hiPSC resuspendidas a las placas recubiertas de vitronectina y colóquelas en una incubadora a 37 °C/5% de CO2 .
    NOTA: las hiPSC deben comenzar a adherirse a los artículos de plástico recubiertos de vitronectina en 30 min-2 h después de la descongelación.
  7. Mantenga las hiPSC en un medio de cultivo celular (por ejemplo, E8 o E8 Flex). Alimenta las células diariamente mediante el intercambio de medios. Siempre precaliente los medios de cultivo durante 30 minutos antes de alimentarlos.
    NOTA Si se utiliza E8 Flex, los hiPSC no requieren cambios de medio cada 24 h y los incrementos de alimentación se pueden extender a 48 h, si es necesario. Los medios E8 Flex o E8 producen cultivos hiPSC de igual alta calidad. Las HiPSCs deben cultivarse durante un mínimo de 14 días después de la descongelación y antes de comenzar los pasos de diferenciación. Los períodos de cultivo de menos de 14 días parecen tener un impacto negativo en la supervivencia de las hiPSC durante el período de diferenciación inicial. HiPSCs de paso a aproximadamente el 80% de confluencia (Figura 1A: intervalo de paso de 3-4 días).
  8. 1 h antes de comenzar, añada 1x suplemento celular (p. ej., Revitacell) al cultivo de hiPSC.
  9. Lave las hiPSC una vez con PBS (sin calcio ni magnesio) y añada 0,5 mM de EDTA (diluido del stock en PBS sin calcio ni magnesio).
  10. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente, o hasta que las hiPSC comiencen a desprenderse entre sí y adquieran una apariencia más redondeada, con los límites de cada iPSC apareciendo más brillantes bajo un microscopio de campo claro.
  11. Añada 200 μL de EDTA en una zona focalizada de las hiPSC con una pipeta. Si se desprenden fácilmente, dejando un espacio libre en la capa celular, entonces están listos para ser cosechados. Si no se desprenden fácilmente, déjelo en EDTA y repita después de 1 min.
  12. Cuando esté listo para continuar, retire suavemente el EDTA y, con una pipeta, lave suavemente las hiPSC dos veces con medio de cultivo celular (por ejemplo, E8 o E8 Flex).
    NOTA: Para lograr esto sin que las hiPSC se desprendan, incline la placa y agregue el medio gota a gota por el costado de la placa de cultivo.
  13. Para cosechar hiPSCs, use 1 mL de medio de cultivo celular (por ejemplo, E8 o E8 Flex) que contenga 1x suplemento celular (por ejemplo, Revitacell). Suelte el medio directamente sobre la capa hiPSC y las celdas deberían desprenderse. Si es necesario, repita con otro medio de 1 mL.
  14. Vea las hiPSC bajo el microscopio. Idealmente, las hiPSC deberían aparecer en grupos relativamente uniformes, como se muestra en la Figura 1B. Si los grupos de hiPSC son mucho más grandes, o de tamaño muy variable, utilice la pipeta para romper los grupos de hiPSC más grandes (Figura 1B).
    NOTA: No triture en exceso las hiPSC. Aunque el suplemento aumenta la supervivencia celular general, la sobretrituración tiene un impacto negativo en la supervivencia del cultivo de hiPSC. Se recomiendan de 1 a 4 pasadas con una pipeta.
  15. Con una pipeta serológica, transfiera la suspensión de hiPSC a una placa recubierta de vitronectina como se preparó en el paso 1.1. Vuelva a colocar el cultivo de hiPSC en la incubadora deCO2 a 37 °C/5 %.
    NOTA: Criopreservar hiPSCs con aproximadamente un 80% de confluencia.
  16. 1 h antes de comenzar, añada 1x suplemento celular (p. ej., Revitacell) al cultivo de hiPSC.
  17. Separe las hiPSC de las placas de cultivo utilizando 0,5 mM de EDTA como se describe en el paso 1.4, recolectando células en un medio de cultivo celular (p. ej., E8 o E8 Flex) que contenga 1x suplemento celular (p. ej., Revitacell). Centrifugar a 150 x g durante 3 min.
  18. Vuelva a suspender las hiPSC peletizadas en medios de congelación celular (consulte la tabla de materiales). Utilice 700 μL por área de cultivo de 10cm2 , lo que equivale a 1 criovial de células por pocillo de una placa de 6 pocillos.
  19. Transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular apropiado (para obtener más detalles, consulte la Tabla de materiales).
  20. Transfiera el recipiente de congelación a un congelador de -80 °C durante 24 h. Después de 24 h, los crioviales pueden transferirse a nitrógeno líquido (-196 °C) para su almacenamiento a largo plazo.

2. Protocolo de diferenciación vmAstro

NOTA: En la Figura 1A se muestra un resumen esquemático del protocolo de diferenciación vmAstros. En la Tabla 1 se ofrece una lista detallada de los reactivos necesarios para el protocolo y su preparación.

  1. Inducción de vmNPCs
    NOTA: Este protocolo se ha optimizado para comenzar con un mínimo con 1x pocillo de una placa de 6 pocillos (10 cm2) de hiPSCs 70%-80% de confluencia, que es aproximadamente 4-5 x 104 células/cm2 (Figura 1B)30. El número y la densidad de células iniciales deben optimizarse para cada línea de hiPSC, ya que afecta significativamente la supervivencia y la eficiencia de diferenciación.
    1. Retire el medio de cultivo celular de las hiPSC y lave 3 veces en DMEM/F12 + glutamax. Reemplace el medio con un medio de inducción vmNPC de 2 ml (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH (C24ii) + LDN193189. Consulte la Tabla 1 para obtener detalles sobre la preparación de medios y reactivos).
    2. Alimente en días alternos con un medio cambio de medio medio después de las 24 h y un cambio completo de medio a las 48 h.
      NOTA: Después de 3-4 días, la cultura vmNPC requerirá aprobación. Se recomienda una relación de paso estándar de 1:3 o 1:4, que debe optimizarse para cada línea hiPSC utilizada.
    3. 1 h antes de la pasada, agregue 1x suplemento celular (p. ej., Revitacell) a las vmNPC y prepare 1x plástico de cultivo de tejidos recubierto de matriz de membrana basal (p. ej., Geltrex) (sección 2.2 Preparación de la matriz de membrana basal y plástico de cultivo de reposición de recubrimiento).
    4. Retire los medios de los vmNPC y lávelos 2 veces con D-PBS. Agregue 1 mL de solución de desprendimiento de células precalentada (por ejemplo, Accutase) por cada 10cm2 de área de cultivo (1 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos).
    5. Colóquelo a 37 °C durante 1 minuto y, a continuación, examine las vmNPC con un microscopio de contraste de fase.
      NOTA: Los vmNPC comenzarán a redondearse, sus procesos se retraerán y aparecerán espacios en la capa de celdas. Esto puede tardar de 1 a 3 minutos, dependiendo de la densidad de las células.
    6. Cuando los vmNPC adquieran esta apariencia, agregue 100 μL de solución de desprendimiento de células (por ejemplo, Accutase) a la capa de vmNPC.
      NOTA: Si los vmNPCs están listos para separarse, aparecerá un agujero en la capa de la celda. Si esto no sucede, entonces los vmNPC requieren una incubación adicional con una solución de desprendimiento de celdas.
    7. Si los vmNPC se desconectan fácilmente, retire suavemente la solución de desprendimiento de celdas y lave los vmNPC 2 veces con medios N2B27. Agregue el medio N2B27 suavemente por el costado del pocillo o recipiente de cultivo y revuelva suavemente para lavar, asegurándose de que los vmNPC no se desprendan.
      NOTA: Este paso debe completarse rápidamente para garantizar que los vmNPC no se vuelvan a conectar a la superficie de la celda. Si los vmNPC comienzan a desprenderse en los pasos de lavado, recoja mediante centrifugación a 150 x g durante 3 min. Los vmNPC no se centrifugan como estándar al pasar, ya que esto puede reducir su supervivencia.
    8. Por último, elimine las vmNPC con una pipeta, expulsando enérgicamente el medio de inducción de vmNPC que contenga 1x suplemento celular (por ejemplo, Revitacell) directamente sobre la capa celular. Esto debería eliminar los vmNPC, que luego se pueden transferir directamente a los nuevos recipientes de cultivo recubiertos de matriz.
      NOTA: No reutilice los medios que ya contienen vmNPC resuspendidos para eliminar más células, ya que esto resultará en su sobretrituración, lo que reduce su supervivencia.
    9. Reemplace en la incubadora de 37 °C/5% CO2 . Los vmNPC deben comenzar a adherirse a la superficie recubierta de matriz después de 20-30 minutos. Reemplace la mitad del medio con un medio de inducción vmNPC nuevo (sin suplemento celular) después de 24 h y continúe el programa de alimentación como antes.
    10. Continuar con el régimen de alimentación y paso durante 10 días.
  2. Preparación de la matriz de la membrana basal y recubrimiento de plástico de cultivo de tejidos
    NOTA: Para el mantenimiento de los vmNPC, se utiliza 1 matriz de membrana basal (por ejemplo, Geltrex) para recubrir artículos de plástico. Para el mantenimiento de vmAPC o vmAstros, se puede utilizar una matriz de membrana basal de 0,25x.
    1. Retire el caldo de la matriz de membrana basal de un congelador a -80 °C y colóquelo en un refrigerador a 4 °C durante la noche para descongelar.
    2. Diluir 1:10 con DMEM/F12 + glutamax helado, alícuota y almacenar a -80 °C como un caldo 10x.
    3. Al recubrir material de plástico, diluya este stock 10x a 1x (para vmNPCs) o 0.25x (para vmAPCs o vmAstros) con DMEM/F12 + glutamax helado.
    4. Agregue inmediatamente al plástico del cultivo de tejidos a 1 mL por 10 cm2, por ejemplo, 1 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos.
    5. Colocar a 37 °C durante 1 h. La solución de matriz de membrana basal no debe retirarse de los materiales de plástico hasta que esté lista para agregar medios/celdas para garantizar que los materiales de plástico recubiertos no se sequen. Las placas recubiertas de matriz no requieren lavado antes de agregar celdas.
  3. Expansión de vmNPCs
    1. En el día 10 del protocolo, reemplace el medio de inducción con el medio de expansión vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + ácido ascórbico. Consulte la Tabla 1 para obtener detalles sobre la preparación de medios y reactivos).
      NOTA: Los vmNPC no requieren la adición de mitógenos para inducir la proliferación. El BDNF, el GDNF y el ácido ascórbico favorecen la supervivencia y el mantenimiento de los vmNPC30.
    2. Alimente en días alternos con un medio cambio de medio medio después de las 24 h y un cambio completo de medio a las 48 h.
      NOTA: Después de 3-4 días, la cultura vmNPC requerirá aprobación. Para el paso, se recomienda una relación de paso estándar de 1:3 o 1:4 (esto debe optimizarse para cada línea hiPSC utilizada. Determine la proporción que proporciona la mejor supervivencia, proliferación y generación de vmNPC).
    3. 1 h antes del paso, agregue 1x suplemento de células (por ejemplo, Revitacell) a los vmNPCs, y prepare 1x placas/matraces recubiertos de matriz con anticipación (sección 2.2 Preparación de la matriz de la membrana basal y el plástico de cultivo de reposición de recubrimiento). Precaliente la solución de desprendimiento de celda (por ejemplo, Accutase) a 37 °C. Precaliente el medio de expansión vmNPC fresco que contiene 1x suplemento de celda (por ejemplo, Revitacell).
    4. Retire los medios de los vmNPC y lávelos 2 veces con D-PBS. Agregue 1 mL de solución de desprendimiento de células (p. ej., Accutase) por cada 10cm2 de área de cultivo (1 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos). Colóquelo a 37 °C durante 1 minuto y, a continuación, examine las vmNPC con un microscopio de contraste de fase.
      NOTA: Los vmNPC comenzarán a redondearse, sus procesos se retraerán y aparecerán espacios en la capa de celdas. Esto puede tardar de 1 a 3 minutos, dependiendo de la densidad de la celda.
    5. Cuando las vmNPC adquieran una apariencia redondeada, agregue 100 μL de solución de desprendimiento de células (por ejemplo, Accutase) a la capa de vmNPC.
      NOTA: Si los vmNPCs están listos para separarse, aparecerá un agujero en la capa de la celda. Si esto no sucede, entonces los vmNPC requieren una incubación adicional con la solución de desprendimiento de celdas.
    6. Si los vmNPC se desconectan fácilmente, retire suavemente la solución de desconexión de celdas y lave los vmNPC 2 veces con medios N2B27. Agregue el medio N2B27 suavemente por el costado del pocillo o recipiente de cultivo y revuelva suavemente para lavar, asegurándose de que los vmNPC no se desprendan.
      NOTA: Si los vmNPC comienzan a desprenderse en grandes cantidades en los pasos de lavado, recoja mediante centrifugación a 150 x g durante 3 min. Los vmNPC no se centrifugan como estándar al pasar, ya que esto puede reducir su supervivencia. Este paso debe completarse rápidamente para garantizar que los vmNPC no se vuelvan a conectar a la superficie de la celda.
    7. Retire los vmNPC con una pipeta y expulse enérgicamente el medio de expansión vmNPC que contenga 1x suplemento de células (por ejemplo, Revitacell) directamente sobre la capa de células. Esto debería eliminar las vmNPC, que luego se pueden transferir directamente a las placas/matraces recubiertos de matriz prepreparados (consulte la sección 2.2 'Preparación de la matriz de membrana basal y recubrimiento del plástico de cultivo de tejidos').
      NOTA: No reutilice los medios que ya contienen vmNPC resuspendidos para eliminar más células, ya que esto resultará en su sobretrituración, lo que reduce su supervivencia.
    8. Reemplace en la incubadora de 37 °C/5% CO2 . Los vmNPC deberían comenzar a adherirse a la superficie recubierta de matriz después de 20-30 minutos. Después de 24 h, reemplace la mitad del medio de cultivo con un medio de expansión vmNPC fresco (sin suplemento celular) y continúe con el programa de alimentación anterior.
    9. Continúe con este régimen de alimentación y paso durante 10 días. Los vmNPC se pueden expandir hasta el día 50.
  4. Diferenciación y expansión de vmAPCs
    NOTA: los vmNPC se pueden utilizar con éxito para la generación de vmAPCs/vmAstros en cualquier momento entre 30 y 50 días desde la etapa inicial de hiPSC (Figura 1A).
    1. Tome una cultura vmNPC confluente y lave los vmNPC 3 veces en DMEM/F12 avanzado para eliminar los rastros de los componentes de los medios de expansión de vmNPC. Sustituya el soporte por un medio de expansión vmAPC (ASTRO media +EGF +LIF. Consulte la Tabla 1 para obtener detalles sobre la preparación de medios y reactivos).
    2. Después de 72 h de paso, la cultura vmNPC está en una proporción alta (1:7.5). Por ejemplo, suponiendo que los vmNPC se mantuvieron en un solo pocillo de una placa de 6 pocillos, ahora deberían pasarse a un matraz de 75 cm 2 recubierto de matriz 1x( recubierto como se describe en la sección 2.2 'Preparación de la matriz de membrana basal y recubrimiento de plástico de cultivo de tejidos'). Paso utilizando la solución de desprendimiento de células, como se describe para vmNPCs en la sección 2.3 'Expansión de vmNPCs'.
    3. Vuelva a suspender los vmNPC en un volumen adecuado de medios de expansión vmAPC (7,5-15 ml de medios por matraz de75 cm2 . Cambios de medios completos cada 3 días, o según lo requieran las celdas.
      NOTA: A partir de este momento, los vmNPC se denominan vmAPC y deben pasarse como células individuales en lugar de grupos de células. Las vmAPC deben pasar cada 3-7 días o a medida que se vuelven confluentes para evitar que sean demasiado confluentes. A partir de este punto, la concentración reducida de la matriz 0,25x debe utilizarse para recubrir los artículos de plástico (como se describe en la sección 2.2 Preparación de la matriz de la membrana basal y recubrimiento del plástico de cultivo de tejidos).
    4. Expandir las vmAPCs hasta que alcancen el día 90 (desde la etapa hiPSC), criopreservando vmAPCs en varios puntos de su expansión.
  5. Generación de vmAstros maduros a partir de vmAPCs
    NOTA: En esta etapa, los vmAPC se pueden cultivar en matraces de cultivo detejidos de 175 cm2 . Esto puede ampliarse para la generación de un gran número de vmAstros maduros.
    1. Cuando los vmAPC alcancen el 80% de confluencia, lávelos 3 veces con medios ASTRO y reemplácelos con medios de maduración vmAstros (medios ASTRO + BMP4 + LIF. Consulte la Tabla 1 para obtener detalles sobre la preparación de medios y reactivos).
    2. Realice un cambio completo de medios cada 3 días, o según lo requieran las celdas, durante 10 días.
      NOTA: a) En este punto, la caracterización indica que los vmAstros están maduros, lo que se confirma mediante inmunocitoquímica (Figura 2G - I) y mediante análisis de expresión génica (manuscrito en preparación). b) Los vmAstros utilizados inmediatamente después de la maduración deben volver a colocarse en una superficie recubierta de matriz recién preparada. El mantenimiento de vmAPC o vmAstros en la misma superficie de cultivo durante más de 14 días podría dar lugar a cultivos subóptimos, en los que las células comienzan a reducir de tamaño e incluso a desprenderse. c) Para aplicaciones que examinan la modulación neuroinflamatoria, BMP y LIF se eliminan 72 h antes de la estimulación neuroinflamatoria. Esto es para evitar cualquier interacción potencial entre la señalización de BMP/LIF y la señalización neuroinflamatoria inducida.
    3. En la actualidad, los vmAstros pueden replatearse para ensayos experimentales, por ejemplo, en cubreobjetos para inmunocitoquímica o criopreservarse para futuras aplicaciones (secciones 3 y 4).
      NOTA: El paso no debería ser necesario en esta etapa del protocolo, ya que la proliferación solo debería ocurrir a una tasa muy baja. Las vmAPCs con placas demasiado densas en esta etapa mantienen niveles más altos de proliferación. Si este es el caso, el paso y la división de las celdas para lograr una densidad como se muestra en la Figura 1F.

3. Criopreservación de vmNPCs, vmAPCs y vmAstros

NOTA: Criopreservar vmNPCs/vmAPCs/vmAstros en plena confluencia.

  1. 1 h antes de comenzar, agregue 1x suplemento celular (por ejemplo, Revitacell) al cultivo. Llene el recipiente de crioalmacenamiento (consulte la tabla de materiales) con isopropanol a temperatura ambiente.
  2. Separe las células de las placas de cultivo utilizando una solución de desprendimiento de células como se describió anteriormente, recogiendo las células en los medios apropiados (medios N2B27 o ASTRO) que contengan 1x suplemento celular (por ejemplo, Revitacell). Centrifugar a 150 x g durante 3 min.
  3. Vuelva a suspender los volúmenes de vmNPCs/vmAPCs/vmAstros peletizados en medios de congelación de celdas (consulte la Tabla de materiales) de la siguiente manera (pasos 3.3.1. - 3.3.3.)
    1. Para vmNPCs: use 700 μL por 10 cm2 de área de cultivo, en 1 criovial.
    2. Para vmAPCs: utilizar 700 μL por cada 60cm2 de área de cultivo, en 1 criovial (aproximadamente 1/3 de un matraz de cultivo T175).
    3. Para vmAstros: resuspender en un medio de 2 mL y contar el número de vmAstros. Vuelva a centrifugar y resuspender en medios de congelación celular (consulte la Tabla de materiales) a un número por criovial apropiado para aplicaciones futuras. Suponiendo una pérdida celular aproximada del 15% debido a la congelación-descongelación, los vmAstros recién descongelados se cuentan y se siembran con un número de células en exceso del 15% para compensar la muerte celular en el proceso de congelación-descongelación. Esto equivale, por tanto, a 74.750 vmAstros porcm2. Los vmAstros descongelados se mantienen durante 72 h en medios ASTRO antes del ensayo.
  4. Transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular (para obtener más detalles, consulte la Tabla de materiales) y transfiera el recipiente de congelación a un congelador de -80 °C durante 24 h. Después de 24 h, los crioviales pueden transferirse a nitrógeno líquido (-196 °C) para su almacenamiento a largo plazo.

4. Caracterización del fenotipo vmAstro

  1. Inmunocitoquímica
    1. Coloque 100-200 cubreobjetos de vidrio de 13 mm en placas de Petri de vidrio sobre una capa de papel de filtro y esterilícelos en un autoclave seco.
    2. Transfiera los cubreobjetos a pocillos de placas de 4 o 24 pocillos con pinzas estériles. Añadir 1 solución de matriz (p. ej., Geltrex) en los cubreobjetos en forma de gotas de 50 μL e incubar a 37 °C durante 1 h.
    3. Paso o descongelación de vmAstros, resuspender en medios ASTRO y realizar un recuento. Placa vmAstros a 25-100.000 células por cubreobjetos en una gota de 50 μL.
    4. Retire la matriz del cubreobjetos e inmediatamente agregue vmAstros en una gota de medio. Colóquelo a 37 °C durante 30 min y luego inunde los pocillos con 250 μL adicionales de medio ASTRO.
      NOTA: Si se lleva a cabo la inmunocitoquímica para verificar simplemente la expresión de marcadores de astrocitos y mesencéfalo, vmAstros se puede fijar 24 h después de la siembra.
    5. Prepare la solución de formaldehído al 4% diluyendo la solución de formaldehído al 36% 1:9 en D-PBS.
    6. Lave vmAstros 1x con D-PBS. Agregue inmediatamente un 4% de formaldehído a los pocillos y déjelos a temperatura ambiente durante 10 min.
    7. Retire el formaldehído y reemplácelo con D-PBS. Almacenar a 4 °C o proceder a la inmunocitoquímica.
    8. Lave los cubreobjetos en los pozos 3 veces con D-PBS. Permeabilizar y bloquear en 10% suero de cabra, 1% BSA en 0,1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) durante 1 h a temperatura ambiente.
    9. Añadir anticuerpos primarios (Tabla de Materiales) en suero de cabra al 1%, BSA al 0,1% en PBTx al 0,1% (D-PBS + 1:1000 Triton-X) e incubar durante la noche a 4 °C en un balancín.
    10. Al día siguiente, retire los anticuerpos primarios y lave los cubreobjetos 3 veces con D-PBS.
    11. Añadir anticuerpos secundarios apropiados (Tabla de Materiales) en suero de cabra al 1%, BSA al 0,1% en PBTx al 0,1%, e incubar durante 1-2 h a temperatura ambiente y protegerlo de la luz en un balancín. Lave los cubreobjetos 3 veces con D-PBS.
    12. Añadir solución de DAPI (0,1 μg/mL de DAPI en D-PBS) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Lave los cubreobjetos 3 veces con D-PBS.
    13. Para montar el cubreobjetos, añada una gota de 5 μL de medio de montaje Mowiol/DABCO [12% de Mowiol (p/v), 12% de glicerol (p/v) disuelto durante la noche agitando en 0,2 M Tris (pH 8,5) con 25 mg/mL de 1,4-diazabicil[2.2.2]octano (DABCO)] a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Con pinzas, retire con cuidado el cubreobjetos del pozo; frote el borde del cubreobjetos en el pañuelo para eliminar el exceso de líquido y coloque el lado de vmAstros hacia abajo sobre la gota de Mowiol / DABCO.
    14. Repita para cada cubreobjetos y deje secar durante 8 h antes del examen microscópico.
  2. Medición ELISA de la secreción de IL-6 de vmAstros en respuesta al tratamiento con citocinas
    NOTA: Después de la maduración de 10 días con BMP4 y LIF, los vmAstros deben pasarse, contarse y platearse en material de plástico de cultivo de tejidos recubierto de matriz 0,25x (como se detalla en Sección 2.2Preparación de la matriz de la membrana basal y recubrimiento de plástico de cultivo de tejidos), a una densidad de 65.000 vmAstros por cm2 en los medios de comunicación ASTRO. BMP4 y LIF deben eliminarse de los vmAstros 72 h antes del tratamiento con citocinas, ya que la señalización activa de estos factores puede interferir con la eficacia del tratamiento con citocinas. Alternativamente, los vmAstros criopreservados se pueden descongelar y utilizar para ensayos.
    1. El día del ensayo, lave suavemente vmAstros 3 veces en medios no redox (DMEM/F-12 + glutamax + N2).
    2. Use un pozo de control no tratado y tratado con citocinas para comparar. Agregue la citocina elegida a una concentración optimizada. Los datos de la Figura 2J - L se generaron utilizando IL-1α a 3 ng/mL9 en medios no redox a 1 mL por área de cultivo celular de 10cm2.
    3. Reemplace vmAstros en una incubadora de 37 °C/5% CO2 durante 24 h. Después de 24 h, recoja los medios de cultivo en tubos de microfuga estériles.
    4. Si el ELISA no se va a llevar a cabo inmediatamente, tome las muestras de medios de congelación sumergiendo los tubos de microfuga en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C para futuros análisis.
      NOTA: El siguiente protocolo está optimizado específicamente para su uso con el kit ELISA IL-6 que se detalla en la Tabla de Materiales. Los anticuerpos y los patrones suministrados como polvo liofilizado en un nuevo kit ELISA deben reconstituirse antes del primer uso y alícutus para su uso futuro. En la ficha técnica suministrada con el kit se detallan los reactivos y los volúmenes necesarios para la reconstitución. El anticuerpo de captura debe reconstituirse en PBS (sin proteína transportadora).
    5. Realizar el ELISA en formato de placa de 96 pocillos y calcular los volúmenes de reactivos en función de los pocillos utilizados. El día del ELISA, prepare el anticuerpo de captura diluyendo el stock 1:120 en PBS. Cubra la placa cargando 50 μL de anticuerpo de captura por pocillo. Cubra la placa con una tira adhesiva e incube a temperatura ambiente durante la noche.
    6. Al día siguiente, lavar la placa 3 veces con D-PBS-Tween (D-PBS con 0,05% de Tween-20), 100 μL por pocillo. Secar con un secado.
    7. Bloquee la placa cargando 150 μL D-PBS/1% BSA por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h. Lavar la placa como se describe.
    8. Descongele las muestras en hielo (esto puede tardar de 1 a 2 h). Diluir las muestras 1:5 cargando 10 μL de muestra y 40 μL DE D-PBS/1% de BSA. Agite cada muestra antes de cargarla.
      NOTA: Es necesario diluir las muestras cuando se realiza un ELISA de IL-6, se deben optimizar las diluciones.
    9. Prepare el estándar superior (1.000 ρg/mL) diluyendo el material 1:180 en D-PBS/1% BSA. Prepare 7 patrones llevando a cabo una dilución en serie del estándar superior. Vórtice entre cada dilución.
    10. Agregue 50 μL de estándares/muestras a los pocillos. Utilice D-PBS/1% BSA como espacio en blanco. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h en un agitador orbital para mezclar adecuadamente las muestras diluidas. Lavar la placa como se describe.
    11. Prepare el anticuerpo de detección diluyendo el material 1:60 en D-PBS/1% BSA. Cargue 50 μL de anticuerpo de detección por pocillo. Cubrir la placa e incubar a RT durante 2 h. Lavar la placa como se describe.
    12. Prepare estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Strep-HRP) diluyendo el caldo 1:40 en D-PBS/1% BSA. Cargue 50 μL de Strep-HRP por pocillo e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Lavar la placa como se describe.
    13. Inicie la reacción de color cargando 50 μL de solución de sustrato TMB por pocillo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos (o hasta que los estándares y las muestras hayan desarrollado un color azul).
      NOTA: El TMB se almacena a 4 °C, pero debe utilizarse a temperatura ambiente.
    14. Detenga la reacción agregando 25 μL de solución de parada (1 M, H,2, SO,4) por pocillo y observe el cambio de color de azul a amarillo.
    15. Lea la placa a 450 nm de absorbancia utilizando un lector de microplacas. Ajuste la corrección de longitud de onda a 540 nm de absorbancia para maximizar la precisión. Calcule las concentraciones de proteínas en las muestras a partir de la curva estándar producida.

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Resultados

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Metodología de diferenciación y progresión
En este trabajo se presenta el detalle tanto de los métodos empleados para la generación de vmAstros como de los protocolos utilizados para su posterior caracterización fenotípica. El método para la generación de vmAstros se compone de varias etapas de diferenciación distintas, que pueden ser monitoreadas por microscopía e identificando características morfológicas distintas (Figura 1A-F). Un cul...

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Discusión

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Este método para la generación de vmAstros a partir de hiPSCs es altamente eficiente, generando cultivos puros de vmAstros, y siendo reproducible para la generación de vmAstros a partir de diferentes líneas de hiPSCs. Este protocolo se desarrolló en torno a la recapitulación de los eventos de desarrollo necesarios en el embrión para modelar correctamente el mesencéfalo en desarrollo y generar astrocitos y comprende tres etapas definidas: 1) inducción neural ventral del mesencéfalo para g...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por una beca del proyecto Parkinson's UK (G-1402) y una beca de investigación. Los autores agradecen al Wolfson Bioimaging Facility por su apoyo y asistencia en este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
0,2M Tris-Cl (pH 8,5)n/an/aCompuesto por Tris base y más HCl
0,5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 en D-PBS a 0,5 mM final 
1,4-diazabicilo[2.2.2]octano (DABCO)SigmaD27802-  25 mg/mL en solución de montaje Mowiol
cubreobjetos de 13 mmVWR631-0149
2-Mercaptoetanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010Tiene 1x NEAA pero añadimos a la concentración final de 2x (0,2 mM)
Ácido ascórbicoSigmaA5960Stock de 200 mM, 1:1000 a 200 y micro; M final
B27 SuplementoThermoFisher17504-04450x stock
BSASigma5470
Medios de congelación celularSigmaC2874Cryostor CS10
Recipiente de congelación celularNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860,8 mM stock, dilución 1:1000 a 0,8 y micro; M
final Crioviales  SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL, 1:10.000 a 100ng/mL final (en PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS sin Mg ni Ca)ThermoFisher14190144pH 7,2
E8 KitFlex ThermoFisher A2858501
Formaldehído (solución al 36%)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 o 1:400 en stock frío DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 mM (1:200 en N2B27, 1:100 en medios ASTRO a 20 &; M final) 
GlicerolSigmaG5516
BDNF Humano  Peprotech450-0220 y micro; g/mL de culata, 1:1000 a 20 ng/mL final
Human BMP4Peprotech120-0520 µ g/mL de caldo, 1:1000 a 20 ng/mL final
EGF humanoPeprotechAF-100-1520 y micro; g/mL de caldo, 1:1000 a 20 ng/mL final
GDNF humanoPeprotech450-1020 y micro; g/mL de stock, 1:1000 a 20 ng/mL de solución final de
insulina humanaSigma I927810 mg/mL de culata, 1:2000 a 5 y micro; g/mL final
LIF humanoPeprotech300-0520 µ g/mL de stock, 1:1000 a 20 ng/mL final
IL-6 ELISA kitBiotechneDY206
IsopropanolSigma  I9516-4LPara llenar el recipiente de almacenamiento criogénico Mr Frosty
LDN193189SigmaSML0559100 y micro; Culata M, dilución 1:10.000 a 10 nM final
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 SuplementoThermoFisher17502048100x
Culata NEAAThermoFisher1114003510 mM, 1:100 a 0,1 mM final 
Medios neurobasalesThermoFisher21103049
Suero de cabra normalVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisher A2644501100x stock, 1:100 a 1x
final SB431542Tocris161410 mM stock, dilución 1:1000 a 10 µ M final
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 µ g/mL de caldo, 1:1000 a 200 ng/mL final
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma P7949
VitronectinaThermoFisherA147001:50 en D-PBS
Anticuerpos fuertes > para inmunocitoquímica  Company>Número de catálogoEspecie huésped
Anticuerpo contra el ratón S100bSigmaSAB4200671; 1:200
Anticuerpo contra el ratón FOXA2SCBTNB600501; 1:50
Anticuerpo contra el conejo LMX1AProSci7087; 1:300
Anticuerpo contra LMX1AMilliporeAB10533conejo; 1:2000
Anticuerpo contra LMX1BProteintech18278-1-APConejo; 1:300
Anticuerpo contra GLASTProteintech20785-1-APConejo; 1:300
Anticuerpo contra GFAPDakoZ0334Conejo; 1:400
Anticuerpo contra CD49fProteintech27189-1-APConejo; 1:100
Anticuerpo contra MSI1Abcamab52865Conejo; 1:400
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Conejo ThermoFisherA32731Cabra; 1:500
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-RatónThermoFisherA32723Cabra; 1:500
Alexa Fluor 568 Cabra Anti-ConejoThermoFisherA11036Cabra; 1:500
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-RatónThermoFisherA11031Cabra; 1:500
medio <

Referencias

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