Transición de cerdos de granja a cerdos de investigación utilizando una lista de verificación designada seguida de la iniciación de la capacitación de clicker - una iniciativa de refinamiento

Los principios de las 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) discutidos por Russell y Burch en 1959, forman la base actual de altos estándares éticos con respecto al uso de animales con fines experimentales. En las instalaciones de investigación biomédica dedicadas a estudios preclínicos en animales de laboratorio, se debe tener gran importancia al principio de refinamiento. "Por perfeccionamiento se entiende cualquier disminución de la incidencia o de la gravedad de los procedimientos inhumanos aplicados a los animales que aún no deben utilizarse"¹.

Una definición contemporánea afirma además que el refinamiento es "avanzar en la investigación sobre el bienestar animal mediante la explotación de las últimas tecnologías in vivo y la mejora de la comprensión del impacto del bienestar en los resultados científicos"². Esto implica que no sólo las iniciativas de perfeccionamiento de hoy en día son importantes para el bienestar del animal per se, sino que también son importantes para la calidad de la investigación, ya que los resultados científicos se beneficiarán de estas iniciativas ³.

Una iniciativa de refinamiento a considerar es socializar y entrenar animales de experimentación. Pueden ser entrenados para realizar una cierta tarea, por ejemplo, subirse a una báscula o comportarse con calma mientras se extraen muestras de sangre. Algunas especies pueden estar más naturalmente dispuestas al entrenamiento que otras y esto afecta la tradición de entrenamiento de especies de animales de laboratorio. Tradicionalmente, el entrenamiento de perros se ha realizado durante siglos, por ejemplo, con el fin de utilizar el perro en la caza. Estas tradiciones históricas sin duda han hecho que el entrenamiento de perros en el entorno de la investigación biomédica sea más sencillo. Junto con primates no humanos, el entrenamiento de perros de laboratorio se ha discutido y llevado a cabo durante bastante tiempo^4,5.

Común a ambas especies es que ocupan un lugar destacado en la "escala socio-zoológica". Esta escala clasifica a los animales según su lugar y uso en la sociedad humana ⁶. La clasificación alta también conlleva una gran demanda pública de tratar a los animales de la manera más humana posible y limitar su nivel de estrés y ansiedad. Los roedores, en contraste con los perros y los primates no humanos, se colocan en el extremo inferior de la escala socio-zoológica. No han recibido una atención y atención pública equivalentes. Históricamente han sido tratados menos bien - presumiblemente también debido a su capacidad para propagar enfermedades potencialmente mortales. Sin embargo, durante los últimos años el entrenamiento de roedores se ha implementado en entornos de investigación preclínica y los beneficios científicos relacionados con el mismo no han pasado desapercibidos. Tanto las ratas como los ratones son curiosamente bastante fáciles de entrenar y el entrenamiento también limita su respuesta al estrés y, por lo tanto, fortalece los resultados científicos^7,8.

Informar sobre cómo socializar y entrenar cerdos en un entorno de animales de laboratorio es, a nuestro entender, escaso⁹. En la escala socio-zoológica, los cerdos se colocan entre perros y roedores. Reconocemos la especie principalmente como un recurso alimenticio, pero sin embargo un gran número de cerdos también se utilizan en la investigación biomédica. Solo en la UE, aproximadamente 75 000 cerdos se utilizaron anualmente con fines científicos en 2015-2017 ¹⁰. Este número abarca tanto a los cerdos de granja como a los cerdos en miniatura. Cada vez se presta más atención a refinar la vida de estos animales mediante el entrenamiento como medida para cumplir con las 3R. Tanto los cerdos de granja como los cerdos en miniatura pueden ser entrenados ^11,12, pero su punto de partida en términos de socialización varía. Los cerdos en miniatura se crían para la investigación y se socializan durante su vida temprana. Son criados para tener un temperamento tranquilo. Los cerdos de granja se crían para el consumo y a menudo no se socializan en absoluto. Los cerdos de acabado para la producción de carne en Dinamarca suelen alojarse en grupos de alta densidad de 15-25 cerdos donde tienen que competir para ganarse un puesto en la jerarquía del rebaño. Su temperamento refleja esa capacidad. A menudo, se alojan en instalaciones estables con un piso parcialmente programado para limitar la carga de trabajo de la mucking out. Para optimizar el aumento de peso, se alimentan ad libitum a través de sistemas automatizados de suministro de alimentos y agua. Por lo tanto, su contacto con los trabajadores agrícolas es limitado y se estresarán cuando sean manipulados. Esto plantea ciertos desafíos cuando los animales son transferidos a un centro de investigación. Aquí el bienestar animal, la ganadería y las 3R juegan un papel clave^13,14. Desde una perspectiva de investigación, cada animal individual es importante para obtener los mejores resultados de investigación posibles. El bienestar de los animales también es importante para garantizar una baja variación entre los animales en lo que respecta al estrés, la ansiedad y el miedo. Por estas razones es importante prestar atención a la transición de un "animal de rebaño" a un "individuo". A su llegada, los cerdos entran en un nuevo ambiente con nuevos olores, nuevos alimentos, contacto diario con cuidadores de animales y, a menudo, también nuevos compañeros de corral. Para un cerdo, el cambio puede ser muy estresante y la importancia de un período de aclimatación de varios días es reconocida en la ciencia animal de laboratorio¹⁵.

Al estructurar el período de aclimatación, hemos creado lo que llamamos una "fase de transición" utilizando una lista de verificación estructurada paso a paso. La lista de verificación garantiza que cada cerdo reciba suficiente contacto con el cuidador y aprenda a permitir el manejo básico para el examen y la recolección de muestras sin estar estresado. A continuación, se puede llevar a cabo un trabajo continuo para entrenar a los cerdos utilizando una formación de refuerzo positivo dirigida a cada proyecto de investigación específico^16,17. Un clicker se utiliza para señalar una recompensa de comida cuando se realiza la acción deseada. La combinación de los pasos de la fase de transición con el entrenamiento adicional de los cerdos hace clic en los cerdos da a los animales un asentamiento suave en la instalación de investigación. Se vuelven tranquilos y fáciles de manejar y, con poco esfuerzo, se les puede enseñar a permanecer quietos para, por ejemplo, la recolección de muestras de sangre. Mediante el uso de este tipo de protocolo de manipulación, se sustituyen técnicas anticuadas como la sedación de los animales o las trampas. Para asegurarse de que todos los cerdos se manejan lo suficiente se rellena una lista de verificación.

Cada vez se acepta ampliamente que los animales sí sienten emociones positivas, por lo que el enfoque al trabajar con los animales no debe centrarse únicamente en la eliminación de las emociones negativas ¹⁸. La sesión de entrenamiento con el cuidador es un ejemplo de una experiencia emocional positiva. Es bastante agradable para el cerdo, ya que recibe golosinas y atención. Además del beneficio de reducir el estrés por el manejo y los comportamientos relacionados con el miedo en la instalación, el entrenamiento de los animales brinda a los animales experiencias emocionales positivas. La adición de experiencias positivas puede contrarrestar algunas de las experiencias negativas que los animales de laboratorio encuentran en relación con los experimentos realizados y, por lo tanto, aumentará aún más el bienestar animal ^19,20.

Mientras que los cerdos evidentemente disfrutan de las sesiones de entrenamiento, las sesiones simultáneamente ofrecen al cuidador una oportunidad para fortalecer el vínculo con cada cerdo individual. Ser un cuidador de animales, realizar acciones dolorosas, como inyecciones de los animales, es parte del trabajo. Sin embargo, poder entrenar a los animales y convertir estas acciones en experiencias positivas es gratificante en sí mismo. Aumenta el compromiso de los cuidadores y juega un papel clave en el fortalecimiento de la cultura de cuidado del departamento^21,22,23.

Los cerdos fueron alojados de acuerdo con la Política de Bienestar Animal de la Institución, que se refiere a la legislación nacional sobre experimentación animal, alojamiento y cría. El protocolo se puede aplicar a cerdos destetados de cualquier edad. Para el desarrollo de la lista de verificación de transición (Figura 1) se utilizó un total de 40 hembras de cerdos de granja mestizos (Danish Landrace-Yorkshire-Duroc) con un peso de 35-80 kg (Tabla 1). Los cerdos fueron asignados a un grupo dependiente de su hora de llegada. Los cerdos fueron alojados en el centro de investigación estable en el período enero - septiembre de 2020. Todos los cerdos de granja se crían en una granja de cerdas tradicional y se trasladan a una granja colaboradora cuando pesan aproximadamente 15 kg. Al menos dos semanas antes de su inclusión en los estudios de supervivencia, los cerdos son transportados a las instalaciones estables de investigación de la universidad. Durante las dos primeras semanas se lleva a cabo la transición del cerdo de granja al animal de investigación. El protocolo se compone de acciones positivas y no dañinas y, por lo tanto, puede iniciarse inmediatamente como parte del período de aclimatación.

Los cerdos fueron alojados uno por uno en corrales de 3,4 - 6,8 m² en pisos sólidos de hormigón y tienen acceso al agua a través de un suministro automático de agua. Hay un comeugh para cada cerdo y por lo menos una sección de la separación a las plumas vecinas permite el contacto del snout. Cuando los cerdos están programados para recibir intervenciones quirúrgicas o tener equipo implantado, se alojan solos para evitar que los compañeros de pluma lamer y morder en las heridas y sacar implantes. El material de la ropa de cama es paja y los animales se enriquecen aún más con heno y juguetes de diferentes actividades, por ejemplo, cuerda, bolas, cubos, palos de mascar hechos de plástico (Figura 2).

Los animales provienen de un rebaño incluido en el programa nacional de monitoreo de la salud de los cerdos de granja, lo que significa que se les realizan cribados para detectar siete patógenos²⁴ que pueden afectar a los cerdos en un entorno de producción. Se realizan controles aleatorios bianuales para el rebaño de investigación basados en las recomendaciones^25,26deFELASA, además de muestras de cerdos que justifican diagnósticos debido a resultados inesperados de la investigación. Algunos de los cerdos utilizados para este proyecto fueron seropositivos para el síndrome reproductivo y respiratorio porcino; sin embargo, ningunos de los cerdos mostraron ningún síntoma clínico correspondiente a la infección. Todas las muestras evaluadas mediante reacción en cadena de la polimerasa fueron negativas, lo que corrobora que los cerdos se encontraban en buenas condiciones.

Los cerdos utilizados para validar el protocolo fueron parte de los estudios aprobados por el Consejo Experimental de Animales - una institución gubernamental nacional que evalúa y aprueba todos los experimentos con animales en Dinamarca. El Consejo hace la revisión ética similar a un IACUC.

1. Llegada al centro de investigación

1. Primero, lave los cerdos en un área designada para permitir una inspección visual exhaustiva. Utilice una lista de exclusión para excluir a los cerdos con heridas, mordeduras de oído, abscesos, cojera, etc., de modo que solo los animales que parecen clínicamente sanos puedan entrar en la instalación.
2. Después del lavado, ordene los cerdos en grupos de acuerdo con las marcas de color. Las marcas de color indican qué cerdos han sido compañeros de corral en el proveedor. Esto es importante ya que los cerdos lucharán por establecer una jerarquía cuando se les presente a nuevas parejas de corral. Mantenerlos clasificados en grupos junto con cerdos con los que ya están familiarizados limita considerablemente esta lucha.
3. Deje a los cerdos tranquilos (excepto cuando se alimentan por la tarde) durante el resto del día de llegada, ya que pueden estar bastante estresados después del transporte.

2. Primera parte: La fase de transición (tiempo estimado 4-6 días)

NOTA: Los cerdos permanecen en su corral casero durante las actividades realizadas en la fase de transición. Usamos media manzana para cada sesión de tratamiento. El progreso de cada cerdo individual se puntó en la lista de verificación de progresión de la fase de transición (Figura 1 y Archivo Suplementario 1).

1. En los dos días consecutivos después de la llegada, introduzca las golosinas.
   1. Lanzar trata unas cuantas a la vez (media manzana en total) en la pluma dos veces al día para permitir que los cerdos busquen las golosinas por su cuenta y se paran tranquilamente justo fuera de la pluma. Además de familiarizarse con las golosinas, el objetivo es que el animal asocie positivamente la golosina con la presencia de un cuidador.
2. En el tercer día y días sucesivos se introduce la familiarización del cerdo con el "manejo por parte de un cuidador". Ingrese a la pluma durante la alimentación.
   1. Siéntese a la distancia del brazo del cerdo mientras está comiendo (Figura 3). Extiende con calma una mano hacia el cerdo para tocar su espalda. La entrada táctil debe ser de más de dos segundos para contar como correcta. Si el cerdo retrocede lejos de la comida, retire la mano lentamente.
   2. Espere hasta que el animal comience a comer y realice la acción de nuevo. Si el animal se aleja de la comida de nuevo, deje de intentar tocarla pero permanezca dentro de la pluma junto a la vaguada (2-3 minutos en total para la sesión).
3. Siga adelante con el procedimiento de manipulación cuando el cerdo acepte ser tocado en la espalda mientras está comiendo. Ahora mueva la mano alrededor de la espalda en ambas direcciones de la cabeza y la cola.
   1. Toque la cabeza y las orejas si el cerdo lo acepta. Si en algún momento, el cerdo retrocede lejos de una acción detener la acción, pero permanecer dentro de la pluma durante el tiempo restante (2-3 minutos en total para la sesión). El oído es importante ya que permite la toma de muestras de sangre de un catéter intravenoso en el oído.
   2. Levántate lentamente para poder tocar la región de la cola, que es la segunda área importante. Pararse y moverse es más aterrador para el cerdo, por lo que este paso se puntó de forma independiente. Cuando el cerdo acepta que se toque el área y se manipule la cola, se puede tomar una temperatura rectal para apoyar la mayoría de los protocolos de investigación.
4. Para fortalecer aún más el vínculo entre el cuidador y el animal entrar en el corral durante dos sesiones aparte de los tiempos de alimentación. Ofrezca las golosinas de cerdo (una rebanada a la vez) durante dos sesiones (2-3 minutos cada una), mientras se sienta en una esquina dentro de la pluma. Al principio, dar las golosinas de un brazo extendido, pero disminuir la distancia gradualmente por lo que el cerdo tiene que acercarse para obtener su recompensa.
5. La etapa final de la fase de transición es poder tocar al cerdo en las áreas específicas del cuerpo y usar solo unas pocas golosinas para hacerlo. Entre en el corral mientras un segundo cuidador se para fuera del corral y ofrece una o dos golosinas al cerdo. Recompensar al cerdo por estar tranquilo y permitir tocar como se describe y al mismo tiempo ser capaz de mantener las cuatro pezuñas en el suelo (no saltar sobre la valla de la pluma).

3. Segunda parte: Comenzando la capacitación de clicker

NOTA: Después de la fase de transición, los animales están listos para comenzar el entrenamiento de clicker. Se recomienda que el entrenamiento se realice en un área designada, ya que ayuda al cerdo a reconocer que una sesión de entrenamiento está a punto de comenzar. Varias sesiones cortas a lo largo del día son mejores que una sesión más larga.

1. Lleve un cerdo a la vez fuera del corral de casa y en el área de entrenamiento designada. Si el área utilizada es novedosa para el cerdo, las primeras sesiones deben ser sin entrenamiento y estrictamente exploratorias con algunas golosinas durante unos 5-7 minutos de exploración por cerdo.
2. Introduzca el clicker sentado o de pie con las golosinas fuera del alcance del cerdo. Haga clic cuando el cerdo muestra interés, e inmediatamente dar un regalo. Haga esto en rápida sucesión mientras el cerdo mantiene el interés. Si el cerdo pierde interés, pause el click-and-treat hasta que el cerdo vuelva a ponerse en contacto. Esta sesión no debe tener más de 10 minutos.
3. El cerdo entenderá el clic rápidamente, pero es importante hacer que la asociación entre hacer clic y tratar sea muy fuerte. Repita el paso unas cuantas sesiones seguidas para que la asociación entre hacer clic y tratar fuerte. Pruebe si el cerdo asocia el clic con una golosina haciendo clic una vez y no siguiendo esto con una golosina y monitoreando el comportamiento del cerdo de cerca. Si el cerdo mira a su alrededor esperando ansiosamente el regalo, el entrenamiento está completo, si no realizar algunas sesiones adicionales.
4. Una vez que el clic es conocido por el cerdo, introduzca el palo de destino. Un palo de destino es un palo con un área marcada en un extremo. Sostenga el extremo objetivo en la altura del snout. En algún momento, el cerdo lo tocará por curiosidad. Haga clic en el segundo que el cerdo toca el objetivo y dar un regalo.
5. Presente el objetivo de nuevo inmediatamente y si se toca haga clic de nuevo y dar un regalo. Continúe el entrenamiento del objetivo hasta que el cerdo entienda que será recompensado por tocar el objetivo. Mueva el objetivo gradualmente más lejos por lo que el cerdo tiene que moverse más lejos para llegar al objetivo.
6. Cuando el cerdo sigue al objetivo cuando se mueve alrededor añadir desafíos adicionales mediante la colocación de objetos en el área de entrenamiento, por lo que el cerdo tiene que concentrarse más en la tarea de palo objetivo para obtener sus recompensas.

La aplicación de la fase de transición como se describe en la primera parte del protocolo permite una introducción sin problemas de cerdos de granja en las instalaciones de investigación. Tener cerdos tranquilos para trabajar facilita las tareas diarias y permite que los procedimientos menores y la toma de muestras se realicen sin anestesia ni fijación.

Para seguir el progreso de los cerdos durante la fase de transición, se desarrolló una lista de verificación (Lista de verificación 1) para marcar cuándo los cerdos individuales alcanzan pasos definidos en su transición. Los cerdos están programados para entrar en proyectos de investigación dentro de las dos semanas posteriores a la llegada y el número total de días fue la medida elegida para mostrar el éxito de la transición.

Sobre la base de la lista de verificación 1, se ha seguido la fase de transición de 20 cerdos para verificar que es posible hacer la transición de cerdos de granja a cerdos de investigación en dos semanas (Figura 4). Todos los cerdos completaron la lista en un plazo de 12 días, lo que demuestra que el plazo establecido era suficiente.

La lista de verificación 1 se modificó en función de las primeras experiencias. Se elaboró una nueva lista de verificación estricta(Lista de verificación 2). Para mejorar y normalizar aún más la transición, la principal revisión fue aumentar el número de sesiones diarias y limitar la cantidad de tiempo empleado por período de sesiones. La comparación de las dos listas de verificación muestra que los cerdos en transición utilizando la lista de verificación 2 tuvieron una progresión similar durante los primeros días de transición, mientras que los pasos posteriores se alcanzaron más rápido. Una comparación entre el uso de la lista de verificación 1 y la lista de verificación 2 se puede ver en la figura 5.

Después de la finalización de la fase de transición, los animales permitirán medidas de resultado básicas como tomar la temperatura y la inspección de las heridas quirúrgicas. Cuando un cerdo (hembra) ha sido transicionado para permitir tocar el área de la cola, se puede recolectar una muestra de orina utilizando una bolsa de ostomía colocada alrededor de los genitales externos pero debajo del ano(Figura 6).

Otro ejemplo de un resultado de datos que se puede recopilar es una muestra de sangre. En nuestras instalaciones a menudo colocamos un catéter venoso en una vena del oído durante la cirugía. Después de la recuperación, el catéter se puede utilizar para administrar medicamentos para reducir el número de inyecciones intramusculares, tomar múltiples muestras de sangre para apoyar el proyecto y evaluar el retorno del cerdo a la fisiología normal (Figura 7).

Pasando de la fase de transición, la capacitación de clicker se basará en la fase de transición para permitir más beneficios durante el manejo y obtener datos de resultados. Entrenar a los cerdos para que sigan un palo objetivo permitirá al cuidador mover al cerdo, por ejemplo, a una escala para controlar el peso corporal(Figura 8)o a una caja de transporte(Figura 9)si los cerdos necesitan ser transportados a una cirugía o a un centro de diagnóstico por imágenes. Para un proyecto, los cerdos fueron entrenados para permanecer quietos mientras se administraba el medicamento en los ojos (Figura 10).

Al iniciar el entrenamiento clicker se hace evidente que cada cerdo es único y responden de manera diferente a la formación. Durante la capacitación, esto se reconoce y las sesiones de capacitación se acomodan en consecuencia. Algunos cerdos necesitan dos o tres veces más sesiones de entrenamiento para aprender la misma tarea, lo que puede ser problemático si ciertas tareas necesitan ser aprendidas en puntos de tiempo específicos para apoyar el proyecto de investigación.

Tabla 1: Características básicas de los cerdos utilizados para evaluar las listas de verificación.

Figura 1:La lista de comprobación de la fase de transición. Como se ilustra, varias de las actividades tienen lugar el mismo día pero en diferentes intervalos de tiempo. Los pasos 3-5 tienen lugar durante la alimentación, mientras que los pasos 1-2 y 6-7 tienen lugar en puntos de tiempo definidos durante el día. Tenga en cuenta que cada sesión debe realizarse durante el tiempo indicado en la parte superior de la lista de verificación, pero solo tarda aproximadamente 2 minutos en llevarse a cabo por cerdo. Los cuadros sombreados indican que la tarea no se va a realizar. La lista de verificación completa se puede encontrar en el archivo complementario 1. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Algunos de los enriquecimientos utilizados en el departamento Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ilustración de la posición del cuidador durante los pasos 2.2 y 2.3 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4:Línea de tiempo de la fase de transición utilizando la lista de verificación 1. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5: Progresión de la fase de transición. Una gráfica de dispersión que muestra la progresión de la fase de transición utilizando la lista de verificación 1 ( ) en comparación con la lista de verificación 2 (Ο). Cada parcela corresponde a la observación de un cerdo. La media y la SD se indican mediante las barras de error. El eje y es el número de días. En el eje x los pasos se conocen de la siguiente manera: 1; Manzanas de la mano. 2; Toque el cerdo durante la alimentación. 3; Toque la parte posterior y la cola durante la alimentación. 4; Toque la parte posterior y la cola mientras da golosinas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6:Recolección de muestras de orina a través de una bolsa de ostomía colocada alrededor de los genitales externos durante la alimentación. El cerdo permanece tranquilo durante el procedimiento y no hace caso de la bolsa de ostomía. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 7: Dosificación intravenosa durante la alimentación después de la fase de transición. El cuidador es capaz de sentarse muy cerca del animal y centrarse en infundir el medicamento correctamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 8:Paso a escala usando el stick de destino. El cerdo está ansioso por seguir el palo objetivo debido al entrenamiento de refuerzo positivo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 9:Después de la meta se pegue en la caja de transporte. Este procedimiento es útil si el cerdo necesita ser transportado a, por ejemplo, un centro de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 10: Cerdo entrenado para colocar su cabeza en un soporte y pararse quieto para que el medicamento se pueda administrar en los ojos sin sedación. Después de administrar el medicamento, el cerdo apoya la cabeza sobre el soporte y se puede realizar una inspección visual de los ojos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Expediente complementario 1. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo. La lista de verificación completa de la progresión de la fase de transición lista para imprimir. Tenga en cuenta que un cambio en el campo de fecha de llegada afecta a las fechas de la hoja.

Los autores no tienen revelaciones.