Method Article

El aparato anulador del sueño: un método altamente eficiente de privación del sueño a Drosophila

DOI:

10.3791/62105

⸱

December 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La privación del sueño es una herramienta poderosa para investigar la función y regulación del sueño. Describimos un protocolo para privar del sueño a Drosophila utilizando el Aparato Anulador del Sueño, y para determinar el alcance del sueño de rebote inducido por la privación.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La homeostasis del sueño, el aumento del sueño observado después de la pérdida de sueño, es uno de los criterios definitorios utilizados para identificar el sueño en todo el reino animal. Como consecuencia, la privación del sueño y la restricción del sueño son herramientas poderosas que se utilizan comúnmente para proporcionar información sobre la función del sueño. Sin embargo, los experimentos de privación del sueño son inherentemente problemáticos en el momento en que el estímulo de privación en sí mismo puede ser la causa de los cambios observados en la fisiología y el comportamiento. En consecuencia, las técnicas exitosas de privación del sueño deben mantener a los animales despiertos e, idealmente, dar como resultado un rebote robusto del sueño sin inducir también una gran cantidad de consecuencias no deseadas. Aquí, describimos una técnica de privación del sueño para Drosophila melanogaster. El Aparato Anulador del Sueño (SNAP) administra un estímulo cada 10s para inducir geotaxis negativas. Aunque el estímulo es predecible, el SNAP previene eficazmente el sueño >95% de la noche, incluso en moscas con un alto impulso de sueño. Es importante destacar que la respuesta homeostática posterior es muy similar a la lograda mediante la privación de la mano. El tiempo y el espaciamiento de los estímulos se pueden modificar para minimizar la pérdida de sueño y, por lo tanto, examinar los efectos no específicos del estímulo en la fisiología y el comportamiento. El SNAP también se puede utilizar para la restricción del sueño y para evaluar los umbrales de excitación. El SNAP es una poderosa técnica de interrupción del sueño que se puede utilizar para comprender mejor la función del sueño.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sueño es casi universal en los animales, sin embargo, su función sigue sin estar clara. La homeostasis del sueño, el aumento compensatorio del sueño después de la privación del sueño, es una propiedad definitoria del sueño, que se ha utilizado para caracterizar los estados de sueño en un número de animales1,2,3,4,5.

El sueño en la mosca tiene muchas similitudes con el sueño humano, incluida una respuesta homeostática robusta a la pérdida de sueño4,5. Numerosos estudios sobre el sueño en la mosca han utilizado la privación del sueño tanto para inferir la función del sueño al examinar las consecuencias adversas que se derivan de la vigilia prolongada, como para comprender la regulación del sueño mediante la determinación de los mecanismos neurobiológicos que controlan la regulación homeostática del sueño. Así, se demostró que las moscas privadas de sueño exhiben deficiencias en el aprendizaje y la memoria6,7,8,9,10,11, 12,plasticidad estructural13,14,15,atención visual16,recuperación de una lesión neuronal17,18,apareamiento y comportamientos agresivos19, 20, proliferación celular21, y respuestas al estrés oxidativo22,23 por nombrar algunos. Además, las investigaciones sobre los mecanismos neurobiológicos que controlan el sueño de rebote han arrojado información crítica sobre la maquinaria neuronal que constituye el homeostato del sueño8,9,23,24,25,26,27,28,29 . Finalmente, además de revelar información fundamental sobre la función del sueño en animales sanos, los estudios de privación del sueño también han informado sobre la función del sueño en estados enfermos30,31.

Si bien la privación del sueño es innegablemente una herramienta poderosa, con cualquier experimento de privación del sueño, es importante distinguir los fenotipos que resultan de la vigilia prolongada, de los inducidos por el estímulo utilizado para mantener al animal despierto. La privación del sueño por privación de la mano o manejo suave, generalmente se considera que establece el estándar para la privación del sueño mínimamente perturbadora. Aquí describimos un protocolo para privar del sueño a las moscas utilizando el Aparato de Anulación del Sueño (SNAP). El SNAP es un dispositivo que entrega un estímulo mecánico a las moscas cada 10 s, manteniendo a las moscas despiertas mediante la inducción de geotaxis negativas(Figura 1). El SNAP priva eficientemente a las moscas del >98% del sueño nocturno, incluso en moscas con alto nivel de sueño8,32. El SNAP ha sido calibrado en moscas sensibles a la explosión, la agitación de las moscas en el SNAP no daña a las moscas; la privación del sueño con el SNAP induce un rebote comparable al obtenido por la privación de la mano7. El SNAP es, por lo tanto, un método robusto para privar del sueño a las moscas mientras controla los efectos del estímulo excitante.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación experimental

  1. Recolecte moscas a medida que eclosión en viales, separando las moscas macho y hembra.
    NOTA: Los experimentos de sueño se realizan comúnmente con moscas hembras. Es importante recolectar hembras vírgenes. Las hembras apareadas pondrán huevos que eclosionan en larvas complicando el análisis de los datos.
  2. Moscas domésticas de un solo sexo en grupos de <20.
    NOTA: La vivienda de moscas en un entorno socialmente enriquecido (grupos de >50) modula la unidad de sueño6,13 mediciones potencialmente confusas del sueño de rebote. Además, después del enriquecimiento social, el sueño disminuirá en unos pocos días6. Por lo tanto, el sueño basal no es estable, lo que complica el análisis del sueño de rebote. Mantener las moscas en grupos de <20 evita esta posible confusión.
  3. Mantenga las moscas en viales durante 3-5 días en un ambiente ligero y con humedad controlada.
    NOTA: La edad y la madurez de las moscas influyen fuertemente en el sueño. El sueño es alto en las moscas de un día de edad y se estabiliza a los 3-5 días de edad4. Las moscas se mantienen típicamente en un horario oscuro de 12 h: 12 h a un 50% de humedad.

2. Preparación de tubos para la grabación del sueño

NOTA: El sueño se monitorea usando monitores de actividad locomotora. Un monitor puede contener 32 moscas alojadas individualmente en tubos de 5 mm de diámetro. Típicamente, los genotipos se analizan en grupos de 16 o 32 moscas.

  1. Prepare un número apropiado de tubos con comida para moscas en un extremo.
    NOTA: Se sabe que la dieta y el metabolismo influyen en el sueño33,34, por lo tanto, es particularmente importante colocar moscas en el mismo alimento en el que fueron criadas.
  2. Selle el extremo de los tubos con cera.
    NOTA: La privación del sueño y el rebote es un experimento de cinco días, y la comida puede secarse si no se sella adecuadamente. En tubos debidamente sellados, los alimentos se pueden mantener durante 10 días o más. Por lo tanto, es fundamental asegurarse de que los extremos de los tubos estén bien sellados. Sin embargo, las moscas también pueden atascarse en la comida húmeda. Por lo tanto, ayuda a hacer tubos 1-2 días antes del inicio del experimento.
  3. Coloque individualmente las moscas de estela, que se comportan en tubos de vidrio de 65 mm de largo para la grabación del sueño con un aspirador y enchufe el extremo de los tubos con un tapón de espuma.
    NOTA: Las moscas nunca se vuelven a exponer a la anestesia con CO2 cuando se colocan moscas en tubos para registrar el sueño. El aspirador está hecho de tubos de goma con un extremo cubierto con gasa e insertado en una punta de pipeta de 1 ml.

3. Grabación del sueño

  1. Cargue moscas en tubos en monitores de actividad para monitorear el sueño.
    NOTA: El SNAP monitorea las rocas de ida y vuelta de -60 ° a + 60 ° cada ~ 10 s. Los monitores se mantienen a -60 ° durante ~ 5.9s; se necesitan ~ 2.9 s para que la bandeja que sostiene los monitores se mueva de -60 ° a + 60 ° y ~ 1 s para retroceder de + 60 ° a -60 °. La duración del ciclo se puede alterar según sea necesario ajustando el voltaje suministrado al motor.
    1. Tenga cuidado de asegurarse de que los tubos se coloquen en los monitores de actividad en la orientación correcta. En la orientación correcta, el extremo del tubo con comida está en la parte superior del SNAP para garantizar que las moscas no se empujen hacia la comida. Además, el extremo con la comida está en el lado del monitor con el conector de grabación del sueño. Esto permite que los monitores de actividad se orienten correctamente en el SNAP para una privación eficiente del sueño mientras se monitorea simultáneamente la actividad.
  2. Coloque monitores de actividad en la cámara de grabación para monitorear el sueño.
  3. Controle el sueño durante al menos dos días completos para estimar el sueño inicial.
    NOTA: El día en que las moscas se cargan en monitores de actividad generalmente se excluye como un día de adaptación para permitir que las moscas se adapten a ser alojadas en tubos. El sueño basal se registra durante al menos dos días completos (48 horas) a partir de la mañana siguiente al día en que se cargan las moscas.
  4. Guarde los recuentos de actividad locomotora de las moscas en contenedores de 1 minuto desde el momento de las luces en un día determinado hasta las luces del día anterior utilizando un software de registro de actividad (por ejemplo, de 8 AM a 8 AM).
  5. Calcule el sueño a partir de los datos de actividad locomotora con macros personalizadas utilizando 5 minutos de inactividad como umbral para un episodio de sueño35.
    NOTA: Una serie de métricas de sueño se calculan a partir de los recuentos de actividad locomotora. Estos incluyen el sueño en min/h durante 24 h, el tiempo total de sueño en 24 h, la duración media y máxima del sueño diurno y nocturno36.

4. Privación del sueño y recuperación

  1. Como las moscas pueden estar privadas de sueño durante períodos de tiempo variables (por ejemplo, 12 h, 24 h y 36 h) y el sueño de recuperación también se puede evaluar a varios intervalos (por ejemplo, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h), determine la duración de la recuperación por necesidad experimental. La recuperación del sueño se puede visualizar utilizando una gráfica de ganancia/pérdida de sueño o examinando el porcentaje de sueño recuperado durante un intervalo predeterminado (por ejemplo, 6 h).
  2. Si el sueño es estable durante los dos días de referencia, en el tercer día, coloque monitores de actividad en el SNAP para la privación del sueño durante la noche.
    NOTA: Las moscas exhibirán un rebote de sueño robusto en un rango de tiempos de sueño8,32,37,38,pero el sueño debe ser estable para evaluar de manera confiable el sueño de rebote. El sueño es estable cuando la diferencia en el sueño entre los días basales es de ± 100 min.
  3. Asegúrese de que los monitores de actividad estén asegurados en su lugar con pines de soporte para monitores, cables de monitor enchufados y monitores orientados correctamente con el extremo con alimentos en la parte posterior y barreras de plástico en la parte delantera(Figura 1).
    NOTA: El SNAP está diseñado para que la leva gire una vez cada 10 s (Figura 1). El inserto de plástico restablece los tubos empujando los tubos hacia atrás cuando el aparato está en la posición "hacia arriba". El restablecimiento de los tubos es importante para garantizar que todos los tubos tengan el rango completo de movimiento al comienzo de cada ciclo.
  4. Desconecte los monitores de actividad y saque los monitores del SNAP inmediatamente después de encender las luces después de la privación del sueño durante la noche.
    NOTA: Es fundamental que se ponga fin a la privación del sueño, y las moscas se colocan en recuperación inmediatamente después de las luces encendidas después de 12 h de privación del sueño durante la noche. Incluso un retraso de 20-30 minutos en la colocación de moscas en la recuperación puede interferir con la extensión del sueño de rebote.
  5. Coloque las moscas en una cámara de grabación donde no serán molestadas durante dos días (48 h) para monitorear el sueño de recuperación.
    NOTA: Si la cámara de grabación se está utilizando para otros experimentos, se debe tener especial cuidado para evitar estimular las moscas en recuperación.
  6. Calcule la cantidad de sueño perdido. Para cada mosca individual, calcule la diferencia horaria entre el sueño obtenido durante la privación del sueño y la hora correspondiente durante la línea de base; sumar las diferencias horarias para calcular el sueño total perdido.
  7. Calcula la cantidad de sueño recuperado. Para cada mosca individual, calcule la diferencia horaria entre el sueño obtenido durante la recuperación y la hora correspondiente durante la línea de base; sumar las diferencias horarias para calcular el sueño total ganado.
    NOTA: Si una mosca está realmente privada de sueño es empírico. Por lo tanto, el experimentador debe examinar el porcentaje de sueño perdido. Si la mosca no ha perdido una cantidad suficiente de sueño, puede excluirse del análisis. Aunque esto podría ser necesario para otros enfoques de privación del sueño, rara vez o nunca se requiere para el SNAP. Más comúnmente, el sueño puede no ser estable en una mosca dada antes del inicio de la privación del sueño. Si el sueño no es estable, no se puede calcular la homeostasis. Aceptamos una diferencia máxima de ± 100 min de sueño calculada antes del inicio de la privación del sueño como candidatos para la inclusión. En ocasiones, el sueño de una mosca individual se distribuye de manera desigual a lo largo del día de 24 horas (por ejemplo, algunos individuos pueden obtener el 60-70% de su cuota de sueño durante el día y, por lo tanto, solo pierden una pequeña proporción de su cuota de sueño de 24 horas cuando se les priva durante 12 horas por la noche). Estas moscas se pueden evaluar por separado.
  8. Calcular el porcentaje medio de sueño recuperado (en relación con el valor basal) durante 12 h, 24 h y 48 h del período de recuperación para cada genotipo.
  9. A partir de los datos de sueño, calcule la duración promedio y máxima del sueño diurno en la línea de base y los días de recuperación para cada genotipo.
    NOTA: El sueño de rebote en las moscas se caracteriza por un aumento de la cantidad de sueño y una mayor profundidad del sueño en los días de recuperación. La consolidación del sueño se utiliza como medida de la profundidad del sueño. Los umbrales de excitación también podrían usarse como una medida de la profundidad del sueño.

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Results

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Canton S (Cs) se utilizó como una cepa de tipo salvaje. Las moscas se mantuvieron en un horario de luz de 12 h: 12 h de oscuridad y se privó de sueño durante 12 horas durante la noche. La inspección de los perfiles de sueño de las moscas Cs en el día basal (bs), el día de privación del sueño (sd) y dos días de recuperación (rec1 y rec2)(Figura 2A)sugiere que las moscas fueron efectivamente privadas de sueño en el SNAP, y recuperaron el sueño durante el día de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sueño en Drosophila se caracterizó de forma independiente en 2000, por dos grupos4,5. En estos estudios pioneros, las moscas se vieron privadas del sueño por un manejo suave (es decir, privación de la mano) y se demostró que exhiben una respuesta homeostática robusta a la privación del sueño durante la noche. Es importante destacar que con cualquier experimento de privación del sueño es crucial controlar los posibles efectos de confusión del método ut...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH 5R01NS051305-14 y 5R01NS076980-08 a PJS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de actividad locomotora
Cera de preparación de tejidosFisher Thermo Fisher13404-122Cera utilizada para sellar tubos
Tubos de vidrioWale Apparatus244050Cortamos vidrio Pyrex de 5 mm de diámetro  tubos en tubos de 65 mm de largo  para registrar el sueño. Tubos precortados  también se puede comprar.
Nutri Fly Bloomington Formulation alimento para moscasGenesee Scientific66-113Labs podría usar su propia receta de alimento para moscas. Es importante que el sueño se registre en la misma comida en la que se criaron las moscas.
Herramienta rotativa de corte de vidrioDremel Multi Pro395Se utiliza para cortar tubos de vidrio de 65 mm de largo 
Monitoring Sleep
datosLenovoIdea Centre AIO3Un ordenador equivalente de cualquier fabricante puede sustituir
a
TrikineticsDAM2Estos monitores se utilizan para registrar la actividad locomotora de las moscas
Monitor de entornoTrikineticsDEnMNo es esencial, pero es una forma fácil de monitorear las condiciones ambientales en la cámara donde se registra el sueño
Controlador de luzTrikineticsLC4Una forma conveniente de controlar el tiempo en que se enciende y apaga el SNAP Unidad de
interfaz de fuente de alimentación para DAMTrikineticsPSIU-9Necesario para que los ordenadores de adquisición de datos registren los datos de actividad locomotora de Trikinetics
Conector RJ117001-64PCLosmonitores DAM Multicomp aceptan conectores RJ11
DivisoresTrikineticsSPLT5Se utiliza para conectar hasta 5 monitores DAM
Cable telefónicoRadioshack278-367Cables telefónicos para adquirir datos de monitores DAM
Privación del sueñoFuente de
alimentaciónGw INSTEKGPS-30300 Fuente dealimentación para el
aparato anulador del sueñoTaller
DAM System y software DAMFileScan Trikinetics Software utilizado para adquirir datos de monitores DAM y guardar los datos adquiridos en un formato adecuado Ordenador de adquisición de los monitores de actividad Drosophila SNAP mecánico de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington

References

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Sleep DeprivationDrosophila SleepSleep Nullifying ApparatusSleep HomeostasisSleep RestrictionNegative GeotaxisArousal ThresholdsSleep ReboundActivity MonitoringSleep Consolidation

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