Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios

2.8K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/62115

⸱

28 de febrero de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla una investigación de las interacciones tempranas entre las células epiteliales nasales infectadas viralmente y la activación de células innatas. Los subconjuntos individuales de células inmunes se pueden distinguir en función de su activación en respuesta a infecciones virales. Luego se pueden investigar más a fondo para determinar sus efectos sobre las respuestas antivirales tempranas.

Resumen

Las interacciones tempranas entre la capa epitelial nasal y las células inmunes innatas durante las infecciones virales siguen siendo un área poco explorada. La importancia de la señalización de la inmunidad innata en las infecciones virales ha aumentado sustancialmente a medida que los pacientes con infecciones respiratorias que exhiben una alta activación innata de las células T muestran un mejor resultado de la enfermedad. Por lo tanto, la disección de estas interacciones inmunes innatas tempranas permite la elucidación de los procesos que las gobiernan y puede facilitar el desarrollo de posibles dianas terapéuticas y estrategias para amortiguar o incluso prevenir la progresión temprana de las infecciones virales. Este protocolo detalla un modelo versátil que se puede utilizar para estudiar la diafonía temprana, las interacciones y la activación de las células inmunes innatas a partir de factores secretados por las células epiteliales de las vías respiratorias infectadas viralmente. Utilizando un virus de la influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo de virus representativo, la activación celular innata de células mononucleares de sangre periférica cocultivadas (PBMC) se ha analizado mediante citometría de flujo para investigar los subconjuntos de células que se activan por los factores solubles liberados del epitelio en respuesta a la infección viral. Los resultados demuestran la estrategia de gating para diferenciar los subconjuntos de células y revelan las claras diferencias entre las poblaciones activadas de PBMC y su diafonía con el epitelio control e infectado. Los subconjuntos activados se pueden analizar más a fondo para determinar sus funciones, así como los cambios moleculares específicos de las células. Los hallazgos de dicha investigación de diafonía pueden descubrir factores que son importantes para la activación de poblaciones vitales de células innatas, que son beneficiosos para controlar y suprimir la progresión de la infección viral. Además, estos factores se pueden aplicar universalmente a diferentes enfermedades virales, especialmente a los virus recién emergentes, para amortiguar el impacto de dichos virus cuando circulan por primera vez en poblaciones humanas ingenuas.

Introducción

Los virus respiratorios se encuentran quizás entre los patógenos más extendidos que causan una grave carga sanitaria y económica. Desde los brotes mundiales periódicos de cepas epidémicas emergentes (por ejemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) hasta las cepas estacionales de influenza cada año, los virus son una amenaza constante para la salud pública. Aunque las vacunas constituyen la mayor parte de la respuesta a estos desafíos de salud pública mundial, es aleccionador observar que estas contramedidas son simplemente receptivas 1,2. Además, un retraso entre la aparición de una nueva cepa infecciosa y el desarrollo exitoso de su vacuna es inevitable3, lo que lleva a un período en el que las medidas disponibles para frenar la propagación del virus son muy limitadas.

Estos retrasos se enfatizan aún más por los costos que se infligen a la sociedad, económica y socialmente. Solo la gripe estacional es responsable de aproximadamente $ 8 mil millones en costos indirectos, $ 3.2 mil millones en costos médicos y 36.3 mil muertes en los Estados Unidos de América anualmente4. Esto es antes de considerar los costos de investigación que son necesarios para financiar el desarrollo de vacunas. Los brotes epidémicos tienen efectos aún más graves en la sociedad, agravados por la creciente tasa de globalización cada año, como lo demuestran las perturbaciones mundiales causadas por la aparición y rápida propagación del coronovirus del síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

Estudios recientes han demostrado que los pacientes infectados que tienen una mayor población de células T innatas activadas tienden a tener un mejor resultado de la enfermedad 8,9,10. Además, la población de células T innatas se clasifica en múltiples subgrupos: las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), las células T Vδ1 γδ, las células T Vδ2 γδ y las células T asesinas naturales (NKT). Estos subgrupos de células T innatas también exhiben heterogeneidad dentro de sus poblaciones, aumentando la complejidad de las interacciones entre las poblaciones celulares involucradas en la respuesta inmune innata11. Por lo tanto, el mecanismo que activa estas células T innatas y el conocimiento de los subgrupos específicos de células T innatas pueden proporcionar una vía diferente de investigación para reducir los efectos infecciosos de estos virus en el huésped humano, especialmente durante el período de desarrollo de la vacuna.

Las células epiteliales infectadas por la influenza producen factores que activan rápidamente las células T innatas 12,13,14. Sobre la base de ese hallazgo, este modelo de cocultivo de interfaz aire-líquido (ALI) sin contacto tiene como objetivo imitar las interacciones químicas tempranas (mediadas por factores solubles liberados por la capa epitelial infectada) entre la capa epitelial nasal infectada y los PBMC durante la infección temprana. La separación física entre la capa epitelial nasal (cultivada en insertos de membrana) y los PBMC (en la cámara inferior) y la integridad epitelial previenen la infección directa de los PBMC por el virus, lo que permite un estudio detallado de los efectos de los factores solubles derivados del epitelio en los PBMC. Por lo tanto, los factores identificados pueden investigarse más a fondo por su potencial terapéutico para inducir la población de células T innatas adecuada que puede proteger contra la infección por influenza. Por lo tanto, este artículo ha detallado los métodos para establecer un cocultivo para el estudio de la activación innata de células T a partir de factores solubles derivados del epitelio.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener recetas de los medios utilizados en este protocolo.
NOTA: Se ha encontrado que los hNECS cultivados en transwell de 12 pocillos crecen en un grosor más óptimo para que los factores solubles lleguen fácilmente a la cámara basal cuando se infectan con el virus de la influenza. Por lo tanto, se recomienda el uso de transwell de tamaño 12 pocillos para el cocultivo.

1. Establecimiento de la capa alimentadora 3T3

  1. Establecimiento a partir de existencias congeladas
    1. Descongelar un criovial de fibroblastos NIH/3T3 de cepas congeladas. Agregue el contenido del criovial a 2 ml de Medios Esenciales Mínimos (DMEM) completos de Dulbecco y resuspenda las células.
    2. Centrifugar durante 5 min a 300 × g y temperatura/presión ambiente (rtp), y retirar el sobrenadante. Resuspend las células en DMEM completo.
    3. Cuente las células usando tinción azul tripano. Añadir 10 μL de azul de tripano a 10 μL de la suspensión celular resuspendida. Mezcle bien y agregue 10 μL de la suspensión a un hemocitómetro para contar las células.
    4. Células de semillas a una densidad de 1 × 104 células/cm2 en una placa de cultivo apropiada (por ejemplo, matraz T75). Incubar el matraz de cultivo resultante durante 3 días a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 .
  2. Tratamiento con mitomicina C
    1. A los 3 días, asegúrese de que la confluencia sea del 60% al 80%, retire el medio y lave las células con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Es importante que la capa alimentadora 3T3 no alcance la confluencia total; de lo contrario, el tratamiento con mitomicina C no será efectivo.
    2. Añadir DMEM completo suplementado con mitomicina C al matraz e incubar durante 3,5 h a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 . Retire el medio que contiene mitomicina C y lave las células 2 veces con 1x PBS.
  3. Siembra de células 3T3 en placas de 6 pocillos
    1. Agregue 3 ml de 1x tripsina-EDTA al matraz durante 3-5 minutos para disociar las células. Recoja las células disociadas en un tubo fresco de 15 ml. Centrifugar el tubo de 15 ml durante 5 min a 300 × g, rtp; deseche el sobrenadante. Resuspend las células en DMEM completo.
    2. Cuente las células usando tinción azul tripano. Sembrar las células en una placa de 6 pocillos a 7.5 × 10 5-2.5 × 106 células/pozo. Incubar la placa durante la noche a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.
      NOTA: La capa alimentadora 3T3 se considera lista si las células están sanas. En este punto, sembra las células madre/progenitoras epiteliales nasales humanas (hNESPC) en la capa alimentadora para su expansión.
    3. Agregue DMEM completo al matraz e incube a 37 ° C, 5% de CO2 durante la noche para que las células 3T3 se recuperen del tratamiento con mitomicina C.

2. Establecimiento de un cultivo de células epiteliales nasales humanas (hNEC)

NOTA: Se deben obtener muestras clínicas de pacientes que estén libres de síntomas de infección del tracto respiratorio superior.

  1. Procesamiento de tejido nasal en suspensión unicelular
    1. Lavar el tejido nasal en 1x PBS de Dulbecco (dPBS) (PBS sin Mg2+ y Ca2+) que contenga 100 μL/ml de una mezcla antibiótico-antimicótica. Cortar el tejido en pequeños fragmentos y tratar la muestra en 10 mg/ml de una proteasa neutra durante la noche a 4 °C con agitación.
    2. Centrifugar durante 5 min a 200 × g, y retirar el sobrenadante después de la centrifugación. Incubar el pellet en 1-2 mL de 1x tripsina-EDTA (37 °C, 15 min), y apagar añadiendo un volumen de suero fetal bovino igual al 10% del volumen en el tubo.
    3. Disociar mecánicamente el tejido digerido en agregados unicelulares mediante pipeteo, y luego pasar la suspensión resultante a través de un colador de células de 70 μm. Resuspend las células en DMEM completo.
      NOTA: Después de este paso, la suspensión celular es una mezcla de células diferenciadas terminalmente y células madre que se conocen como células madre /progenitoras epiteliales nasales humanas (hNESPC). El objetivo de los pasos posteriores es seleccionar y enriquecer la población hNESPC a partir de la mezcla de diferentes poblaciones celulares.
  2. Siembra de una suspensión unicelular en la capa alimentadora 3T3 para la selección de hNESPC
    1. Centrifugar la suspensión celular del paso 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) y retirar el sobrenadante. Resuspendir las células en 3-5 mL de medio 3.
      NOTA: El medio 3 está formulado para promover el crecimiento selectivo de los hNESPC.
    2. Cuente las células a través de la tinción azul tripano. Sembrar 1 x 106 células en 2mL de medio 3 por pozo en una placa de 6 pocillos que contenga una capa alimentadora 3T3 preparada después de retirar el medio en la placa de 6 pocillos. Incubar el cocultivo resultante a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 .
      NOTA: Después de la siembra, tenga cuidado de no agitar la placa, ya que afectará la unión de los hNESPC.
    3. Cambie el medio 3 (2 ml) cada 2-4 días retirando el medio viejo por completo y reemplazándolo por medio fresco 3.
      NOTA: El medio se cambia para reponer los nutrientes y evitar que las condiciones demasiado ácidas influyan negativamente en el crecimiento de los hNESPC. El intervalo entre cada cambio de medio depende de qué tan ácido (amarillo) se vuelve el medio. Los intervalos deben acortarse si el medio se vuelve ácido rápidamente.
    4. Después de 7-10 días, observe que los hNESPC están en una confluencia adecuada para transferirlos a insertos de membrana. Ver Figura 1 para la morfología representativa de los hNESPC en 3 puntos de tiempo diferentes (2 días, 5 días y 10 días).
  3. Transferencia de hNESPC a insertos de membrana
    NOTA: Debido al tratamiento con mitomicina C, la capa alimentadora 3T3 se degradará lentamente durante el período de expansión de hNESPC. Esto resultará en una adhesión debilitada a la superficie del pozo, permitiendo su desalojo mediante el lavado con una pipeta, dejando solo atrás las hNESPC saludables.
    1. Retire el medio y agregue 500 μL de 1x dPBS a cada pocillo. Enjuague las células 3x con una micropipeta para desalojar las células 3T3 y deseche el 1x dPBS. Observe bajo el microscopio que las hNESPC redondas permanecen mientras que la capa alimentadora 3T3 en forma de huso se desaloja.
    2. Agregue 500 μL de un reactivo de disociación celular por pozo e incube a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 5-10 min, o hasta que los hNESPC se hayan desprendido de la superficie del pozo.
    3. Recoja la suspensión hNESPC, la centrífuga (300 × g, 5 min, rtp) y retire el sobrenadante.
    4. Resuspendir el pellet en medio 3. Cuente las células a través de la tinción azul tripano. Semilla 3 × 104 células en 150 μL de medio 3 por inserto de membrana (placa de 24 pocillos) o 1 × 105 células en 300 μL de medio 3 por inserto de membrana (placa de 12 pocillos) (Figura 2). Incubar las células a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 .
    5. Cambie el medio (medio 3) de las cámaras apical y basal cada 2 días. Navegue por la punta de una pipeta entre los brazos de soporte del inserto de membrana para acceder a la cámara basal, retire el medio antiguo y luego vuelva a introducir el medio fresco por el mismo método. Aunque la cámara apical es fácilmente accesible, tenga cuidado de no perturbar la capa de hNESPC en crecimiento.
      NOTA: No perturbe el medio en la cámara apical durante al menos 2 días después de la siembra, ya que las células necesitan tiempo para adherirse a la membrana.
  4. Diferenciación de hNESPCs en hNECs
    1. Cuando los hNESPC alcancen el 100% de confluencia (aproximadamente 3-7 días desde la siembra en el inserto de membrana), comience el cultivo de ALI. Cambie el medio basal por medio de diferenciación y retire el medio de la cámara apical. Solo agregue medio a la cámara basal sin agregarlo a la cámara apical al cambiar el medio cada 2-3 días, como se indica en la Figura 3 y el paso 2.3.5.
      NOTA: El medio se cambia a medio de diferenciación para promover la diferenciación de los hNESPC en hNEC en ALI. Los hNESPC tardan aproximadamente 3-4 semanas en alcanzar la madurez completa para convertirse en hNEC en ALI, momento en el que las células habrían crecido en una multicapa con diferentes poblaciones de células en cada capa. Los cilios también deben observarse a un aumento de 400x (los cilios se pueden identificar por su movimiento de latido, lo que hace que el campo del microscopio parezca que está vibrando). En este punto, las células están listas para ser utilizadas para los experimentos de cocultivo. Consulte la Figura 4 para ver la sección transversal de una capa hNEC totalmente diferenciada.
    2. Después de obtener hNEC maduros, lave las células en la cámara apical 3x con 1x dPBS a intervalos de 2-3 días durante 1 semana antes del experimento de cocultivo. Sinergice el paso de lavado con los cambios del medio basal y realice los lavados de la siguiente manera.
      1. Añadir 50 μL (24 pocillos)/150 μL (12 pocillos) de 1x dPBS en la cámara apical del inserto de membrana, e incubar las células a 37 °C durante 10 min. Retire el dPBS después de 10 minutos de incubación para eliminar el moco acumulado y las células muertas en el transcurso de la diferenciación.
        NOTA: Dependiendo de la naturaleza del experimento, la solución de bicarbonato de sodio se puede utilizar para lavar la capa de moco por completo. Sin embargo, para la infección viral en experimentos de cocultivo, la capa de moco se retiene y solo se elimina el exceso de moco con el lavado de dPBS. Esta retención es para imitar la capa de moco fisiológico presente en los epitelios nasales que interactuarán con la infección viral entrante.

3. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

NOTA: La confirmación de la integridad epitelial es importante para garantizar que se obtenga una capa epitelial intacta y saludable. Una capa epitelial intacta se determina a través de la medición TEER realizada en 4 pozos aleatorios utilizando un voltohmómetro.

  1. Enjuague el electrodo con etanol al 70% y esterilícelo con luz ultravioleta durante 15 minutos antes de usarlo para garantizar la esterilidad. Enjuague con 1x dPBS después de la esterilización.
  2. Agregue 100 μL (para 24 pocillos) o 300 μL (para 12 pocillos) de 1x dPBS a la cámara apical del inserto de membrana. Incubar la placa a 37 °C durante 10 min; a continuación, quite el dPBS.
  3. Para cada pozo a medir, prepare un pozo no utilizado con 1 mL (para 24 pocillos) o 3 mL (para 12 pocillos) de medio de diferenciación precalentado (a 37 °C). Coloque el inserto de membrana en el pozo preparado y agregue 200 μL (para 24 pocillos) o 600 μL (para 12 pocillos) de medio de diferenciación precalentado a la cámara apical. Equilibrar a 37 °C (sujeto a la temperatura de incubación del tipo de virus añadido, por ejemplo, 35 °C para la gripe) durante 15 min.
    NOTA: Prepare un espacio en blanco (inserto de membrana vacío) de la misma manera para el cálculo del TEER.
  4. Equilibre un tubo de 15 ml de medio de diferenciación precalentado a la misma temperatura durante 15 minutos también. Coloque los electrodos en el tubo de 15 ml y encienda el voltímetro.
    NOTA: En este punto, la lectura debe ser de 0 resistencia, ya que los electrodos están en el mismo medio. Si se obtiene cualquier otra lectura, equilibre el electrodo en el tubo de 15 ml hasta que la lectura sea 0.
  5. A partir del espacio en blanco, coloque los electrodos en cada pozo de tal manera que un electrodo esté sumergido en el medio de la cámara apical y el otro en el medio de la cámara basal. Registre la lectura solo cuando se obtenga una lectura constante durante un período de al menos 5 minutos.
  6. Después de cada medición, lave el electrodo con PBS antes de la siguiente medición. Para cada pozo probado, tome medidas para tres muestras en diferentes posiciones de la membrana. Para calcular el TEER neto de cada muestra, reste la resistencia de fondo, dada por el inserto de membrana en blanco, de cada medición.
  7. Calcule la lectura total de TEER para un pozo utilizando la siguiente ecuación:
    Integridad epitelial (Ωcm2) = TEER neto (ohmios) × Área de membrana (cm2)
    NOTA: Los valores TEER de los hNEC para experimentos de infección viral deben ser >1000 Ωcm2 13,15,16. 

4. Aislamiento de monocitos de sangre periférica y células NK

NOTA: Las muestras de sangre deben obtenerse de voluntarios sanos y usarse el mismo día del aislamiento.

  1. Recolectar 30-40 ml de sangre total de cada donante en tubos de recolección de sangre de 10 ml.
  2. Aísle los PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad y obtenga PBMC de la capa buffy después de los siguientes pasos (consulte también la Tabla de materiales).
    1. Mezcle bien ~ 10 ml de sangre del tubo de recolección de sangre en un vacutainer antes de diluir con un volumen igual de solución salina equilibrada (PBS).
    2. Agregue 15 ml de medio de gradiente de densidad a la base de un tubo de 50 ml.
      NOTA: La relación entre el medio de gradiente de densidad y la sangre diluida debe ser de 2: 3-3.5.
    3. Capa 35 ml de sangre diluida en el medio de gradiente de densidad con una pistola de pipeta (con el ajuste de dispensación ajustado al más bajo posible) inclinando el tubo 45 ° y permitiendo que la sangre diluida caiga gota a gota sobre la pared interna del tubo para que la capa de medio de gradiente de densidad no se altere.
    4. Lisado centrífugo a 500 × g, 18-20 °C durante 30 min (freno: apagado). Retire y deseche cuidadosamente la capa de plasma superior sin perturbar la capa inferior.
    5. Transfiera la capa buffy a un nuevo tubo sin mezclar la capa de glóbulos rojos, la capa media de densidad de gradiente o la capa buffy. Una vez que la capa buffy se haya recogido en un nuevo tubo de 50 ml, rellene el volumen a 50 ml con 1x PBS.
    6. Lisar centrifugar a 800 × g, 18-20 °C, 8 min (freno: apagado), y retirar el sobrenadante con una pistola pipeta. Resuspendir el pellet celular con 50 mL de 1x PBS, y centrifugar a 120 × g, 18-20 °C, 10 min para eliminar las plaquetas.
    7. Deseche el sobrenadante mediante pipeteo, sin perturbar la bolita celular.
      NOTA: Como el pellet celular puede estar suelto, no es aconsejable desechar el sobrenadante vertiendo.
    8. Resuspend el pellet celular con medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) completo. Realice un recuento celular agregando 10 μL de ácido acético al 3% con azul de metileno a 10 μL de la suspensión celular resuspendida. Mezcle bien y agregue 10 μL de la mezcla a un hemocitómetro para contar las células.
  3. Diluir PBMC con medio RPMI completo a una densidad de 2 × 106/mL (para 24 pocillos) o 4 × 106/ml (para 12 pocillos).

5. hNEC Infección viral y transición a hNEC:PBMC cocultivo

NOTA: El H3N2 (A/Aichi/2/1968) se utiliza como cepa representativa de la infección en este protocolo. La multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 se utiliza como MOI representativo en este protocolo.

  1. Día 0 (Infección de hNECs)
    NOTA: Se utiliza un pocillo de los hNEC cultivados a partir del mismo donante para obtener un recuento de células representativo por cada pozo utilizado en el experimento.
    1. En el pozo representativo, agregue 150 μL de 1x tripsina-EDTA a la cámara apical del inserto de membrana y 350 μL de 1x tripsina-EDTA a la cámara basal, e incube a 37 °C durante 10 min, o hasta que las células se desprendan de la membrana.
    2. Enjuague las células de la membrana mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo, y recoja la suspensión en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Agregue 200 μL de DMEM completo para apagar la actividad de tripsina. Contar las células mediante tinción azul tripano para obtener el recuento de células por pozo.
    3. Calcule el MOI requerido del virus en función del recuento de células por pozo y diluya el stock de virus en consecuencia con RPMI completo en hielo.
      NOTA: MOI 0.1 de 1.26 × 106 hNEC por pozo = 1.26 × 105 partículas virales H3N2 por pozo en 30 μL (para 24 pocillos)/100 μL (para 12 pocillos)
    4. Para los pocillos restantes para el experimento de infección, agregue 50 μL (para 24 pocillos)/150 μL (para 12 pocillos) de 1x dPBS en las cámaras apicales de los insertos de membrana, incube a 37 °C durante 10 min y retire el 1x dPBS.
    5. Cambie el medio basal en los insertos de membrana a un medio RPMI completo transfiriendo los insertos a una nueva placa con RPMI completo agregado a los pozos (350 μL (para 24 pocillos)/700 μL (para 12 pocillos)).
      NOTA: Cuando los hNESPC se han diferenciado completamente de los hNEC, son tolerantes/permisivos a diferentes medios durante un máximo de 72 h, sin cambios en la morfología u organización cuando el medio se cambia a RPMI12. RPMI se utiliza para apoyar el crecimiento y mantenimiento de la población de PBMC.
    6. Agregue los 30 μL preparados (para 24 pocillos)/100 μL (para 12 pocillos) del inóculo del virus en la cámara apical del inserto de membrana, incube a 35 °C en una atmósfera de 5% de CO2 durante 1 h y retire el inóculo viral de la cámara apical.
    7. Cambie el medio basal del inserto de membrana a un medio RPMI completo fresco e incube a 35 °C en una atmósfera de 5% de CO2 durante 24 h.
  2. Día 1 (establecimiento de cocultivos hNEC + PBMC)
    1. Sembrar el número requerido de PBMC en 150 μL (para 24 pocillos)/300 μL (para 12 pocillos) de medio RPMI completo agregando directamente la suspensión de PBMC en la cámara basal de cada pocillo de hNEC no infectados o infectados a partir del Día 0 (1.5 × 10 6 para placasde 24 pocillos y 3 × 106 para placas de 12 pocillos). Incubar a 37 °C durante 24/48 h.
      NOTA: El volumen final en la cámara basal después del establecimiento del cocultivo es de 500 μL (para 24 pocillos)/1000 μL (para 12 pocillos).
  3. Días 2-3 (recolección de PBMCs 48/72 h post-infección viral)
    1. Recolección de sobrenadantes apicales (48/72 h post-infección viral)
      1. Añadir 50 μL (para 24 pocillos)/150 μL (para 12 pocillos) de 1x dPBS a cada cámara apical, e incubar a 37 °C durante 10 min. Recoja el 1x dPBS en tubos de 1,5 ml. Alícuota 25 μL (para 24 pocillos)/50 μL (para 12 pocillos) del sobrenadante para ensayo de placa en un nuevo tubo de 1,5 ml, y congelar inmediatamente tanto la cepa como las alícuotas a -80 °C.
    2. Recolección de ARN celular de hNEC (48/72 h de infección post-viral)
      1. Transfiera el inserto de membrana a un pozo limpio, agregue 300 μL (para 24 pocillos)/600 μL (para 12 pocillos) de tampón de lisis de ARN a la cámara apical e incube a rtp durante 5 min. Recoger el sobrenadante en un tubo centrífugo de 1,5 ml y almacenarlo a -80 °C hasta la extracción de ARN para su análisis molecular.
    3. Recolección de PBMCs (48/72 h post-infección viral)
      1. Con la base ancha de una punta de pipeta estéril, raspe suavemente la superficie del pozo para desalojar los PBMC activados que pueden estar adheridos a la superficie del pozo. Recoja el medio basal que contiene PBMC en un tubo centrífugo de 2 ml.
      2. Enjuague los pocillos 2x con 300 μL de 1x dPBS, y recoja el lavado en el mismo tubo de 2 mL. Centrifugue el tubo de 2 ml (500 × g, 5 min, rtp) y recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 2 ml sin molestar la bolita celular. Almacenar el sobrenadante a -80 °C para el análisis de citoquinas y quimiocinas; resuspendir el pellet celular en 200 μL de 1x dPBS.

6. Citometría de flujo

NOTA: Esta sección del protocolo se continúa directamente desde la sección anterior utilizando la suspensión de celdas PBMC del paso 5.3.3.2. Asegúrese de una exposición mínima a la luz durante los siguientes pasos de esta sección. En la Tabla 2 se puede encontrar un panel de muestra de marcadores de tinción superficial.

  1. Tinción superficial
    1. Transfiera el pellet de célula PBMC resuspendido a una placa de pozo inferior de 96 V. Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min, y retirar el sobrenadante.
    2. Incubar todos los PBMC (excepto los "no manchados") con 100 μL de una tinción de viabilidad durante 15 min a rtp. Recargue hasta 200 μL con 150 μL de búfer de clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min, y desechar el sobrenadante.
    3. Preparar un panel de anticuerpos de tinción superficial de interés con ratios de dilución adecuados y un volumen final de 50 μL por reacción (recarga con tampón MACS para obtener el volumen final). Realice la tinción superficial agregando 50 μL de la mezcla de anticuerpos preparada a las células utilizando una pipeta multicanal. Incubar a 4 °C durante 15 min en la oscuridad.
    4. Lavar añadiendo 150 μL de tampón MACS. Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min, y desechar el sobrenadante. Si no se requiere tinción intracelular, proceda directamente a la incubación de 15 minutos en el paso 6.3.
  2. Tinción intracelular (si es necesario)
    1. Añadir 100 μL de una solución de fijación y permeabilización a cada pocillo. Incubar a 4 °C durante 20 min en la oscuridad. Rellene los pozos con 100 μL de 1x búfer MACS.
    2. Centrifugar (800 × g, 3 min, 25 °C), y retirar el sobrenadante. Repita el lavado agregando 200 μL de tampón de lavado de permeabilización 1x. Centrifugar (500 × g, 3 min, 25 °C), y retirar el sobrenadante.
    3. Preparar las diluciones para el panel de anticuerpos de interés para lograr un volumen final de 50 μL utilizando 1x tampón de lavado de permeabilización. Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Añadir 200 μL de tampón de lavado de permeabilización 1x.
    4. Centrifugar las células (800 × g, 3 min, 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspend las células en 100 μL de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia.
  3. Pipetear 200 μL de una solución de lisado en cada pozo. Incubar durante 15 min a rtp. Centrifuga lisar a 800 × g durante 3 min y desechar el sobrenadante.
  4. Resuspendir los gránulos celulares en 200 μL de tampón MACS. Realice citometría de flujo de acuerdo con los ajustes descritos anteriormente13, o guárdelo a 4 °C en la oscuridad.

7. Determinación de los niveles de citoquinas y quimiocinas

  1. Procesar 25 μL del sobrenadante de cámara basal utilizando un ensayo multiplex de inmunología de acuerdo con el protocolo del fabricante18.
  2. Calcule la concentración de cada analito utilizando el software multiplex manager utilizando un algoritmo de ajuste de curvas (5 parámetros) para la curva estándar.

8. Evaluación de la contaminación viral

  1. Extraer ARN viral utilizando un kit de extracción en 4 juegos de soluciones: la solución H3N2 madre, la dilución MOI 0.1 para la infección, las diluciones en serie 10x del MOI 0.1 y el medio basal de las muestras (infección post-viral de 48 y 72 h)12.
  2. Seleccionar el gen no estructural (NS1) y la matriz (M1) como objetivos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (consulte la Tabla de materiales para los cebadores utilizados en el experimento representativo).
  3. Realizar PCR de transcripción inversa (RT-PCR) (42 °C, 60 min) para convertir el ARN viral en ADNc antes de realizar PCR cuantitativa (qPCR) para medir los niveles de NS1 y M1 como proxy de la presencia viral, y correlacionar los niveles con la curva estándar obtenida de la RT-qPCR realizada en la dilución en serie 10x de la alícuota MOI 0.1. Consulte la Tabla 3 para la composición de las mezclas de reacción y utilice las siguientes condiciones: preincubación a 95 °C durante 10 min, seguida de una amplificación en 3 pasos durante 40 ciclos: 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 10 s, 72 °C durante 30 s; curva de fusión: 95 °C durante 10 s, 65 °C durante 60 s y 97 °C durante 1 s.

9. Ensayo de placa

  1. Día 0: siembra MDCK (Riñón Canino Madin Darby) en placas de 24 pocillos
    1. Retire el medio de un matraz T75 de células MDCK confluentes. Lave 2x con 1x PBS para eliminar todos los rastros de suero. Tripsinizar las células MDCK añadiendo 10 ml de tripsina e incubando a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 durante 20-30 min hasta que las células se desprendan.
      NOTA: No toque el matraz, ya que esto podría provocar aglomeraciones.
    2. Pipetear la suspensión celular en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de medio esencial mínimo (EMEM) completo de Eagle. Centrifugar (300 × g, 5 min, rtp), y retirar el sobrenadante.
    3. Resuspend las células en 6 mL de EMEM completo. Cuente las células por tinción azul tripano.
    4. Diluir la suspensión de células MDCK a una concentración de 1 × 105 células/ml, y sembrar 1 ml de la suspensión diluida en cada pocillo de una placa estéril de 24 pocillos. Incubar a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 24 h para obtener una monocapa confluente de células MDCK en cada pozo.
  2. Día 1: infección de células MDCK
    1. Prepare el medio de infección. Retire el medio de la monocapa MDCK en la placa de 24 pocillos y lave 2x con 1x dPBS. Para el segundo lavado, deje el PBS en los pozos mientras prepara diluciones en serie del virus.
    2. Descongele las muestras de virus en hielo y diluya en serie en una placa de 24 pocillos para lograr diluciones en serie de 10-1 a 10-6.
      NOTA: Como ejemplo, llene cada pozo en una placa de 24 pocillos con 270 μL de medio de infección.
    3. Agregue 30 μL de la muestra del virus al primer pozo de la fila. Con una nueva punta de pipeta, mezcle bien y transfiera al siguiente pozo de la fila para diluir la muestra 10 veces. Proceda hasta que se haya logrado una dilución de 10-6 ; realice los pasos 9.2.1-9.2.3 para todas las muestras de virus.
    4. Retire el PBS de la placa MDCK e infecte por duplicado con 100 μL de las diluciones virales preparadas. Para los pocillos de control, agregue 100 μL del medio de infección (sin la muestra viral). Incubar a 35 °C en una atmósfera de 5% de CO2 durante 1 h, agitando la placa para eliminar las manchas secas cada 15 min.
    5. Retire el inóculo viral y agregue 1 ml de superposición líquida para cada pocillo. Incubar a 35 °C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 72 h.
  3. Día 4 (72 h post-infección): visualización de la placa
    1. Retire la capa líquida y fije las células con formaldehído al 4% en 1x PBS durante 1 h. Retire la solución de formaldehído y lave una vez con 1 pbS o agua destilada.
    2. Secuñera las células fijas agregando una solución violeta de cristal al 1% durante 15 min. Retire el tinte violeta cristalino y lave las células con agua corriente. Secar la placa a rtp.
    3. Una vez seco, cuente las placas y calcule el título viral de acuerdo con la siguiente fórmula:
      Número de placas × factor de dilución = Número de placa - Unidades formadoras en 100 μL

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Aunque las células T convencionales forman el repertorio principal de respuesta inmune adaptativa contra la infección viral para facilitar el aclaramiento viral, la población de células T innatas trabaja en un espectro más amplio para suprimir la carga viral para una eliminación efectiva en una etapa posterior. Por lo tanto, este protocolo crea específicamente una condición robusta para estudiar las células T innatas, su activación y su población funcional después de la infección por infl...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Las respuestas inmunes innatas contra los virus son un campo de estudio poco investigado en el manejo de antivirales. Las células epiteliales de las vías respiratorias y las células inmunes innatas trabajan en conjunto para suprimir la replicación viral durante una infección, además de servir como determinante de la respuesta adaptativa hiperactiva si la carga viral no se mantiene bajo control 12,13,17. Sin embargo, el desarroll...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al personal de investigación en el Departamento de Otorrinolaringología de NUS y el Departamento de Microbiología e Inmunología por su ayuda con el trabajo relacionado con el cultivo y el cultivo viral de hNEC. También nos gustaría agradecer a los cirujanos y al equipo quirúrgico del Hospital universitario nacional, Departamento de Otorrinolaringología, por su ayuda en el suministro de las muestras de células y sangre necesarias para el estudio.
Este estudio fue financiado por el Consejo Nacional de Investigación Médica, Singapur No. NMRC/CIRG/1458/2016 (a De Yun Wang) y MOH-OFYIRG19may-0007 (a Kai Sen Tan). Kai Sen Tan ha recibido el apoyo de la beca de investigación European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) 2019.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5% tripsina-EDTAGibco15400-054
0,5 M Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 8,0, sin RNasaThermofisherAM9260G0,5M EDTA
1,5 mL Tubos SafeLockEppendorf00301200861,5 mL Tubo de centrífuga
10 mL K3EDTA Vacutainer BD36664310mL Tubos de extracción de sangre
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
Cordón de placa de 12 pocillos 3513
Inserto Transwell de 12 pocillosCorning Inserto de membrana3460
1x FACS Solución de lisisBD349202
2,0 mL Tubos SafeLockEppendorf0030120094tubo de centrífuga de 2 mL
24 pocillos PlateCorning 3524
Inserto Transwell de 24 pocillosCorning 3470
Ácido Acético al 3% con Azul de MetilenoSTEMCELL Technologies07060
3,3',5-triyodo-l-tironinaSigmaT-074
Solución de formaldehído al 37% con 15% de metanol como estabilizador en H2OSigma533998
5810R CentrífugaEppendorf5811000320
5 mL de polipropileno tubos (tubos de flujo)BD352058
70 µ m Filtro de celdasCorning 
A-4-62 RotorEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501Reactivo de disociación celular
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolímeroNASuperposición de líquido
Bio-Plex Manager 6.2 Software estándarBio-Rad Laboratories, Inc171STND01Multiplex Manager Software
Aguja de mariposa 21 gBD367287
Cólera ToxinaSigmaC8052
Cristal Violeta MerckC6158
Cytofix/Cytoperm SoluciónBD554722Solución de Fijación y Permeabilización Dispasa
IISigmaD4693Proteasa Neutra
DMEM/Alta GlucosaGE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/Mezcla de nutrientes F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (con L-Glutamina)ATCC30-2003
EVOM dispositivo voltohmímetroWPI, Sarasota, FL, EE. UU. 300523
FACS Solución de lisadoBD3492021x Solución de lisis
Tubo Falcon 15mL CellStar18827115 mL
Tubo Falcon 50mL CellStar22726150 mL Tubo
Fast Start Sondas de ADN EsencialesRoche6402682001qPCR Master Mix
Ficoll Paque PremiumResearch Instruments17544203Medios de gradiente de densidad
H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 Secuencia de cebadores hacia adelanteSigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 Secuencia de cebadores inversosSigma5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 Secuencia de cebadores hacia adelanteSigma5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 Secuencia de cebadores inversaSigma5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'Suero
bovino fetal inactivado por calorGibco10500-064
hNESPCsDonantes HumanosNA
Factor de Crecimiento Epitelial HumanoGibco-InvitrogenPHG0314
Hidrocortisona Tecnologíascélulas madre7925Recolectado de biopsias nasales durante cirugías
de desviación septalInsulinaSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001Instrumento qPCR
Vivo/MUERTO Kit de tinción de células azules *para excitación UVThermofisherL23105Tinción de viabilidad
MILLIPLEX MAP Citocina humana/quimiocina Panel de perlas magnéticas II - Premezclado 23 Plex MerckPte LtdHCP2MAG-62K-PX23Ensayo Multiplex de Inmunología
Mitomicina CSigmaM4287
M-MLV 5x TampónPromegaM1705RT-PCR 5x Tampón
M-MLV Transcriptasa InversaPromegaM1706Transcriptasa Inversa
N-2 suplementoGibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Tampón de Perm/LavadoBD554723Permeabilización Tampón de lavado
PneumaCult-ALI 10x SuplementoSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Medio basalSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Suplemento de mantenimiento (100x)STEMCELLTechonologies5001
Random PrimersPromegaC1181Random Primers Rnasin
Recombinante Inhibidor de la RnasaPromegaN2511Inhibidor de ARNasa ARN
Lysis BufferQiagenParte de 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamina)ATCC30-2001
STX2 electrodosWPI, Sarasota, FL, EE. UUElectrodoSTX2
Matraz T25Corning430639
T75 MatrazCorning430641U
TPCK TripsinaSigmaT1426
Trypan Blue HycloneSV30084.01
Kit de extracción de ARN viralQiagen52904Kit de extracción de ARN viral
en forma de V Placa de 96 pocillosCorning3894
431751 Master de .

Referencias

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132(2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11(2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653(2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706(2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514(2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986(2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685(2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130(2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Activación inmunitaria innatacélulas epiteliales nasalescélulas T innatascélulas mononucleares de sangre periféricacitometría de flujoinfección por virus de la influenzacomunicación inmunitaria epitelialanálisis de citocinas
Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.