Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.
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Artículo de método
Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica
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Resumen
Resumen
Este protocolo describe un método para obtener fracciones de proteínas subcelulares de células de mamíferos utilizando una combinación de detergentes, lisis mecánica y centrifugación de gradiente de densidad isopícnica. La principal ventaja de este procedimiento es que no se basa únicamente en el uso de detergentes solubilizantes para obtener fracciones subcelulares. Esto hace posible separar la membrana plasmática de otros orgánulos unidos a la membrana de la célula. Este procedimiento facilitará la determinación de la localización de proteínas en las células con un método reproducible, escalable y selectivo. Este método se ha utilizado con éxito para aislar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana plasmática de la línea celular de monocitos humanos, U937. Aunque optimizado para esta línea celular, este procedimiento puede servir como un punto de partida adecuado para el fraccionamiento subcelular de otras líneas celulares. Se discuten las posibles dificultades del procedimiento y cómo evitarlas, al igual que las alteraciones que pueden necesitar ser consideradas para otras líneas celulares.
Introducción
El fraccionamiento subcelular es un procedimiento en el que las células se lisan y se separan en sus componentes constituyentes a través de varios métodos. Esta técnica puede ser utilizada por los investigadores para determinar la localización de proteínas en células de mamíferos o para el enriquecimiento de proteínas de baja abundancia que de otro modo serían indetectables. Si bien actualmente existen métodos para el fraccionamiento subcelular, al igual que los kits comerciales que se pueden comprar, sufren de varias limitaciones que este procedimiento intenta superar. La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular son exclusivamente a base de detergente
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Protocolo
1. Preparar tampones y reactivos
- Prepare soluciones frescas de inhibidores de la fosfatasa y la proteasa.
- Agregue 17.4 mg de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 ml de etanol al 100% para preparar un stock de 100 mM.
NOTA: Use equipo de protección cuando manipule PMSF, ya que es peligroso cuando se ingiere o inhala y al entrar en contacto con la piel o los ojos. Es corrosivo para los ojos y la piel. - De acuerdo con las instrucciones del fabricante, prepare un cóctel de inhibidores de la proteasa disponible comercialmente (100x).
- Agregue 91.9 mg de ortovanadato de sodio (SOV) a 1 ml de agua desionizada para preparar un st....
- Agregue 17.4 mg de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 ml de etanol al 100% para preparar un stock de 100 mM.
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Resultados
Un diagrama de flujo esquemático de este procedimiento (Figura 1) resume visualmente los pasos que se tomaron para fraccionar con éxito las células U9375 cultivadas en suspensión. Las fracciones recogidas de la parte superior del gradiente de densidad isopícnica en volúmenes iguales (1 mL) muestran la purificación de las fracciones mitocondrial y de membrana (Figura 2). La utilización de un anticuerpo contra VDAC, una proteína localizada .......
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Discusión
Este método es una versión modificada de un enfoque previamente publicado para el fraccionamiento subcelular sin el uso de centrifugación de alta velocidad11. Este método modificado requiere un equipo más especializado para lograr los mejores resultados, pero es más completo y consistentemente reproducible.
El desarrollo del protocolo inicial fue necesario debido a la incapacidad de separar muestras mitocondriales y de membrana para el análisis de la localización de pro.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por NIH R15-HL135675-01 y NIH 2 R15-HL135675-02 a T.J.L.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Benzonase Nucleasa | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Mezclador de bala Homogeneizador de tejidos Next | Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonina | Sigma | D141 | |
| rotador de extremo a extremo | ThermoFisher | ||
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Tecnologías de señalización celular | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexilenglicol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Detergente no iónico y no desnaturalizante |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Manitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPasa a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Tubos Polyclear abiertos, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Medio de gradiente de densidad | Sigma | D1556-250ML | |
| fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa, uso general | Centrífuga refrigerada VWR | M221-1ML | |
| cubo oscilante | |||
| Sigma | 436143 | ||
| Desoxicolato de sodio | Sigma | D6750 | |
| ortovanadato de sodio (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicador | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrífuga | ThermoFisher | ||
| Perlas de acero inoxidable 3,2 mm | Siguiente Advance | SSB32 | |
| Sacarosa | Sigma | S0389 | |
| Solución salina tamponada con tris (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | detergente no iónico en tampones Western blot | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Referencias
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 5/31/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
