Inyección intraespinal de células madre mesenquimales humanas y seguimiento de su migración al cerebro de rata

Resumen

Se pueden utilizar varias vías de administración para administrar células madre mesenquimales (MSC) al cerebro. En el presente estudio, las MSC se administraron a través del eje neural y el cerebro a través de la inyección en la cavidad espinal. Las MSC se inyectaron en las cavidades espinales de ratas y se rastreó y cuantificó la migración de células madre.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) se han estudiado para el tratamiento de diversas enfermedades. En las enfermedades neurodegenerativas que implican defectos tanto en el cerebro como en la médula espinal, la vía de administración es muy importante, ya que las MSC deben migrar tanto al cerebro como a la médula espinal. Este artículo describe un método para administrar MSC en el canal espinal (inyección intraespinal en la cavidad espinal) que puede dirigirse al cerebro y la médula espinal en un modelo de rata. Se inyectaron un millón de MSC en los canales espinales de ratas a nivel de las vértebras lumbares 2-3. Después de la administración, las ratas fueron sacrificadas a las 0, 6 y 12 h después de la inyección. Se utilizaron imágenes ópticas y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) para rastrear las MSC inyectadas. Los resultados del presente estudio demostraron que las MSC administradas a través de la cavidad espinal pudieron detectarse posteriormente tanto en el cerebro como en la médula espinal a las 12 h. La inyección intraraquídea tiene la ventaja de no requerir anestesia general y tiene pocos efectos secundarios. Sin embargo, hay que superar el inconveniente de la baja tasa de migración de las MSC al cerebro.

Introducción

Células madre mesenquimales
En condiciones de enfermedad, las MSC secretan sustancias terapéuticas específicas de la enfermedad a través de acciones paracrinas¹ que se ha informado que regulan las respuestas inmunitarias, restauran los tejidos dañados y eliminan las sustancias tóxicas². Por lo tanto, la terapia MSC se considera más eficaz que la terapia de objetivo único en el tratamiento de enfermedades multifactoriales como la enfermedad de Alzheimer y la sarcopenia 3,4,5,6. Además, a diferencia de los productos farmacéuticos, las MSC tienen un efecto de referencia, moviéndose a la región del tejido dañado mediante el reconocimiento de citocinas inflamatorias o quimiocinas en el cuerpo ^7,8. Desafortunadamente, solo un subconjunto de las células llega al área dañada y la viabilidad de las MSC disminuye durante la migración 9,10,11,12. Por lo tanto, para maximizar la eficacia terapéutica de las MSC, es necesario administrar células viables al sitio objetivo. Por lo tanto, al administrar MSC, es importante elegir la vía de administración adecuada, en función de la naturaleza de la enfermedad objetivo.

Vía de inyección
Existen numerosas vías por las que se administran los agentes terapéuticos a los pacientes. Los métodos más comunes son la inyección intravenosa en la circulación sistémica, la administración oral y la inyección subcutánea o intramuscular. En las enfermedades neurodegenerativas, el principal obstáculo para la administración de agentes terapéuticos al cerebro es la barrera hematoencefálica (BHE). La BHE protege el cerebro de patógenos externos por medio de uniones estrechas entre los vasos sanguíneos y el parénquima cerebral^13,14. Sin embargo, paradójicamente, la BHE también impide que los agentes terapéuticos entren en el parénquima cerebral. Por lo tanto, el paso por la BHE es el principal obstáculo en el desarrollo de terapias para las enfermedades cerebrales^15,16. La inyección intracerebral se realiza para superar este inconveniente mediante la inyección de sustancias diana directamente en el cerebro mediante una operación quirúrgica 17,18,19. Sin embargo, se deben tener en cuenta los efectos secundarios de las intervenciones quirúrgicas, especialmente porque la aguja daña las células neuronales durante el procedimiento.

Administración de la cavidad intraespinal
La administración intratecal, la administración de fármacos en el canal espinal o en el espacio subaracnoideo, lleva los fármacos al cerebro o al eje neural a través del líquido cefalorraquídeo (LCR) y es una alternativa viable a la inyección intracerebral. Las inyecciones intratecales se pueden subdividir según el lugar de la inyección: ventrículo lateral, cisterna magna y cavidad espinal. Las tres rutas permiten que los medicamentos o las células se dispersen por todo el líquido cefalorraquídeo hacia el cerebro y la médula espinal. La administración del fármaco al cerebro puede ser más eficiente en el caso de las inyecciones intracerebroventriculares e intra-cisterna magna porque el agente se inyecta cerca del cerebro. Sin embargo, la inyección intraraquídea tiene las ventajas de no requerir anestesia general ni cirugía para la inserción de un reservorio intraventricular, siendo generalmente segura²⁰, y puede ser realizada repetidamente si es necesario.

El propósito de este estudio fue validar la administración intraespinal de la cavidad como un medio para administrar MSC tanto al cerebro como a la médula espinal. En primer lugar, se estableció la cavidad intraespinal en un modelo de rata. A continuación, las MSC se marcaron con un trazador lipofílico, DiD (DiIC18(5); 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobencenosulfonato), para evaluar la eficiencia de la migración de células madre a la médula espinal y al cerebro. Se realizaron imágenes ópticas ex vivo para evaluar la dispersión celular. Este sencillo protocolo se puede realizar sin intervención quirúrgica y se puede utilizar con el propósito no solo de administrar células madre, sino también productos farmacéuticos, anticuerpos, medios de contraste y otras sustancias destinadas a ser administradas a la médula espinal o al cerebro.

Protocolo

NOTA: Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Número de aprobación: 20170125001, Fecha: 25 de enero de 2017) del Instituto de Investigación Biomédica de Samsung (SBRI) en el Centro Médico Samsung. Como centro acreditado de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio International, el SBRI actúa de acuerdo con las pautas establecidas por el Instituto de Recursos para Animales de Laboratorio.

1. Preparación de MSCs derivadas de la gelatina humana de Wharton

1. Cultivo de células madre mesenquimales derivadas de la gelatina humana de Wharton (WJ-MSCs)
   1. Descongele rápidamente un vial de WJ-MSC humanas en un baño de agua a 37 °C. Transfiera las WJ-MSC a un tubo cónico de 50 mL y agregue medio de crecimiento a un volumen de al menos 10 veces el de las células (v/v). Pipetear hacia arriba y hacia abajo para suspender las células.
   2. Centrifugar a 300 × g durante 5 min. Deseche con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células.
      NOTA: Tenga cuidado de no desechar el pellet de celda.
   3. Siembre WJ-MSCs en matraces T175 a una densidad de 5.000-6.000 células/^cm2. Incubar las WJ-MSC en una incubadora de CO₂ a 37 °C. Cambie el medio de crecimiento cada 72 h hasta que las WJ-MSC alcancen el 80-90% de confluencia.
      NOTA: Por lo general, las MSC tardan entre 3 y 4 días en alcanzar el 80-90% de confluencia.
2. Subcultivo de WJ-MSCs humanas
   1. Deseche el medio de crecimiento y lave las células con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Retire el PBS y agregue 5 mL de ácido etilendiaminotetraacético disódico (EDTA) al 0,25% de tripsina (consulte la tabla de materiales). Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO₂ durante 3 min hasta que las WJ-MSCs se desprendan del matraz de cultivo.
   2. Añadir 5 mL de medio de crecimiento que contenga un 10% de suero fetal bovino para neutralizar el 0,25% de tripsina-EDTA. Recoja la mezcla de células y transfiérala a un tubo cónico de 50 ml. Lave el matraz de cultivo celular con 10 mL de medio de crecimiento y recoja las células en un tubo de 50 mL utilizando una pipeta serológica estéril.
   3. Centrifugar la mezcla de células a 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 10 ml de medio de crecimiento y cuente el número de WJ-MSC.
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no desechar el pellet de celda.
   4. Siembre WJ-MSCs a una densidad de 4.000-6.000 células/^cm2, dependiendo del experimento.
3. Marcaje de WJ-MSCs con colorante DiD y preparación de WJ-MSCs para inyección intraespinal
   NOTA: El procedimiento de etiquetado de colorante DiD se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante.
   1. Desconecte las WJ-MSC cuando alcancen el 80% de confluencia, utilizando el procedimiento mencionado anteriormente. Suspender WJ-MSCs a una densidad de 1 × 10⁶/mL en medio esencial mínimo (MEM) sin rojo fenol α sin suero.
   2. Agregue 5 μL de solución de etiquetado DiD por 1 mL de suspensión celular; Mezclar suavemente con el pipeteo.
   3. Incubar durante 15 min a 37 °C; Centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 5 min.
   4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las WJ-MSC en α MEM sin rojo fenol a una densidad de 1 × 10⁶/0,2 mL.

2. Inyección intraespinal de WJ-MSCs

1. Preparación para la inyección en la cavidad intraespinal
   1. Anestesiar ratas Sprague-Dawley de 6 semanas de edad con isoflurano al 5%; Luego, mantener la anestesia con isoflurano al 2% durante todo el procedimiento quirúrgico.
      NOTA: Optimice las condiciones anestésicas antes de iniciar el experimento.
   2. Afeita el área quirúrgica con una afeitadora eléctrica para animales pequeños.
      NOTA: La afeitadora eléctrica se puede reemplazar con una maquinilla de afeitar manual y gel de afeitar.
   3. Desinfectar el área quirúrgica con povidona yodada. Realice una incisión de 3 cm en la piel con una cuchilla quirúrgica. Reseca el resto de la piel y el tejido muscular con una cuchilla quirúrgica y unas tijeras. Revelan las apófisis espinosas en la lumbar 2-3 (L2-3).
2. Inyección de WJ-MSC marcadas con DiD a través de la cavidad intraespinal
   1. Coloca a la rata en posición prona. Flexiona la columna vertebral de la rata de manera apropiada para ampliar la distancia entre los procesos espinosos adyacentes, usando cantidades suficientes de papel u otros materiales que puedan ayudar a mantener la posición adecuada.
   2. Llene una jeringa de 1 mL con 0,2 mL de WJ-MSC marcadas con DiD. Coloque una combinación de jeringa y aguja de 23 G verticalmente entre las apófisis espinosas de L2 y L3, e inserte la aguja hasta que toque el cuerpo vertebral.
   3. Cuando la aguja toque el cuerpo vertebral, retírela aproximadamente 0,5 cm, colocando la punta de la aguja en el canal espinal. Incline la jeringa y coloque la punta de la aguja de manera que apunte hacia la dirección rostral. Inyecte WJ-MSC en la cavidad espinal durante un período de 1 minuto.
      NOTA: La velocidad de inyección debe optimizarse con anticipación.
   4. Después de la inyección, retire completamente la jeringa del canal espinal. Suturar la incisión y luego desinfectar el sitio quirúrgico con povidona yodada.
3. Tratamiento posterior al procedimiento
   1. Estabilice y sujete a la rata para evitar cualquier movimiento, colocándola boca abajo en un ángulo de 45° durante 15 minutos, mientras aún está bajo anestesia. Después de 15 minutos, suspenda la anestesia y espere a que la rata se despierte.

3. Evaluación de la inyección en la cavidad intraespinal

1. Eutanasia de las ratas y aislamiento del cerebro y la médula espinal a las 0, 6 y 12 h después de la inyección
   1. Anestesiar los animales de experimentación con isoflurano al 5%; mantener la anestesia con isoflurano al 2% durante la perfusión de PBS.
   2. Haga una incisión debajo del diafragma con unas tijeras quirúrgicas. Abra la incisión con fórceps y corte la caja torácica en sentido rostral para exponer el corazón.
   3. Haga un pequeño orificio en la aurícula derecha e inserte una aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo. Perfundir 100 ml de PBS frío en el ventrículo izquierdo durante 4-5 minutos, hasta que el hígado esté limpio de sangre.
   4. Después de la perfusión, haga una incisión larga en la parte posterior desde la cabeza hasta la cola con una cuchilla quirúrgica a lo largo del plano longitudinal. Aísle el cerebro restante y toda la columna vertebral con tijeras quirúrgicas, fórceps y un cortador de huesos. Retire las costillas restantes, los huesos conectados y la carne.
2. Imágenes ópticas fluorescentes DiD ex vivo
   1. Coloque los tejidos aislados en la cámara del dispositivo de imágenes ópticas.
   2. Ajuste los parámetros de la siguiente manera: emisión, 700 nm; excitación, 605 nm; y el tiempo de exposición, 2 segundos, como fotones por segundo por centímetro cuadrado por esteradián (p/s/cm²/sr). Captura las imágenes ópticas.
      NOTA: Todas las imágenes deben adquirirse con los mismos ajustes de iluminación (voltaje de la lámpara, filtros, f/stop, campo de visión y agrupación).
   3. Dibuja tres regiones rectangulares de interés (ROI) de tamaño equivalente para la médula espinal y un círculo ROI para el cerebro utilizando la herramienta de dibujo. Medir las intensidades fluorescentes de los ROIs.
3. Extracción de ADN genómico (ADNg) de la médula espinal y el tejido cerebral
   1. Retire el cráneo y la columna vertebral con cuidado con pinzas quirúrgicas, tijeras y un rongeur.
   2. Extraiga el cerebro y la médula espinal del cráneo y la columna vertebral. Corta la médula espinal en tres pedazos (cervical, torácico y lumbar).
      NOTA: Los tejidos recolectados deben almacenarse a -80 °C si no se analizan inmediatamente.
   3. Muele los pañuelos con un mortero preenfriado, un mortero y nitrógeno líquido. Extraiga el ADNg utilizando productos comerciales, siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) cuantitativa en tiempo real
   1. Cuantifique la cantidad de ADNg en cada muestra utilizando un espectrofotómetro.
   2. Realizar qPCR utilizando 10 ng de ADNg por muestra y cebadores humanos de Arthrobacter luteus (ALU) ^12,21.
   3. Calcule el número exacto de WJ-MSC en las muestras utilizando el método ΔΔC_T ²².

Resultados

Para evaluar la eficacia de la inyección intraespinal de MSCs en la cavidad espinal, en el presente estudio se utilizaron MSCs marcadas con DiD. Antes de inyectar MSCs en la cavidad espinal, se evaluó in vitro la eficacia del marcaje mediante imágenes ópticas y microscopía de fluorescencia (Figura 1). Después de teñir las MSC con el reactivo de marcaje DiD utilizando el procedimiento descrito en la sección 3.1 del protocolo, se tomaron imágenes ópticas de las placas de cultivo en las que se ...

Discusión

La vía de administración óptima para el tratamiento de las MSC debe elegirse en función de la enfermedad objetivo, el estado del paciente y el tipo de fármaco que se va a administrar. En las terapias celulares, incluida la terapia MSC, se debe considerar la inyección directa de células madre en el cerebro o por vía intratecal a través del LCR, ya que las células no pueden pasar a través de la BBB¹⁹. La inyección intraespinal en la cavidad espinal es relativamente ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	Cultivo celular
Suero fetal bovino	biowest	S1520	Suplemento de medio de cultivo
gentamicina	Gibco-invitrogen	15710-072 Suplemento de	medio de cultivo
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	Aislamiento de ADNg
MEM, sin glutamina, sin rojo	de fenolGibco	51200038	WJ-MSC fomulación inyectable
Miminum Essential Medium alfa	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC medio de cultivo
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	cuantitativo reactivo de PCR en tiempo real
QuantStudio 6 Flex Thermo	fisher	4485694	PCR cuantitativa en tiempo real
Trypan Blue	Gibco	15250061	Injection
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	invitrogen	V22887	Solución de etiquetado de células madre
Xenogen IVIS Spectrum system	Perkin Elmer	124262	Dispositivo óptico de imagen