Aquí, presentamos un protocolo para establecer un nuevo modelo de rata de infección activa por VIH usando VIH quimérico (EcoHIV), que es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los reservorios virales del VIH-1 en el cerebro y ofrecer un sistema para estudiar los trastornos neurocognitivos asociados al VIH y las comorbilidades asociadas (es decir, el abuso de drogas).
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Artículo de método
Un modelo de rata de la infección cerebral EcoHIV
En este artículo
Resumen
Resumen
Se ha estudiado bien que el modelo de ratón infectado ecoHIV es de gran utilidad en la investigación de las complicaciones neurológicas asociadas al VIH. El establecimiento del modelo de rata infectada EcoHIV para estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos, sería beneficioso en el estudio de neuroHIV y trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1 (HAND). En el actual estudio, demostramos la creación acertada de un modelo de la rata de la infección vih activa usando el VIH quimérico (EcoHIV). En primer lugar, la construcción lentiviral de EcoHIV se envasaba en células cultivadas de 293 FT durante 48 horas. Entonces, el medio condicional fue concentrado y ºteado. Después, realizamos inyecciones stereotaxic bilaterales del EcoHIV-EGFP en el tejido cerebral de la rata de F344/N. Una semana después de la infección, se detectaron señales de fluorescencia de EGFP en el tejido cerebral infectado, lo que indica que EcoHIV induce con éxito una infección activa por VIH en ratas. Además, immunostaining para el marcador microglial de la célula, Iba1, fue realizado. Los resultados indicaron que la microglía era el tipo de célula predominante que albergaba EcoHIV. Además, las ratas de EcoHIV exhibieron alteraciones en el proceso temporal, un mecanismo neurobehavioral subyacente potencial de la MANO así como la disfunción sináptica ocho semanas después de la infección. En conjunto, el presente estudio extiende el modelo EcoHIV de la infección por VIH-1 a la rata que ofrece un valioso sistema biológico para estudiar los reservorios virales del VIH-1 en el cerebro, así como la MANO y las comorbilidades asociadas, como el abuso de drogas.
Introducción
Los sistemas biológicos han mejorado nuestra comprensión de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1 (HAND) y sus mecanismos neuronales subyacentes2. La determinación del sistema biológico más apropiado para un estudio determinado depende a menudo de la cuestión de interés2. La limitación de la gama de modelos animales huésped desafía los estudios de desarrollo de la enfermedad VIH-1. Para investigar la replicación viral y la patogénesis del VIH-1, Potash et al.3 crearon un modelo de ratón de infección activa por VIH-1, reemplazando la región codificante de la glicoproteína de la envoltura superficial del VIH, gp120, con mlv ecotrópica gp80, lo que llevó a la replicación viral exitosa en ratones4. Después de las inyecciones de venas de cola en ratones quiméricos de VIH (EcoHIV), se observaron muchas características que se asemejaban a las de los individuos seropositivos del VIH-1 (por ejemplo, linfocitos y macrófagos infectados, dirigidos a respuestas inmunitarias antivirales, e inflamación3,5,6).
Aunque los ratones y las ratas son miembros de muridos, las diferencias fundamentales de las especies pueden influir en su idoneidad para cuestiones experimentales específicas7. Por lo tanto, la extensión del modelo de infección por EcoHIV a ratas (comúnmente utilizado en estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos) sería ventajosa en el estudio de neuroHIV. Por ejemplo, su mayor tamaño hace que la implantación de catéteres yugulares para procedimientos de autoadministración de fármacos sea más práctica8. Las técnicas de autoadministración de fármacos en ratas se han utilizado para evaluar la motivación en el VIH-19. Además, muchas tareas neurocognitivas/conductuales fueron diseñadas inicialmente para ratas10. Aquí, divulgamos la utilización de inyecciones stereotaxic de EcoHIV en ratas para extender el modelo de la infección de EcoHIV y para permitir una oportunidad dominante de dirigir las preguntas nuevas relacionadas con neuroHIV y la MANO.
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Protocolo
Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028). La rata masculina adulta de seises F344/N era par alojada en un ambiente controlado bajo luz 12/12: ciclo oscuro con el acceso del ad libitum al alimento y al agua. Todos los animales fueron atendidos utilizando las directrices establecidas por los Institutos Nacionales de Salud en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Empaquetado de virus en 293 células FT
- Cultivar las 293 células FT (5×105/mL)en matraces recubiertos de gelatina de 75 cm2 con DMEM más FBS al 10%11. Cultivar células a 37 °C para que sean confluentes al 50% en la transfección.
- Diluir 22,5 μL de reactivo de transfección (por ejemplo, lipofectamina 3000) en 750 μL de medio (por ejemplo, Opti-MEM) en un tubo de microcentrifugación de 1,5 mL y vórtice durante 3 s.
- Diluir 20 μg de ADN plásmido EcoHIV en 750 μL de medio en un tubo de microcentrifugación de 1,5 mL y mezclar bien.
- Agregue adn diluido en el tubo del reactivo de transfección diluido y mezcle suavemente. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Añadir la mezcla a 10 mL de medio DMEM precalentado en matraz de 75 cm2. Incubar las células durante 2 días a 37 °C.
- Cosechar y combinar 24 mL de medio condicional de los dos matraces que incluyen el lentivirus envasado.
- Centrifugar los 24 mL de medio condicional a 500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo estéril de 50 mL.
- Combinar 8 mL de concentrador Lenti-x con 24 mL de sobrenadante clarificado (relación 1:3). Mezclar por inversión suave. Incubar la mezcla a 4 °C durante dos días.
- Mezcla de centrífuga a 1.500 x g durante 45 minutos a 4 °C. Retire cuidadosamente el sobrenadante.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet con 100 μL de PBS de 100 mM.
- Concentración del virus del título con un kit p24 ELISA.
2. Cirugías estereotáxicas del virus EcoHIV-EGFP
- Anestesiar ratas usando sevoflurano al 3%. Proceda al paso 2.2 cuando las ratas no responden a los estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.
- Afeitarse los pelos de la región del cerebro y esterilizar la piel dos veces con etanol al 70% y un exfoliante a base de clorhexidina. Asegure la rata en una posición propensa en el aparato estereotáxico.
- Haga una incisión (5-6 cm) a través de la piel a lo largo de la línea media del cuero cabelludo.
- Marque dos posiciones de perforación a 0,8 mm laterales, 1,2 mm rostral a bregma. Taladrar un agujero (diámetro 0,4 mm) en cada posición del cráneo.
- Llene la solución de lentivirus EcoHIV con título (1,04 × 106 TU/mL) en una jeringa de inyección de 10 μL. Asegure la jeringa al aparato estereotáxico.
- Mueva hacia abajo la aguja cerca de la superficie del orificio de perforación. Medir y mover 2,5 mm de profundidad.
- Infundir 1 μL de solución de virus a una velocidad de 0,2 μL/min. Mantenga la aguja dentro del área de inyección durante 5 min. Mueva lentamente la aguja hacia arriba hasta que esté fuera del cráneo de la rata.
- Sutura la piel con un hilo de seda 4-0.
- Esterilice la incisión con etanol al 70% una vez. Inyectar butorfenol por vía subcutánea (Dorolex, 0,1 mg/kg de peso corporal).
- Transfiera la rata a una cámara de recuperación con una almohadilla térmica hasta que se despierte.
3. Visualización de las secciones cerebrales
NOTA: Espere de una a ocho semanas después de la infusión viral de EcoHIV.
- Anestesiar la rata con 5% sevoflurano. Continúe con el paso 3.2 cuando las ratas no responden a los estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.
- Fije la rata en una posición supina dentro de una campana extractora de humos.
- Incise la piel a lo largo de la línea media torácica. Cortar el diafragma y abrir la cavidad torácica.
- Inserte una aguja de 20 G × 25 mm en el ventrículo izquierdo.
- Abra inmediatamente la aurícula derecha con unas tijeras.
- Perfundir 50 mL de PBS prechilled 100 mM a razón de 5 mL/min.
- Perfundir 100 mL de paraformadehído frío al 4% a razón de 5 mL/min.
- Decapitar la rata, abrir el cuero cabelludo y quitar el cerebro.
- Postfix durante la noche con paraformaformadehído al 4%.
- Transfiera el cerebro a 40 mL de sacarosa al 30% en PBS de 100 mM en un tubo de 50 mL hasta que el cerebro flote hasta el fondo (aproximadamente 3 días).
- Snap congelar el cerebro en metilbutanol durante 2 min a - 80 °C.
- Asegure el tejido cerebral en una plataforma metálica dentro de un criostato de -20 °C.
- Corte las secciones coronales de 50 μm de espesor usando el criostato.
- Transfiera las rebanadas cerebrales a los portaobjetos de vidrio con un cepillo fino.
- Montar secciones en 0,3 mL de medio antifade y cubrir con cubrebocas de 22 mm y 50 mm.
- Mantenga los portaobjetos de vidrio en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se sequen.
- Imagen de las neuronas objetivo con un microscopio confocal utilizando Z-pila basada en los límites de la región del cerebro y las características morfológicas de las neuronas.
NOTA: Los ajustes de microscopio confocal utilizados fueron: aumento de 60 X (A/1.4, aceite), y un intervalo de plano Z de 0.15 μm (tamaño del agujero de alfiler 30 μm; radio del agujero de alfiler proyectado hacia atrás 167 nm) utilizando una longitud de onda de 488 nm.
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Resultados
El medio condicionado fue recogido del lentivirus de las células infectadas EcoHIV-EGFP 293FT. Después, fue concentrado y ºdado, entonces stereotaxically inyectado en el cerebro (región cortical) de las ratas de F344/N. Siete días después de la inyección, las ratas fueron sacrificadas y las imágenes fueron tomadas de las rebanadas coronales del cerebro que se extendían de bregma 5.64 milímetros a bregma -4.68 milímetros. En la Figura 1A,hay señales significativas de EcoHIV-EGFP en todo el ce...
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Discusión
En este protocolo, establecimos un modelo de infección por VIH inducida por EcoHIV en ratas. Específicamente, describimos una inyección stereotaxic bilateral de EcoHIV en la corteza que indujo con éxito la infección vih activa en el cerebro de la rata 7 días de poste-inyección. Además, demostramos que la infección por EcoHIV en ratas podría ser un buen sistema biológico para estudiar aspectos clave de HAND. Ocho semanas de infección post-EcoHIV, ratas exhibieron deterioros neurocognitivos significativos, que incluyeron l...
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por las subvenciones HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624 de los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 293FT celdas | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Solución antibiótica-antimicótica | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatina 75cm² Matraz de cultivo celular de cuello inclinado rectangular con tapón ventilado Life | Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM con L-glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio | Life Technologies | 10013CV | |
| Cubreobjetos de vidrio | VWR | 637-137 | |
| taladro | |||
| Dumont #5 Pinzas | World Precision Instruments | 14095 | |
| Pinzas Dumont #7 | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Microcentrífuga con tapa a presión Biopur Tubos de bloqueo seguro | Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Sutura, 27 pulg. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| jeringa Hamilton Hamilton | 1701 | ||
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección | Life Technologies | Pinzas | |
| World Precision Instruments | 15914 | ||
| Tijeras de iris | World Precision Instruments | 500216 | |
| Kit de ELISA p24 asociado a lentivirus | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Concentrador Lenti-X | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Suero Reducido | Tecnologías de Vida Media 11058021 | ||
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurano | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| aparato estereotáxico | Kopf Instruments | Modelo 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Tijeras | World Precision Instruments | 500086 |
Referencias
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