Imágenes del intestino con "CLARIDAD"

Resumen

Describimos el protocolo para la tinción pasiva de CLARITY (PACT) en el intestino de ratón para permitir la visualización de los tejidos subepiteliales, incluidas las neuronas, la glía y las células enteroendocrinas (EEC) sin corte de tejido. El protocolo implica la inclusión de hidrogel en el tejido fijado con formaldehído y la posterior deslipidación utilizando un detergente aniónico para "limpiar" el tejido.

Resumen

CLARITY (Clear Lipid-traded Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible con Tissue hYdrogel) ha evolucionado recientemente como una técnica valiosa que implica la inclusión de acrilamida para delipidar el tejido (sin seccionar) y para preservar la estructura del tejido 3D para la inmunotinción. La técnica es muy relevante para obtener imágenes del entorno intestinal dinámico donde diferentes tipos de células interactúan durante la homeostasis y los estados de enfermedad. Aquí se describe este método optimizado para el intestino del ratón, que ayuda a rastrear tipos de células como epitelios, enteroendocrinos, neuronas, glía y las proyecciones neuronales en las células epiteliales o enteroendocrinas que median la detección microbiana o la detección de quimioterapia de nutrientes, respectivamente. El tejido intestinal (1-1,5 cm) se fija en paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C durante la noche del día 1. En el día 2, se desecha el PFA y el tejido se lava tres veces con PBS. El tejido está incrustado en hidrogel para preservar su integridad mediante la incubación en una solución de hidrogel al 4% (acrilamida) en PBS (diluida a partir de ProtoGel al 30%) durante la noche a 4 °C. En el día 3, la solución de hidrogel tisular se incuba a 37  °C durante 1 h para permitir la polimerización del hidrogel. A continuación, el pañuelo se lava tres veces suavemente con PBS para eliminar el exceso de hidrogel. El siguiente paso de la deslipidación (aclarado) consiste en la incubación del tejido en dodecil sulfato de sodio (8% SDS en PBS) a 37 °C durante 2 días (días 4 y 5) en un agitador a temperatura ambiente (RT). En el día 6, el tejido aclarado se lava a fondo con PBS para eliminar el SDS. El tejido se puede inmunoteñir mediante incubación en anticuerpos primarios (diluidos en suero de burro normal al 0,5% en PBS que contiene 0,3% de Triton X-100), durante la noche a 4 °C y posterior incubación en anticuerpos secundarios Alexa Fluor apropiados durante 1,5 h a RT, y tinción nuclear con DAPI (1: 10000). El tejido se transfiere a un portaobjetos de vidrio limpio y se monta con VectaShield para la obtención de imágenes confocal.

Introducción

CLARITY (Clear Lipid-Exchange-Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible con el hYdrogel) ha evolucionado recientemente como una técnica valiosa que implica la inclusión de acrilamida (hidrogel) y la delipidación de tejidos para preservar la estructura tisular 3D para la inmunotinción (sin seccionamiento)^1,2. El tejido incluido en hidrogel es ópticamente transparente y permeable a las macromoléculas, y las proteínas y los ácidos nucleicos se conservan después de la eliminación de los lípidos por detergente. CLARITY fue reconocido como uno de los diez avances notables en 20....

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Emory. A los ratones C57BL/6 (se pueden usar tanto machos como hembras) a las 8-12 semanas de edad se les permitió el libre acceso a la comida y al agua antes de la eutanasia.

1. Extirpación del intestino (día 1)

1. Eutanasia del ratón por el método de asfixia con dióxido de carbono, a un caudal de 1,6 mL de gas de dióxido de carbono hasta que se observe el cese de la respiración durante 2 min).
2. Coloque al ratón en decúbito supino sobre un tablero de disección con....

Resultados

Las imágenes del tejido intestinal de ratón aclarado con CLARITY se representan en la Figura 1. Una finalización exitosa del protocolo produce imágenes nítidas y de alta calidad en las que todos los detalles celulares se pueden visualizar con claridad. La tinción DAPI para núcleos es un muy buen índice para evaluar la calidad del protocolo CLARITY y la inmunotinción posterior, ya que puede representar la integridad del tejido. Además, la forma de la célula también proporciona una pista sobre.......

Discusión

El método CLARITY es muy útil para teñir el intestino del ratón con el fin de visualizar varios tipos de células, incluidos los epitelios, las neuronas y las células gliales en 3D, especialmente la red de proyecciones neuronales que se extienden a través de la pared intestinal hasta el lumen⁵ y su inervación a las células gliales y EEC. El método aquí presentado fue modificado de acuerdo con el estudio original de Yang et al. 2014¹.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4% de paraformaldehído (PFA)  en PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Utilizado para la fijación
de tejidos 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	Dilución 1/10.000
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	Dilución 1/1000
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	Dilución 1/500
Anti-GFAP (Proteína de ácido fibrilar glial)	Abcam	ab7260	Dilución 1/500
Tubulina anti-beta III (o Tuj1)	Abcam	ab18207	dilución 1/1000
Cromogranina A	Abcam	ab15160	dilución 1/250
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Tóxico, peligroso, manéjelo con cuidado hacer una solución al 4% en PBS para su uso
Dodecil sulfato de sodio	ThermoFischer Scientific	28364	8% en PBS
Medio de montaje Vectashield	Vector Laboratories	H-1000