Artículo de método

Imágenes del intestino con "CLARIDAD"

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DOI:

10.3791/62143

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11 de junio de 2021

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

En este artículo

Resumen

Describimos el protocolo para la tinción pasiva de CLARITY (PACT) en el intestino de ratón para permitir la visualización de los tejidos subepiteliales, incluidas las neuronas, la glía y las células enteroendocrinas (EEC) sin corte de tejido. El protocolo implica la inclusión de hidrogel en el tejido fijado con formaldehído y la posterior deslipidación utilizando un detergente aniónico para "limpiar" el tejido.

Resumen

CLARITY (Clear Lipid-traded Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible con Tissue hYdrogel) ha evolucionado recientemente como una técnica valiosa que implica la inclusión de acrilamida para delipidar el tejido (sin seccionar) y para preservar la estructura del tejido 3D para la inmunotinción. La técnica es muy relevante para obtener imágenes del entorno intestinal dinámico donde diferentes tipos de células interactúan durante la homeostasis y los estados de enfermedad. Aquí se describe este método optimizado para el intestino del ratón, que ayuda a rastrear tipos de células como epitelios, enteroendocrinos, neuronas, glía y las proyecciones neuronales en las células epiteliales o enteroendocrinas que median la detección microbiana o la detección de quimioterapia de nutrientes, respectivamente. El tejido intestinal (1-1,5 cm) se fija en paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C durante la noche del día 1. En el día 2, se desecha el PFA y el tejido se lava tres veces con PBS. El tejido está incrustado en hidrogel para preservar su integridad mediante la incubación en una solución de hidrogel al 4% (acrilamida) en PBS (diluida a partir de ProtoGel al 30%) durante la noche a 4 °C. En el día 3, la solución de hidrogel tisular se incuba a 37  °C durante 1 h para permitir la polimerización del hidrogel. A continuación, el pañuelo se lava tres veces suavemente con PBS para eliminar el exceso de hidrogel. El siguiente paso de la deslipidación (aclarado) consiste en la incubación del tejido en dodecil sulfato de sodio (8% SDS en PBS) a 37 °C durante 2 días (días 4 y 5) en un agitador a temperatura ambiente (RT). En el día 6, el tejido aclarado se lava a fondo con PBS para eliminar el SDS. El tejido se puede inmunoteñir mediante incubación en anticuerpos primarios (diluidos en suero de burro normal al 0,5% en PBS que contiene 0,3% de Triton X-100), durante la noche a 4 °C y posterior incubación en anticuerpos secundarios Alexa Fluor apropiados durante 1,5 h a RT, y tinción nuclear con DAPI (1: 10000). El tejido se transfiere a un portaobjetos de vidrio limpio y se monta con VectaShield para la obtención de imágenes confocal.

Introducción

CLARITY (Clear Lipid-Exchange-Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible con el hYdrogel) ha evolucionado recientemente como una técnica valiosa que implica la inclusión de acrilamida (hidrogel) y la delipidación de tejidos para preservar la estructura tisular 3D para la inmunotinción (sin seccionamiento)1,2. El tejido incluido en hidrogel es ópticamente transparente y permeable a las macromoléculas, y las proteínas y los ácidos nucleicos se conservan después de la eliminación de los lípidos por detergente. CLARITY fue reconocido como uno de los diez avances notables en 2013 por Science3. Aunque se desarrolló inicialmente para obtener imágenes de tejidos cerebrales ricos en lípidos donde los lípidos afectan la dispersión de la luz y la calidad de la imagen, la técnica se usa actualmente ampliamente para obtener imágenes de otros tejidos como el intestino, el hígado, el riñón y el corazón. La técnica ofrece la capacidad de teñir e obtener imágenes de un tejido al eliminar la necesidad de seccionar, lo que de otro modo podría resultar en una evaluación sesgada de las interacciones célula-célula debido a la distribución irregular de los tipos de células. La técnica también brinda la oportunidad de realizar pilas z confocales y recrear una imagen tridimensional del tejido, lo que puede ayudar a determinar las densidades, la microarquitectura y la interacción célula-célula entre varios tipos de células de manera más realista que a partir de una sección de tejido. Además, la técnica ha sido modificada para permitir la inmunotinción de tejidos densos como el hueso, así como estudios de hibridación in situ. El tejido 3D incrustado en hidrogel ofrece una plataforma atractiva para dilucidar las interacciones entre las células epiteliales, enteroendocrinas, gliales y neuronales, que recientemente se han citado como cruciales para la comprensión de la fisiopatología de enfermedades como la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer, los trastornos del espectro autista, etc.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Emory. A los ratones C57BL/6 (se pueden usar tanto machos como hembras) a las 8-12 semanas de edad se les permitió el libre acceso a la comida y al agua antes de la eutanasia.

1. Extirpación del intestino (día 1)

  1. Eutanasia del ratón por el método de asfixia con dióxido de carbono, a un caudal de 1,6 mL de gas de dióxido de carbono hasta que se observe el cese de la respiración durante 2 min).
  2. Coloque al ratón en decúbito supino sobre un tablero de disección con las extremidades sujetas. Esterilizar el abdomen con etanol al 70%. Con unas pinzas, corte la piel con unas tijeras.
  3. Levanta el hígado suavemente e identifica el estómago. Luego, sosteniendo el estómago con fórceps, corte el esófago justo por encima del estómago. Sosteniendo el estómago con fórceps, corte suavemente los mesenterios y separe el intestino de la cavidad abdominal hasta el recto. Corte el intestino desprendido en el recto.
  4. Transfiera el intestino desprendido a una solución de PBS helada en una placa de Petri. Ahora corte suavemente el mesenterio entre los segmentos ileales y enderece el intestino de modo que, comenzando desde el estómago, se corten todos los mesenterios, hasta el colon.
  5. Corte 1-1,5 cm de la región intestinal deseada para la tinción CLARITY en una nueva placa de Petri que contenga PBS helado.
  6. Con una jeringa de 5 ml conectada a un extremo romo de una aguja de 20 G, enjuague el contenido fecal con PBS helado.
    NOTA: Cualquier región del intestino se puede utilizar para la tinción CLARITY utilizando la misma técnica. El segmento intestinal puede cortarse a lo largo del mesenterio o usarse intacto para los pasos subsiguientes.

2. Fijación del tejido intestinal (Día 1)

  1. Fije el tejido en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS.
  2. Transfiera un trozo de 1-1,5 cm del segmento intestinal de interés a un tubo cónico de 15 ml lleno de PFA al 4% a 4 °C durante la noche para su fijación.

3. Incrustación de hidrogel (Día 2)

  1. Transfiera el segmento intestinal de la solución de PFA al 4% con pinzas a un nuevo tubo cónico de 15 mL con solución de PBS y lave tres veces (5 min cada una, en un agitador a 150-200 rpm) para eliminar cualquier PFA residual.
  2. Preparación de hidrogel al 4%
    1. Utilice la solución de gel al 30% (ProtoGel) para preparar el hidrogel. Para preparar una solución de hidrogel al 4%, diluya la solución madre al 30% y se diluye en PBS. Para preparar 12 mL de hidrogel al 4%, tome 1,6 mL de solución de gel al 30% y agregue 10,4 mL de PBS.
  3. Transfiera el tejido fijado del paso 3.1. a la solución de hidrogel al 4% en PBS en un tubo cónico de 15 ml e incubado a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente que el tejido se lave sin PFA utilizando PBS después de la incubación durante la noche. El tejido almacenado durante más tiempo en PFA no da buenos resultados con los pasos posteriores y la tinción. El tejido fijado después de los lavados con PBS puede almacenarse a 4 °C durante una semana.

4. Paso de polimerización y deslipidación (aclarado) de hidrogel (Día 3)

  1. Retire el tubo cónico que contiene el tejido en solución de hidrogel a 4 °C. Pasar a un baño de agua a 37 °C e incubar durante 1 h. Este paso permite la polimerización en hidrogel.
  2. Después de 1 h, saque el tubo cónico que contiene el tejido incrustado en hidrogel del baño de agua y vierta la solución de acrilamida. Ahora enjuague suavemente el pañuelo con un solo lavado de PBS a temperatura ambiente para eliminar el exceso de hidrogel.
  3. Paso de delipidación
    1. Deslipidar incubando el tejido en dodecil sulfato de sodio (8% SDS) en PBS. Transfiera el tejido incluido en hidrogel del paso 4.2 a una solución SDS al 8% en un tubo cónico de 50 mL. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido en la solución SDS y que el tubo esté tapado.
    2. Transfiera el tubo tapado de 50 mL que contiene el tejido en SDS a un agitador a 37 °C (200 rpm) a temperatura ambiente durante 2 días (días 4 y 5) para permitir la delipidación.
      NOTA: Asegúrese de que la solución SDS esté llena hasta al menos 20-25 mL en el tubo cónico de 50 mL, para compensar cualquier evaporación que pueda ocurrir a 37 °C durante los 2 días de incubación.
  4. En los días 4 y 5, incubar el tejido en SDS a 37 °C agitador (200 rpm) a temperatura ambiente.

5. Lavar el detergente del pañuelo aclarado (Día 6)

  1. Tome el pañuelo de la solución SDS. El tejido aparecerá "claro" o transparente.
  2. Transfiera el tejido a un nuevo tubo cómico de 50 mL con solución de PBS y lave durante el día en un agitador (150-200 rpm) a temperatura ambiente con varios cambios de PBS, para asegurarse de que se eliminan todos los rastros de SDS. Al menos 10 cambios de solución de PBS asegurarán que el tejido esté libre de la SDS, y una buena regla general es verificar si el lavado final de PBS no tiene rastros de espuma / espuma de la SDS. Este es un paso crítico, ya que la SDS puede interferir con los pasos de tinción posteriores.
    NOTA: Al final del día, el tejido aclarado después de varios lavados en PBS ahora está listo para la inmunotinción o tal vez se almacena a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
  3. El almacenamiento de los tejidos intestinales aclarados durante más de un mes en una solución de PBS afectará a la integridad del tejido y a la calidad de la tinción. Use el tejido intestinal aclarado inmediatamente o dentro de 1-2 semanas después de la limpieza para obtener mejores resultados.

6. Tinción inmunofluorescente para neuronas, glía y células enteroendocrinas

  1. Transfiera el tejido aclarado a un tubo de 1,5 o 2 mL e incube en un volumen de 500 μL de los respectivos anticuerpos primarios diluidos en suero de burro normal al 0,5% en PBS que contenga Triton X-100 al 0,3% durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos (Ab) utilizados: Tuj1 o β-3-tubulina (marcador panneuronal, 1:1000), proteína ácido fibrilar glial (GFAP, 1:500), cromogranina A (1:250).
  2. Después de la incubación durante la noche, someta el tejido a 3 lavados de PBS (5 minutos cada uno con 1-1,5 mL de PBS) para eliminar el Ab primario no unido.
  3. Transfiera el tejido a un nuevo tubo y, posteriormente, incube con 500 μL de Alexa Fluor Ab (AF) secundario adecuado durante 1,5 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los AB secundarios utilizados son AF 488 para Tuj1 (1:1000), AF-555 para GFAP (1:500) y AF 555 (1:250) para Chromogranin A.
  4. Después de la incubación, lave el tejido tres veces con PBS como en el paso 6.2.
  5. Para teñir los núcleos, incubar el tejido en DAPI (dilución 1:10000 o 0,2 μL en PBS 2 mL) durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Por último, transfiera el tejido teñido a un portaobjetos de vidrio limpio, añada un cubreobjetos encima del pañuelo y móntelo con 100 μL de VectaShield para obtener imágenes confocal.
  7. Coloque los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente en un soporte para portaobjetos durante 30 minutos para su secado, después de lo cual se pueden visualizar o almacenar a -20 °C. La pared de la tripa del ratón es bastante delgada y una vez abierta a lo largo del mesenterio, se puede montar en portaobjetos de vidrio directamente con cubreobjetos. Si se trabaja con tejidos más grandes como bazo, riñones, se pueden usar portaobjetos de cámara (cavidad) o espaciadores. Para tejidos más grandes, por ejemplo, se puede usar un portaobjetos de cavidad para el montaje.
    NOTA: Debe tenerse en cuenta que si el segmento intestinal no se abrió en el paso inicial (consulte la nota en el paso 1), es aconsejable abrir el tubo intestinal con microtijeras que facilitarán los pasos que implican el montaje.

7. Imágenes confocales

NOTA: El tejido aclarado, teñido y montado se puede obtener inmediatamente o se puede almacenar en cajas de portaobjetos a -20 °C.

  1. Imagen con un microscopio confocal (por ejemplo, Olympus FV1000).
  2. Tome pilas z a lo largo de 50 μm de espesor del tejido intestinal para visualizar las regiones desde la luz intestinal hacia la capa serosa.
  3. Almacene las imágenes de la pila z como archivos de imagen, .avi archivos de película o conviértalos en imágenes 3D con la ayuda del software5.

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Resultados

Las imágenes del tejido intestinal de ratón aclarado con CLARITY se representan en la Figura 1. Una finalización exitosa del protocolo produce imágenes nítidas y de alta calidad en las que todos los detalles celulares se pueden visualizar con claridad. La tinción DAPI para núcleos es un muy buen índice para evaluar la calidad del protocolo CLARITY y la inmunotinción posterior, ya que puede representar la integridad del tejido. Además, la forma de la célula también proporciona una pista sobre...

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Discusión

El método CLARITY es muy útil para teñir el intestino del ratón con el fin de visualizar varios tipos de células, incluidos los epitelios, las neuronas y las células gliales en 3D, especialmente la red de proyecciones neuronales que se extienden a través de la pared intestinal hasta el lumen5 y su inervación a las células gliales y EEC. El método aquí presentado fue modificado de acuerdo con el estudio original de Yang et al. 20141.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo de la Asociación Americana de Gastroenterología (AGA), el Premio Piloto de Investigación de Trastornos de la Motilidad Gastrointestinal Funcional de AGA-Roma (a la Columbia Británica), la subvención de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. AI64462 (ASN) y el Centro de Microscopía de Imagen Celular Integrada de la Universidad de Emory.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4% de paraformaldehído (PFA)  en PBSThermoFischer ScientificJ19943Utilizado para la fijación
de tejidos 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro (DAPI)ThermoFischer ScientificD1306Dilución 1/10.000
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-11034Dilución 1/1000
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-21428Dilución 1/500
Anti-GFAP (Proteína de ácido fibrilar glial)Abcamab7260Dilución 1/500
Tubulina anti-beta III (o Tuj1)Abcamab18207dilución 1/1000
Cromogranina AAbcamab15160dilución 1/250
ProtoGel  30%National DiagnosticsEC-890Tóxico, peligroso, manéjelo con cuidado hacer una solución al 4% en PBS para su uso
Dodecil sulfato de sodioThermoFischer Scientific283648% en PBS
Medio de montaje VectashieldVector LaboratoriesH-1000

Referencias

  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  3. 2013 Runners-Up. CLARITY makes it perfectly clear. Science. 342, 1434-1435 (2013).
  4. Fung, T. C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. Neurobiology of Disease. 136, 104714(2020).
  5. Chandrasekharan, B., et al. Interactions Between Commensal Bacteria and Enteric Neurons, via FPR1 Induction of ROS, Increase Gastrointestinal Motility in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  6. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, 792-804 (2016).
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  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
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