Generación De Monocapas Epiteliales Murinas Primarias De Colon De Criptas Intestinales

Las células epiteliales intestinales (IEC) recubren los intestinos formando una barrera selectivamente permeable que permite la absorción de nutrientes y agua a la vez que evitan que microorganismos y toxinas entren en el organismo ^1. La mucosa intestinal se compone de proyecciones luminales llamadas vellosidades (sólo presentes en el intestino delgado) e invaginaciones llamadas criptas. Las vellosidades y la superficie de las criptas del colon están cubiertas por células epiteliales diferenciadas, mientras que la base de las criptas está compuesta por células madre que hacen la rápida renovación de los epitelios intestinales, que tiene un recambio de 3 a 7 días. Las células madre intestinales (ISC) no sólo son importantes para mantener la homeostasis intestinal, sino para la reparación adecuada de los epitelios dañados^2.

El estudio de la biología intestinal del epithelia fue limitado por la carencia de cultivos celulares primarios con las variedades de células transformadas que eran la única herramienta disponible. Las variedades de células modelo epitelial intestinal no son capaces de replicar exactamente la fisiología del epitelio intestinal normal. El desarrollo de cultivos 3D derivados de isc proporcionó a los biólogos de la mucosa intestinal con modelos in vitro que se asemejan in vivo a las condiciones de la mucosa intestinal^3. Las criptas pueden aislarse fácilmente de muestras murinas, incrustadas en un medio de matriz de membrana basal (por ejemplo, Matrigel) y cultivadas en medios acondicionados que contienen Wnt3a, R-espondina y Noggin, generando estructuras 3D conocidas como enteroides (intestino delgado) o colonoides (intestino grueso)⁴. Los enteroides y los colonoides son estructuras esferoidales polarizadas donde el dominio apical está frente a un lumen interno y la región basolateral está en contacto directo con la matriz extracelular. Los enteroides y colonoides contienen todos los principales sub-tipos epiteliales intestinales diferenciados, como enterocitos / colonocitos, paneth, enteroendocrinos y células caliciformes y aparecen en relativamente las mismas proporciones que en la sección del intestino donde se aislaron de⁵. A pesar de que los enteroides 3D y los colonoides representan un gran avance en el estudio del desarrollo intestinal y la fisiología, estos modelos presentan ciertos inconvenientes, como el acceso limitado a la superficie apical de las células epiteliales (lumen) y la capacidad de escalar cultivos hacia arriba o hacia abajo para lograr un cribado de alto rendimiento de moléculas de interés. Para superar estas limitaciones, se generaron protocolos para obtener cultivos 2D primarios de IEC derivados de enteroides/colonoides 3D. Los enteroides/colonoides 2D crecen como hoja de células al igual que las líneas celulares modelo y son ideales para estudiar la reparación de heridas intestinales, las interacciones huésped-patógeno y la medicina regenerativa, entre otros. Varios artículos publicados describen cómo generar monocapas 2D a partir de estructuras 3D o directamente de criptas intestinales, (ver^{6,7,8,9,10,11)}pero estos métodos tienden a ser intensivos en mano de obra y difíciles de reproducir. Un método rápido, simple, y reproducible para obtener monocapas directamente de las criptas intestinales del ratón recientemente aisladas se contornea en este protocolo.

Aquí explicamos en detalle el proceso de extracción de criptas con una generación mínima de residuos, la elección de la matriz extracelular y diferentes superficies y aplicaciones para esta técnica. Este acercamiento experimental fue optimizado para las criptas de los dos puntos, pero los resultados similares se obtienen cuando están aplicados para el intestino delgado.

Todos los procedimientos descritos a continuación han sido aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan.

1. Preparación de reactivos para el aislamiento y cultivo de criptas (preparar en la campana de cultivo de tejidos)

1. 50 mM de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA): Añadir 50 mL 0,5 M en stock a 450 mL de fosfato tamponado salino, sin calcio (Ca²⁺⁾y magnesio (Mg²⁺⁾para preparar 500 mL. En este protocolo PBS se referirá a PBS sin calcio y magnesio a menos que se indique lo contrario.
2. Tampone de agitación: Disolver 7,4 g de sacarosa (43,3 mM) y 5 g de sorbitol (54,9 mM) en PBS para preparar 500 mL.
3. Medios de L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin y Noggin): Suplemento Avanzado de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) con 20% de Suero Fetal Bovino (FBS) (200 mL), 1x suplemento de glutamina disponible en el mercado (10 mL), 100 U/mL de penicilina y, 100 g/mL de estreptomicina (10 mL), y filtro esterilizar con filtro de 0.22 μm.
   1. Obtenga células L-WRN a través de ATCC, crezca en frascos T175 y seleccione usando Geneticin e Hygromycin. Los medios se cambian y se recopilan durante 12 días.
      NOTA: Cada lote de medios se prueba para la actividad Wnt utilizando un ensayo TOPflash Wnt Reporter. En este caso los protocolos traslacionales del laboratorio del modelado del tejido de la medicina de Michigan (https://www.umichttml.org/protocols) fueron seguidos. La línea celular TOPflash HEK 293 se cultiva hasta la confluencia en un matraz T75, tripsinizado y plateado en una placa de 96 pocillos. Al día siguiente se añaden diferentes diluciones de los medios recogidos a las células y se incuban en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las células se lisan, y el ensayo firefly luciferasa se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo se normaliza utilizando Wnt-3A recombinante. El medio se divide en alícuotas de 25 mL en tubos cónicos de 50 mL y se almacenan a -80 °C.
4. Soporte base: Para 500 mL, suplemento Advanced DMEM/F12 (448 mL) con 2x suplemento de glutamina disponible en el comercio (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penicilina y, 100 g/mL de estreptomicina (10 mL), 2 mM N-acetil-L-cisteína (2 mL), suplemento N2 (10 mL) y suplemento B27 (20 mL), filtro esterilizar con filtro de 0,22 μm. Divida el medio en alícuotas de 25 mL en tubo cónico de 50 mL y guárdelo a -80 °C.
5. Medio completo LWRN: Combinar 25 mL de medios LWRN con 25 mL de medio base y complementar con 200 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (20μL) y 2x solución antibiótico-antimicótica (1 mL). Almacene el soporte completo a 4 °C.
6. Colágeno y Laminina: Disolver 5 mg de polvo en 5 mL de filtro esterilizado de ácido acético de 100 mM (añadir 60 μL de caldo de ácido acético a 9,94 mL de agua de grado molecular) para producir una concentración de stock de 1 mg/mL. Girar a 4 °C durante 4 h y hacer alícuotas de 100 μL en tubos de 0,2 mL. Congelar a -20 °C. Laminina se compra a una concentración de stock de 100 μg/mL.
7. Medios completos sin factores de crecimiento (CMGF-): Suplemento Avanzado DMEM/F12 (500 mL) con 1x suplemento de glutamina disponible en el comercio (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL de penicilina y, 100 g/mL de estreptomicina (5 mL).
8. Medios de diferenciación: A 9,2 mL de cmgf- medios, añadir 200 μL de suplemento B27, 100 μL de suplemento de N2, 20 μL de N-acetil-L-cisteína, 500 μL de noggin medio¹² (hecho de células productoras de Noggin) y 2 μL de EGF para hacer 10 mL de medios de diferenciación.

2. Preparación de placas, portaobjetos de cámara e insertos de membrana de cultivo celular

1. Recubrimiento de portaobjetos de placa y cámara de 48 pocillos para chapado en monocapa 2D: Utilice la solución de recubrimiento que constituye laminina (dilución 1:40, ver Tabla de Materiales)y colágeno (dilución 1:30) en solución salina tamponada por fosfato de Dulbecco en frío, con Ca²⁺ y Mg²⁺ (DPBS). Añadir 200 μL de solución de recubrimiento a cada pozo y preincubar el portaobjetos de placa/cámara en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante al menos 2 h.
2. Recubrimiento de 0.4 μm de inserciones de membrana de cultivo celular: Haga 1:30 la dilución de colágeno en agua de grado molecular y agregue 200 μL a cada inserto. Mantenga la placa que contiene el inserto de membrana sobre hielo a 4 °C durante 30 min. Después de 30 minutos de incubación, mantenga la placa en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 1,5-2 h. Los insertos de membrana de poliéster y policarbonato producen resultados comparables.
   NOTA: Cualquier placa de cultivo de tejidos puede ser sembrada (se puede realizar escalado hacia arriba y hacia abajo) utilizando este protocolo ajustando el volumen de colágeno / laminina para obtener una cobertura completa de la superficie de revestimiento.

3. Aislamiento de la cripta

NOTA: Antes de comenzar la disección, prepare la placa recubierta de colágeno y/o laminina/insertos de membrana/portaobjetos de cámara y déjelos en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C. Prepare un banco de trabajo limpio e instrumentos quirúrgicos estériles apropiados para la cirugía, y un gabinete de seguridad biológica para cultivar monocapas 2D. Confirme que todos los demás equipos estándar para el cultivo de monocapas 2D, como la incubadora humidificada de CO_2, las centrifugadoras de sobremesa (mantenidas a 4 °C), el microscopio y las pipetas (incluidas las pipetas serológicas) están listos.

1. Utilice ratones C57Bl/6, de 8-12 semanas de edad. Eutanasia de ratones utilizando un método aprobado de eutanasia.
2. Rocíe las carcasas de los ratones con una solución de etanol al 70% (EtOH) para limpiar el área de disección y eliminar el exceso de EtOH utilizando papel de papel.
   NOTA: Asegúrese de que los reactivos de aislamiento de cripta (como PBS, EDTA de 50 mM, búfer de agitación) criptas se mantienen fríos. Estos reactivos se pueden preparar un día antes y son buenos para usar durante al menos 3 meses cuando se almacenan a 4 °C. Además, asegúrese de que el medio completo LWRN se mantenga en un baño de cuentas / agua mantenido a 37 ° C hasta su uso.
3. Usando tijeras de disección y descapotables limpios, diseccione el colon desde el recto hasta el ciego. Sostenga el extremo del colon usando fórceps y enjuague muy suavemente las heces usando PBS helado en una jeringa de 10 ml, equipada con una sonda de alimentación de 20 G (Figura 1A). Asegúrese de no romper el colon.
   1. Retire el colon proximal. Esta será la porción del colon más cercana a la unión ileocecal.
4. Con fórceps, deslice el colon distal suavemente sobre la sonda de alimentación de 20 G, atando el colon en el extremo de la trompa por la punta con hilo de sutura de seda 4-0 (Figura 1B).
5. Invierta los dos puntos de adentro hacia afuera usando los dedos de uno sobre el extremo atado y ate el otro extremo con hilo de sutura de seda 4-0. Usando tijeras quirúrgicas, corte el colon debajo de la punta de la sonda de alimentación (Figura 1C,D, E).
6. Usando el émbolo de una jeringa de repetición de 1.25 ml, abra suavemente el extremo desatado del colon invertido en la punta de una jeringa de repetición de 1.25 mL. Deslice el colon invertido sobre el extremo de la jeringa y ate firmemente con hilo de sutura de seda 4-0 (Figura 1F, G).
7. Inserte el émbolo en la jeringa e infle el colon para formar una salchicha. Inflar hasta que la salchicha de colon se vea turgent sin arrugas visibles (Figura 1H).
8. Colocar la jeringa/colon en un tubo de 15 mL con 5 mL de solución de recuperación celular sobre hielo durante 20 min, inflar y desinflar el colon una vez cada 5 min(Figura 1I). El embutido debe permanecer inflado durante la incubación.
9. Ate usando hilo de sutura de seda 4-0 debajo de la punta de la jeringa de repetición con el colon inflado. Cortar la salchicha de la jeringa de repetición y colocar en tubo de 15 mL que contenga 10 mL de EDTA de 50 mM (2mM para intestino delgado) durante 40 min y girar a 4 °C(Figura 1J,K).
10. Decantar la solución de EDTA y reemplazar con 5 mL de tampón de agitación. Agitar la salchicha manualmente en posición vertical (vigorosamente) durante 2 min.
11. Decantar la solución de agitación en un nuevo tubo de 15 mL y repetir el paso de agitación para un total de 10 mL de criptas en el tampón de agitación.
12. Tome 20 μL de la suspensión de la cripta en una placa de Petri y cuente el número de criptas bajo un microscopio. Calcular la concentración de criptas en criptas/μL. Dependiendo de la concentración, diluir las muestras para obtener 5 criptas/μL en el momento del revestimiento (1000 criptas/cm²).
13. Gire el tubo con criptas aisladas usando centrífuga de mesa a 400 x g durante 10 min a 4 °C.
14. Mientras tanto, retire la placa/inserto/cámara de 48 pozos de la incubadora y colóquele en el gabinete de bioseguridad. Aspire la solución de recubrimiento usando P200 y deje la placa con la tapa ligeramente desplazada hasta que las células estén listas para ser plateadas.

4. Cultivo de monocapa 2D

NOTA: Para un protocolo detallado sobre cómo generar monocapas epiteliales intestinales a partir de colonoides 3D comprobar protocolos por Estes y laboratorios Kovbasnjuk (^7,11).

1. Retire el tampón de agitación con pipeta serológica de 10 mL. Asegúrese de que el pellet está intacto y puede usar P1000 para eliminar cualquier líquido que quede. Vuelva a suspender el pellet en 3 mL de medio completo LWRN y pipetete hacia arriba y hacia abajo con P1000. Añadir 200 μL de criptas a cada pozo de un portaobjetos de placa/cámara de 48 pozos pre-recubierto e incubar en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C.
2. Al día siguiente, aspire los medios con P200 y agregue medios nuevos. Las células llegan a ser confluentes en 24-48 h.
3. Para inserciones de membrana de cultivo celular, agregue 200 criptas de μL (5 criptas /μL) a la parte superior de las inserciones y 600 μL de medios L-WRN completos a la parte inferior. Al día siguiente, aspire los medios usando P200 y agregue medios frescos solo a la cámara superior. Incubar la placa en una incubadora al 5% de_CO2 a 37 °C. La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) se mide todos los días utilizando el medidor epitelial voltio /ohmio (EVOM).
   NOTA: Si el cultivo tiene una lectura teer mayor que 300 Ω.cm^2,están destinados a ser confluentes. La confluencia se logra en 3-4 días. Cambiar de medio cada 2 días.

Para ilustrar la confiabilidad de las culturas epiteliales primarias de la monocapa de los dos puntos, un resumen del aislamiento de la cripta y de las imágenes representativas derivadas del protocolo se demuestra. El usuario debe tener en cuenta que las criptas aisladas se cultivan en condiciones estériles, por lo que una correcta disección y limpieza del colon es una prioridad. La figura 1 presenta los pasos clave durante el aislamiento de cripta. Las criptas aisladas (Figura 2A) ahora se cuentan y concentran (Figura 2B) para obtener una concentración de 5 criptas/μL. Después de una preparación concentrada de criptas, las células se platearán en el formato deseado (plato de cultivo, insertos de membrana o portaobjetos de cámara) y se incubarán con los medios apropiados dependiendo de las necesidades experimentales. La Figura 3 muestra la progresión del cultivo después de 24 y 48 h de cultivo en placas de 48 pozos. Las células se incuban hasta que se alcanza la confluencia deseada. Para ejemplificar las posibles aplicaciones de este método, permitimos que los pozos de placa de 48 pozos alcanzaran la confluencia y procedimos a hacer un ensayo de herida de arañazo. La Figura 4 representa un rasguño recién creado (Figura 4A) en una monocapa colonoide 2D y la misma herida 24 h después (Figura 4B). Está claro que el cultivo sigue siendo saludable y viable y hay reparación de heridas. Para generar monocapas diferenciadas, los medios se cambian de LWRN a medios de diferenciación. La diferenciación se consigue mostrando altos valores de TEER(Figura 5A),disminución de marcadores ISC ((Receptor acoplado a proteína G rica en leucina rica en repetición 5 (Lgr5) y Achaete-scute como 2 (Ascl2)) y aumento de los marcadores de diferenciación ((Alanil aminopeptidasa (Anpep), Mucina 2 (Muc2), lisizima 1 (Lyz1), Sacarosa iso-maltasa (Sis) y Chrmogranina A (Chga))(Figura 5B,C)por PCR. Otros marcadores como CDX2 y KRT20 también se pueden incluir en este panel. Además de los niveles de expresión de ARNm, la aparición de sub-tipos de células epiteliales diferenciadas en colonoides 2D cultivados en condiciones de diferenciación también se muestra por inmunofluorescencia (Muc2 y Chga; Figura 5D).

Figura 1:Preparación de muestras para la generación de monocapas saludables. La preparación de la muestra es crucial para la generación de monocapas saludables. Los pasos clave del proceso de aislamiento se describen en esta figura para que sea más fácil para el lector. El colon se extirpa del ratón, asegurándose de que no haya restos de piel. Retire cuidadosamente las heces asegurándose de no perforar el colon; esto es de vital importancia ya que el colon necesita ser capaz de contener aire y ser inflado y desinflado. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Recuento y concentración de aislamiento de cripta. (A) Criptas colónicas después de agitar las salchichas de colon. La imagen representa un campo de una caída de 20 μL. (B) Concentración de cripta para obtener 5 criptas/μL. Barra de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:Crecimiento primario de monocapa IEC. (A)Monocapas IEC 2D después de 24 h de revestimiento y eliminación de desechos celulares. (B) Monocapas IEC 2D confluentes 48 h después del revestimiento. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:Ensayos de heridas por arañazos utilizando IEC primario murino. Imágenes que muestran la herida que cura después de que un rasguño fuera hecho en monocapa epitelial de los dos puntos. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5:Diferenciación de monocapas epiteliales de colon. (A) Los medios de diferenciación crean barreras epiteliales estrechas como lo demuestra el TEER. Los medios de diferenciación causan una caída en la expresión de ARNm de(B)marcadores de células madre y regulación al alza de(C)marcadores de diferenciación. (D)Los marcadores de células epiteliales diferenciadas especializadas tales como Muc2 y Chromogranin-A se pueden también detectar vía la inmunofluorescencia de colonoids 2D directos. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.