Este protocolo describe el uso de un peróxido de hidrógeno genéticamente codificado (H2O2)-biosensoren neuronas de pez cebra cultivadas y larvas para evaluar las funciones fisiológicas de señalización de H 2 O2durante el desarrollo del sistema nervioso. Se puede aplicar a diferentes tipos de células y modificar con tratamientos experimentales para estudiar especies reactivas de oxígeno (ROS) en el desarrollo general.
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Artículo de método
Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal
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Resumen
Resumen
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas de señalización bien establecidas, que son importantes en el desarrollo normal, la homeostasis y la fisiología. Entre los diferentes ROS, el peróxido de hidrógeno(H2O2)se caracteriza mejor con respecto a los roles en la señalización celular. H2O2 se ha implicado durante el desarrollo en varias especies. Por ejemplo, se ha detectado un aumento transitorio deH2O2 en embriones de pez cebra durante los primeros días después de la fertilización. Además, el agotamiento de una importante fuente celular de H2O2, la NADPH oxidasa (NOX), deteriora el desarrollo del sistema nervioso, como la diferenciación, el crecimiento axonal y la orientación de las células ganglionares de la retina (RGCs) tanto in vivo como in vitro. Aquí, se describe un método para la obtención de imágenes intracelulares H2O2 niveles en las neuronas de pez cebra cultivadas y larvas enteras durante el desarrollo utilizando el genéticamente codificado H2O2-biosensor específico, roGFP2-Orp1. Esta sonda puede expresarse de forma transitoria o estable en larvas de pez cebra. Además, la lectura ratiométrica disminuye la probabilidad de detectar artefactos debido a la expresión génica diferencial o efectos de volumen. En primer lugar, se demuestra cómo aislar y cultivar RGCs derivados de embriones de pez cebra que expresan transitoriamente roGFP2-Orp1. Luego, utilizamos larvas enteras para monitorear los niveles deH2O2 a nivel de tejido. El sensor ha sido validado por la adición deH2O2. Además, esta metodología podría utilizarse para medir los niveles deH2O2 en tipos de células y tejidos específicos mediante la generación de animales transgénicos con expresión de biosensores específicos de tejidos. Como el pez cebra facilita las manipulaciones genéticas y de desarrollo, el enfoque demostrado aquí podría servir como una tubería para probar el papel de H2O2 durante el desarrollo embrionario neuronal y general en vertebrados.
Introducción
La señalización reactiva de especies de oxígeno (ROS) regula el desarrollo y el funcionamiento del sistema nervioso1. Una fuente celular importante de ROS son las NADPH oxidasas (NOX), que son proteínas transmembrana que generan superóxido y peróxido de hidrógeno(H2O2)2. Las enzimas NOX se encuentran en todo el sistema nervioso central (SNC), y el ROS derivado de NOX contribuye al desarrollo neuronal3,4,5,6. Se ha demostrado que el mantenimiento y la diferenciación de las ....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron revisados éticamente y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Purdue (PACUC), siguiendo las directrices de los NIH con el protocolo 2006002050 aprobado el 24/07/2020.
1. Preparación de soluciones
- Medios E2 (1x)
- Prepare soluciones de 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) y 500x E2C (100 mL) combinando todos los componentes que se muestran en la Tabla 1. Soluciones de autoclave E2A, E2B y E2C. Conservar a 4 °C.
- Para medios 1x E2: Combine 5 mL de 100x E2A, 1 mL de 500x E2B y 1 mL de 500x E2C. Llevar el volumen a 500 mL con agua estéril. Aju....
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Resultados
Los RGCs de pez cebra cultivados extienden axones dentro de 1d. En la Figura 4A se muestra una imagen representativa de la relación 405/480 del biosensor H2O2. El cuerpo celular, el axón y los conos de crecimiento son claramente visibles en las neuronas individuales. Estas neuronas pueden ser sometidas a diferentes tratamientos a lo largo del tiempo para monitorizar los cambios deH2O2. Anteriormente encontramos que la adición de 100 μM H2
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Discusión
Hay varios pasos críticos que necesitan atención a lo largo de este protocolo. Creemos que teniendo en cuenta estos puntos mejorará el flujo experimental. Para el cultivo primario de RGC, la esterilidad de la ZFCM (-) es muy importante, ya que este medio de cultivo no contiene antibióticos y la contaminación puede ocurrir antes o durante la toma de imágenes. Para evitarlo, aconsejamos preparar y utilizar ZFCM(-) sólo dentro de un gabinete de bioseguridad y hacer medios ZFCM(-) frescos regularmente (Paso 1.5). Además, las.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Subvención R01NS117701), la Fundación Nacional de Ciencias (Subvención 1146944-IOS), el Fondo de Investigación de la Médula Espinal Traumática y lesiones cerebrales de Indiana (Subvención 20000289), la Fundación de Investigación Purdue (Subvención 209911) y la Oficina del Vicepresidente Ejecutivo de Investigación y Asociaciones de la Universidad de Purdue (Subvención 210362). Agradecemos al Dr. Cory J. Weaver y Haley Roeder por establecer el protocolo de cultivo de RGC de pez cebra. Agradecemos a Haley Roeder, además, por proporcionar los datos de la Figura 4. Agradecemos a Leah Biasi y Kenny Nguyen por ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato de cultivo de 35 mm | Sarstedt | 83-3900 | |
| Plato con fondo de vidrio de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Agarosa | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Tubos capilares de vidrio de borosilicato | Sutter/Fisher Scientific | NC9029378 | |
| Cloruro de calcio dihidratado | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cubreobjetos | Corning | 2850-22 | |
| Placas de Petri desechables (100 x 15 mm) | VWR | 25384-094 | |
| Suero fetal bovino | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
| Glucosa | Sigma Aldich | G7528 | |
| HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
| Molde de inyección | Herramientas de ciencia adaptativa | TU-1 | |
| Microscopio invertido | Nikon | TE2000 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
| Microscopía confocal de barrido láser | Zeiss | 710 | |
| Leibovitz's L-15 Medium con rojo fenol | Gibco/Fisher Scientific | 11-415-064 | |
| Leibovitz's L-15 Medium sin rojo fenol | Gibco/Fisher Scientific | 21-083-027 | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Promega | V2111 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| PBS Hyclone/Fisher Scientific | SH3025601 | ||
| Penicilina/estreptomicina | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Rojo de fenol | Sigma Aldich | P0290 | |
| Feniltiourea (PTU) | Sigma Aldich | P7629 | |
| Neumático PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Poly-D-Lisina (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
| QiaQUICK PCR Kit de purificación | QIAGEN | 28104 | |
| Ratón recombinante hendidura2 | R& D Systems | 5444-SL-050 | |
| Piruvato de Sodio | Sigma Aldich | P5280 | |
| Steritop 0.22 µ Filtro m | Millipore | S2GPT05RE | |
| TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
| Tricaína Metanosulfonato | Sigma Aldich | E10521 | |
| Extractor de pipetas vertical | David Kopf Instruments | 700C |
Referencias
- Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiolo....
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Reimpresiones y permisos
