Artículo de método

Dos ensayos de infección para estudiar fenotipos de virulencia no letales en C. albicans utilizando C. elegans

DOI:

10.3791/62170

⸱

17 de mayo de 2021

 ,  , 
1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los patógenos oportunistas fúngicos pueden causar infecciones menores y potencialmente mortales, pero los fenotipos no letales se ignoran con frecuencia cuando se estudia la virulencia. Por lo tanto, desarrollamos un modelo de nematodo que monitorea los aspectos de supervivencia y reproducción del huésped para investigar la virulencia de los hongos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Si bien los patógenos pueden ser mortales para los humanos, muchos de ellos causan una variedad de tipos de infección con fenotipos no letales. Candida albicans, un patógeno fúngico oportunista de los humanos, es la cuarta causa más común de infecciones nosocomiales, lo que resulta en ~40% de mortalidad. Sin embargo, otras infecciones por C. albicans son menos graves y rara vez letales e incluyen la candidiasis vulvovaginal, que afecta a ~75% de las mujeres, así como la candidiasis orofaríngea, que afecta predominantemente a lactantes, pacientes con SIDA y pacientes con cáncer. Si bien los modelos murinos se utilizan con mayor frecuencia para estudiar la patogénesis de C. albicans , estos modelos evalúan predominantemente la supervivencia del huésped y son costosos, lentos y limitados en su replicación. Por lo tanto, se han desarrollado varios sistemas de minimodelos, incluidos Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella y Caenorhabditis elegans, para estudiar C. albicans. Estos minimodelos son muy adecuados para el cribado de bibliotecas de mutantes o diversos antecedentes genéticos de C. albicans. En este trabajo describimos dos enfoques para estudiar la infección por C. albicans utilizando C. elegans. El primero es un ensayo de fecundidad que mide la reproducción del huésped y monitorea la supervivencia de los huéspedes individuales. El segundo es un ensayo de expansión de linaje que mide cómo la infección por C. albicans afecta el crecimiento de la población huésped a lo largo de varias generaciones. En conjunto, estos ensayos proporcionan una forma sencilla y rentable de evaluar rápidamente la virulencia de C. albicans .

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans es un patógeno fúngico oportunista de los seres humanos que reside en diferentes nichos, incluyendo la cavidad oral, el tracto gastrointestinal y el tracto urogenital1. Aunque suele ser comensal, la C. albicans causa infecciones de la mucosa y del torrente sanguíneo, la última de las cuales puede ser mortal. La gravedad de la infección por C. albicans depende de la función inmunitaria del huésped, ya que los individuos inmunocomprometidos son más susceptibles a la infección que los individuos sanos1. Además de los factores relacionados con el huésped, C. albicans tiene varios rasgos de virulencia que incluyen hifas, formación de biopelículas y producción de proteinasas secretoras de aspartil (SAP), que funcionan para promover la adhesión e invasión de C. albicans en las células epiteliales del huésped2, y candidalisina, una toxina peptídica citolítica 3,4. En conjunto, esto sugiere que la virulencia de C. albicans es un fenotipo complejo que resulta de una interacción entre el patógeno y su entorno huésped. Por lo tanto, la investigación de la virulencia se estudia mejor utilizando organismos modelo que sirven como entornos de hospedaje, en contraste con los enfoques in vitro.

Se han desarrollado varios modelos de hospedadores, incluyendo organismos vertebrados e invertebrados, para estudiar la infección por C. albicans. El modelo murino, considerado el estándar de oro, se utiliza a menudo por su sistema inmune adaptativo e innato, y su capacidad para monitorear la progresión de la enfermedad tanto sistémicamente como en órganos específicos5. Sin embargo, existen limitaciones significativas para este modelo de hospedador, incluyendo costos de mantenimiento, pequeño número de descendientes y disminución de la potencia y reproducibilidad asociadas con tamaños de muestra pequeños5. Por lo tanto, se han desarrollado otros organismos modelo más simples como el pez cebra (Danio rerio), la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), la polilla de la cera (Galleria mellonella) y el nematodo (Caenorhabditis elegans). Estos organismos modelo no mamíferos son más pequeños, requieren menos mantenimiento de laboratorio y los tamaños de muestra más grandes permiten una mayor potencia y reproducibilidad en comparación con los modelos murinos. Cada uno de estos modelos tiene ventajas y desventajas específicas que deben tenerse en cuenta a la hora de elegir un modelo de infección. G. mellonella ofrece el ambiente fisiológicamente más similar al humano, ya que puede cultivarse a 37 °C y tiene varias células fagocíticas7. Además, este modelo permite la inyección directa de un inóculo específico7. Sin embargo, no existe un genoma completamente secuenciado ni un método establecido para crear cepas mutantes. Al igual que G. mellonella, el modelo de D. rerio permite la inyección directa de un inóculo específico 5,7. También tiene un sistema inmunológico adaptativo e innato5, que es exclusivo de este modelo no mamífero, pero requiere tanques de reproducción acuáticos para mantenerse. D. melanogaster y C. elegans tienen ventajas y desventajas similares, que incluyen genomas completamente secuenciados que son fáciles de manipular y generar cepas mutantes7 pero que no tienen inmunidad adaptativa ni citocinas7. De todos estos modelos de no mamíferos, C. elegans tiene el ciclo de vida más rápido, se autofertiliza para generar un gran número de crías genéticamente idénticas y es el más susceptible a las pantallas a gran escala 6,7,8. C. elegans ha sido extremadamente potente para el cribado de alto rendimiento de fármacos antifúngicos 9,10, caracterizando los factores de virulencia7 e identificando las redes de defensa del huésped específicas de C. albicans 11. El sistema inmune innato en C. elegans tiene múltiples componentes que están altamente conservados con los humanos12. Las defensas innatas del huésped incluyen la producción de péptidos antimicrobianos13 (AMPs) y especies reactivas de oxígeno 14,15,16.

La gravedad de la infección por C. albicans se mide predominantemente por la supervivencia del huésped, pero no puede capturar fenotipos de virulencia no letales. Un aspecto que a menudo se pasa por alto de la aptitud del huésped es la reproducción, pero varios estudios sugieren que C. albicans afecta la reproducción al reducir la viabilidad de los espermatozoides, lo que sugiere que este puede ser un aspecto importante de la aptitud del huésped para estudiar. Por lo tanto, el impacto de la infección por C. albicans en la fecundidad del huésped es una forma útil de estudiar los fenotipos de virulencia no letal. Hemos desarrollado dos ensayos de infección utilizando C. elegans para investigar tanto los fenotipos de supervivencia como los de reproducción en huéspedes sanos19,20. Aquí describimos los ensayos de fecundidad y expansión de linaje. La fecundidad mide tanto la progenie producida como la supervivencia de un solo huésped, y la expansión del linaje evalúa las consecuencias de la infección a lo largo de tres generaciones de huéspedes. Demostramos cómo se pueden utilizar estos ensayos para detectar mutantes de deleción de C. albicans para capturar diferencias dramáticas y sutiles en los fenotipos de virulencia letales y no letales.

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Protocolo

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1. Pasos preparatorios para los experimentos

  1. Preparación de cultivos de C. albicans y Escherichia coli
    NOTA: Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1.
    1. Mantener las cepas de C. albicans y E. coli como reservas de glicerol a -80 °C.
    2. Con un palillo estéril, se cuela la C. albicans deseada sobre la levadura sólida peptona dextrosa (YPD) (1% de extracto de levadura, 2% de bactopeptona, 2% de glucosa, 1,5% de agar, 0,004% de adenina, 0,008% de uridina) y crece durante la noche a 30 °C.
      NOTA: Si la cepa de C. albicans es auxotrófica, complemente el medio con los aminoácidos necesarios.
    3. Con un asa estéril o un palillo de dientes, inocule una sola colonia de C. albicans en 2 ml de YPD líquido. Incubar a 30 °C con agitación durante 24 h.
    4. Con un palillo estéril, escurre E. coli (OP50) en placas de agar Caldo Luria (LB; 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl, 15 g/L de agar). Incubar durante la noche a 30 °C.
    5. Inocular una sola colonia de OP50 en 50 mL de LB. Incubar a 30 °C con agitación durante la noche.
  2. Preparación de medios de crecimiento de nematodos
    1. En un matraz de 2 L, añadir 29 g de polvo de medio de crecimiento de nematodos (NGM; 17,5 g/L de agar, 3,0 g/L de cloruro de sodio, 2,5 g/L de peptona, 0,005 g/L de colesterol) a 1 litro de agua y mezclar con una barra agitadora.
    2. Para inhibir el crecimiento excesivo de E. coli y permitir la proliferación de C. albicans , suministre NGM con 0,2 g/L de sulfato de estreptomicina después del autoclave.
      NOTA: Si se usa NGM para el mantenimiento de nematodos, no se requiere estreptomicina.
  3. Mantenimiento de las poblaciones de nematodos
    1. Extienda 300 μL de cultivo de E. coli durante la noche en placas de agar NGM preparadas con un esparcidor de metal. Esta técnica se denominará siembra.
    2. Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente (RT). Cultive las placas durante la noche a 30 °C.
    3. Mantenga la población de nematodos cortando cada 3-4 días en una placa NGM recién sembrada con E. coli. Conservar a 20 °C. La fragmentación es una técnica utilizada para transferir rápidamente una población aleatoria de nematodos a una placa recién sembrada, lo que permite que las poblaciones proliferen. Para hacer esto, use una espátula estéril para cortar un pequeño cuadrado (1 x 1 pulgada) de la placa de agar NGM. Transfiera con cuidado el cuadrado a una nueva placa NGM sembrada con el lado con los nematodos hacia abajo en el nuevo agar8.
      NOTA: C. elegans mantenido a 20 °C producirá descendencia ~ 48 h más tarde, lo cual es útil considerar al sincronizar una población de nematodos. C. elegans mantenida a 25 °C se desarrollará y reproducirá más rápido y las poblaciones mantenidas a 15 °C tendrán un crecimiento más lento.
  4. Sincronización de poblaciones de nematodos
    1. Comience con una población de nematodos existente mantenida en NGM/OP50.
    2. Pipetee ~3 mL de tampón M9 en la placa NGM que contiene nematodos. Lave los huevos de nematodos del plato y use suavemente la punta de la pipeta para raspar los huevos del agar (tienden a pegarse). Con una pipeta P1000, transfiera el líquido que contiene huevos y gusanos a un tubo cónico de 15 ml. Para evaluar la cantidad de huevos que aún están en el plato, use un microscopio de disección para observar el agar.
    3. Centrífuga cónica durante 2 min a 279 x g y RT.
    4. Retire el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la pelletza de nematodos.
    5. Agregue 3 mL de solución de lejía al 25% ("PRECAUCIÓN" al manipular).
    6. Invierta el tubo durante 2 minutos. Verifique que los nematodos estén muertos con el microscopio de disección: estarán rectos y no móviles.
      NOTA: Esto solo matará a los nematodos existentes. La integridad de los óvulos no se verá afectada.
    7. Centrífuga durante 2 min a 279 x g y RT.
    8. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 3 mL M9.
    9. Centrífuga durante 2 min a 279 x g y RT.
    10. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 300 μL de M9.
    11. Con un microscopio de disección, compruebe la concentración de huevos pipeteando 5 μL de huevos en una pequeña placa de Petri. La concentración ideal debe estar entre 20 y 100 huevos. Si el cultivo está demasiado diluido, concentre la solución por centrifugación y eliminación del exceso de líquido. Si el cultivo está demasiado concentrado, agregue más M9 hasta alcanzar la concentración deseada.
  5. Preparar cultivos de C. albicans y E. coli para la infección por nematodos (siembra).
    1. Prepare una solución en blanco. En una cubeta, combine 900 μL de ddH2O y 100 μL de YPD líquido.
    2. Inserte la cubeta en el espectrofotómetro. Establezca la longitud de onda en 600 nanómetros usando la flecha hacia arriba. Haga clic en el botón "0 ABS 100% T" para configurar la solución en blanco.
    3. En una cubeta nueva, combine 900 μL de ddH2O y 100 μL de cultivo de levadura durante la noche. Saque la solución en blanco del espectrofotómetro y agregue la cubeta que contiene la solución de levadura. Registre la densidad óptica que se muestra en la pantalla (no presione ningún botón). Multiplique la lectura por 10 (la solución de levadura medida fue una dilución de 1 en 10).
    4. Normalice el cultivo a 3,0 OD600/mL con ddH2O en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. 1 OD600 es aproximadamente 3 x 10-7 UFC/mL21.
      NOTA: Si la lectura de OD600 es de 6,7, 3 OD/6,7 OD= 0,447 mL, agregue 447 μL de cultivo de C. albicans al tubo de microcentrífuga. Centrífuga a velocidad máxima (16, 873 x g) durante 30 s. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en 1 mL de ddH2O.
    5. Transfiera el cultivo de E. coli durante la noche a un tubo cónico de 50 ml.
    6. Centrifugar el cultivo a 279 x g durante 2 min a RT.
    7. Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando ~1 mL.
    8. Vuelva a suspender el pellet en el sobrenadante restante y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL prepesado.
    9. Gire el tubo de la microcentrífuga a la velocidad máxima durante 30 s.
    10. Con una pipeta p1000, retire el sobrenadante y pese el pellet final.
    11. Diluir E. coli a 200 mg/mL en ddH2O.
    12. Utilice los cálculos de la mezcla maestra (Tabla 2) y escale adecuadamente.

2. Ensayo de fecundidad

NOTA: Los datos representativos se muestran en la Tabla Suplementaria 1 y un esquema se muestra en la Figura 1A.

  1. Obtenga o prepare lo siguiente: placas de Petri de 35 mm x 10 mm, NGM suplementado con 0,2 g/L de sulfato de estreptomicina, cultivo de E. coli OP50, LB, cultivo de C. albicans , YPD, Wire Pick, tampón M9 (3,0 g/L KH2PO4, 6,0 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L NaCl, 1,0 g/L NH4Cl), Tubos cónicos de 15 mL.
    Dos días antes del experimento
  2. Inocular las cepas de C. albicans en 2 mL de YPD y E. coli (OP50) en 50 mL de LB y crecer durante la noche a 30 °C.
  3. Prepare placas de Petri de 35 mm x 10 mm con NGM suplementado con 0,2 g/L de sulfato de estreptomicina. El número de platos preparados debe durar todo el experimento. El número recomendado de réplicas es de 10 por tratamiento. Para 10 réplicas, se utilizarán 70 placas. 1 L de NGM hará ~ 250 placas.
    Un día antes del experimento
  4. Siembre placas de agar NGM de 35 mm x 10 mm suplementadas con estreptomicina para el día 0, día 2 y día 3 de acuerdo con el protocolo de siembra descrito anteriormente con la concentración de mezcla maestra (Tabla 2). Pipetea la cantidad adecuada de mezcla maestra en el centro de la placa. No es necesario esparcir el cultivo porque un solo punto de crecimiento microbiano es suficiente para la alimentación del huésped y nos permite identificar fácilmente a los huéspedes fuera de la semilla. Incubar las placas durante la noche en RT.
    NOTA: La mezcla maestra del Día 0 contiene 50 μL de "semilla" por réplica para cada tratamiento experimental. Los días 2 a 7 incluyen 10 μL de "semilla" por réplica para cada tratamiento experimental. No hay placa de Día 1 porque los nematodos alcanzarán la etapa L4 48 h después de ser sincronizados en una placa de Día 0. Una vez que alcancen L4, los nematodos individuales se transferirán a las placas del Día 2.
Para 1 réplicaCondición de control de E. coli (OP50)Condición de tratamiento de C. albicans y E. coli (OP50)
OP50H2OTotalOP50C. albicansH2OTotal
Día 06.25 UL43.75 UL50 ul6.25 UL1.25 UL42.5 UL50 ul
Días 2-71.25 UL8.75 UL10 ul1.25 UL.25 ul8.5 UL10 ul

Tabla 2: Volúmenes de mezcla maestra de cultivos de E. coli y C. albicans necesarios para infectar nematodos para el ensayo de fecundidad.

Día del Experimento (Día 0)

  1. Sincronice los nematodos y coloque ~50 huevos en cada réplica del Día 0 de las placas de control (solo OP50) y las placas de tratamiento (C. albicans + OP50). Incubar a 20 °C durante 48 h.
    Día 2
  2. Transfiera un solo nematodo L4 eligiendo8 de la placa del Día 0 a cada una de las placas sembradas replicadas del Día 2. Los huéspedes L4 se pueden identificar por un pequeño bolsillo en el centro de la cara dorsal de su cuerpo22. Transfiera los nematodos eclosionados y madurados del mismo tipo de placa sembrada (es decir, los nematodos L4 de las placas de control D0 deben transferirse a las placas de control del día 2).
  3. Se necesitan cultivos de C. albicans en 2 mL de YPD y E. coli (cepa OP50) en 50 mL de LB.
    Día 3
  4. Transfiera los nematodos de las placas del Día 2 a las placas sembradas del Día 3, llevando un registro de cada réplica (es decir, la Réplica A del Día 2 debe moverse a la placa Replicar A del Día 3).
  5. Incubar el día 2 (que solo contiene huevos) y el día 3 (que contiene el adulto soltero) en placas a 20 °C durante 24 h.
  6. Semilla de NGM de 35 mm x 10 mm suplementada con placas de estreptomicina durante los días 4 y 5 utilizando 10 μL de mastermix por placa (Tabla 2) e incubar placas en RT durante 24 h.
    Día 4
  7. Transfiera los nematodos de las placas del día 3 a las placas sembradas del día 4.
  8. Incubar las placas del día 3 y del día 4 a 20 °C durante 24 h.
  9. Usando un telescopio de disección, cuente la progenie viable para cada placa del Día 2. Fíjate en las réplicas que hayan muerto o que ya no estén en la placa (censuradas). Una vez que se registre el número de progenies, deseche las placas del día 2.
    NOTA: Censurado se refiere a los nematodos que desaparecen en la placa. Esto puede ocurrir cuando los nematodos se arrastran fuera de la placa. Aunque es menos común durante la ventana de 24 horas, los cadáveres de los nematodos muertos se desintegran en el agar, lo que también resulta en censura. Los datos censurados no se incluyen en el análisis final de los datos de progenie y supervivencia.
  10. Inocular nuevos cultivos de cepas de C. albicans en 2 mL de YPD y E. coli (OP50) en 50 mL de LB.
    Día 5
  11. Transfiera los nematodos de las placas del día 4 a las placas sembradas del día 5.
  12. Incubar las placas del día 4 y del día 5 a 20 °C durante 24 h.
  13. Cuente la progenie viable para cada plato del Día 3. Fíjate en las réplicas que hayan muerto o que ya no estén en la placa (censuradas). Una vez que se registre el número de progenies, deseche las placas del día 3.
  14. Semilla de NGM de 35 mm x 10 mm suplementada con placas de estreptomicina durante los días 6 y 7 utilizando 10 μL de mastermix por placa (Tabla 2) e incubar placas a temperatura ambiente durante 24 h.
    Día 6
  15. Transfiera los nematodos de las placas del día 5 a las placas sembradas del día 6.
  16. Incubar las placas del día 5 y del día 6 a 20 °C durante 24 h.
  17. Cuente la progenie viable para cada plato del Día 4. Fíjate en las réplicas que hayan muerto o que ya no estén en la placa (censuradas). Una vez que se registre el número de progenies, deseche las placas del día 4.
    Día 7
  18. Transfiera los nematodos de las placas del día 6 a las placas sembradas del día 7.
  19. Incubar las placas del día 6 y del día 7 a 20 °C durante 24 h.
  20. Cuente la progenie viable para cada plato del Día 5. Fíjate en las réplicas que hayan muerto o que ya no estén en la placa (censuradas). Una vez que se registre el número de progenies, deseche las placas del día 5.
    Día 8
  21. Cuente la progenie viable para cada plato del Día 6. Fíjate en las réplicas que hayan muerto o que ya no estén en la placa (censuradas). Una vez que se registre el número de progenies, deseche las placas del día 6.
    Día 9
  22. Cuente la progenie viable para cada plato del Día 7. No cuente el nematodo más grande (padre). Fíjate en las réplicas que hayan muerto o que ya no estén en la placa (censuradas). Una vez que se registre el número de progenies, deseche las placas del día 7.
    NOTA: Este ensayo también se puede utilizar para evaluar la supervivencia. Registre cuándo murió cada nematodo. Al final del experimento, se puede comparar el porcentaje de nematodos que sobrevivieron durante el experimento de siete días para cada tratamiento. Los nematodos a veces se alejan de la fuente de alimento/patógeno e intentan trepar por los toboganes de la placa de Petri. Revise todas las áreas de la placa antes de continuar. Los nematodos muertos generalmente dejarán un cadáver. Censura cualquier nematodo que no pueda ser localizado y no cuentes ese nematodo como muerto. No incluya datos censurados en el análisis final de la progenie y la supervivencia.
  23. Analice los datos para el tamaño de la cría y la reproducción tardía utilizando ANOVA de un factor o Kruskal-Wallis, dependiendo de la normalidad de los conjuntos de datos, así como las múltiples pruebas post-hoc de Tukey/Dunn para identificar diferencias significativas entre los grupos de tratamiento utilizando el software GraphPad Prism. Detecte diferencias entre las curvas de supervivencia utilizando la prueba de rango logarítmico de Wilcoxon.

3. Ensayo de expansión de linaje

NOTA: Los datos representativos se muestran en la Tabla Suplementaria 2 y un esquema se muestra en la Figura 2A.

  1. Obtenga o prepare lo siguiente: placas de Petri de 100 mm x 15 mm que contengan agar NGM suplementado con 0,2 g/L de sulfato de estreptomicina, cultivos de E. coli OP50, cultivos LB, C. albicans , YPD, tampón M9, Wire Pick, tubos cónicos de 15 mL.
    Día -2
  2. Inocular las cepas de C. albicans en 2 mL de YPD y E. coli (OP50) en 50 mL de LB y crecer durante la noche a 30 °C.
    Día -1
  3. Semilla de placas de agar NGM de 100 mm x 15 mm suplementadas con estreptomicina con 300 μL de mastermix por placa (Tabla 3). Extienda la mezcla maestra en el plato con un esparcidor de metal estéril. Incubar las placas durante la noche a 30 °C. Se recomiendan seis repeticiones por tratamiento. Por lo tanto, prepare siete placas (una placa para nematodos sincronizados, seis placas para cada nematodo adulto) por tratamiento.
Condición de control de E. coli (OP50)C. albicans y E. coli (OP50). Condición de tratamiento
Para 1 réplicaOP50H2OTotalOP50C. albicansH2OTotal
1.25 UL8.75 UL10 ul37.5 UL7.5 UL255 UL300 ul

Tabla 3: Volúmenes de mezcla maestra de cultivos de E. coli y C. albicans necesarios para infectar nematodos para el ensayo de expansión del linaje.

Crecimiento de la población de nematodos: Día 0

  1. Sincronice los nematodos y coloque 10-25 huevos en una sola placa para cada control (solo OP50) y tratamiento (C. albicans + OP50) e incube a 20 °C durante 48 h.
    Día 2:
  2. Transfiera un solo gusano L4 de cada placa de control y tratamiento del día 0 a las placas sembradas del mismo tratamiento. Los huéspedes L4 se pueden identificar por un pequeño bolsillo en el centro de la cara dorsal de su cuerpo22.
  3. Incubar a 20 °C durante 5 días (un total de una semana después de la sincronización).
    Día 7:
  4. Con una pipeta p1000, lave toda la población de nematodos de cada placa con 5 mL de tampón M9 y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL.
  5. Almacenar a 4 °C durante 1 h para permitir que los nematodos se asienten y facilitar el recuento.
  6. Diluya cada cónico hasta un volumen final de 10 mL con tampón M9.
  7. Para cada réplica biológica, cuente el número de nematodos en una alícuota de 20 μL. Repita esto para obtener 6 réplicas técnicas para cada réplica biológica. Volver a calcular para determinar el tamaño total de la población. Si las muestras están demasiado diluidas (es decir, menos de 10 nematodos por muestra), concentre la población en un volumen más pequeño de tampón M9.
    NOTA: La centrifugación de nematodos vivos no dañará a los nematodos.
    Ejemplo de cálculo:
    70 hosts = X (total de hosts)
    20 μL (alícuota) 10.000 μL (volumen total)
  8. Analice los datos para la expansión del linaje utilizando ANOVA de un factor o Kruskal-Wallis, dependiendo de la normalidad de los conjuntos de datos, así como las múltiples pruebas post-hoc de Tukey/Dunn para identificar diferencias significativas entre los grupos de tratamiento utilizando el software GraphPad Prism.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos dos ensayos que miden la virulencia de C. albicans como fenotipo no letal utilizando C. elegans como modelo de infección. El primer ensayo, fecundidad, monitorea cómo la infección por C. albicans afecta a los huéspedes individuales para la producción y supervivencia de la progenie. El segundo ensayo, la expansión del linaje, mide cómo la infección por C. albicans afecta el crecimiento de la población a lo largo de varias genera...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos dos ensayos simples que miden la virulencia de los hongos. Ambos ensayos aprovechan C. elegans como un sistema de hospedador que incluye el monitoreo de fenotipos de hospedadores letales y no letales. Por ejemplo, los ensayos de fecundidad investigan el éxito reproductivo de los huéspedes infectados individuales y al mismo tiempo miden la supervivencia individual. El monitoreo diario proporciona no solo el tamaño total de la cría, sino también el momento reprod...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Dorian Feistel, Rema Elmostafa y McKenna Penley por su ayuda en el desarrollo de nuestros ensayos y recopilación de datos. Esta investigación está respaldada por NSF DEB-1943415 (MAH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,5 mL microtubos eppendorf 3810XMillipore Sigma Z606340
100 mm x 15 mm placas de PetriSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon CónicosFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdeninaMillipore SigmaA8626
Agar (granulado, grado bacteriológico)Apex BioResearch producede aluminio 20-248
(95% pt, calibre 32)Genesee Scientific59-1M32P
Cloruro de amonioMillipore Sigma254134
Esparcidor de células bacterianasSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Tubos de cultivo desechables (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
(Iluminador de alta intensidad NI-150)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Centro de GenéticaOP50
GlucosaMillipore Sigma50-99-7
Placas de Petri medianas (35 x 10 mm)Falcon
SP Scienceware8TL24
Medios de crecimiento de nematodos (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potasio Fosfato monobásicoSigmaP0662-500G
Cloruro de sodioFisher ScientificBP358-1
Fosfato de sodioFisher ScientificBP332-500
Sulfato de estreptomicinaThermo-Fisher Scientific11860038
TriptonaMillipore Sigma91079-40-2
UridinaMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Extracto de levaduraMillipore Sigma8013-01-2
alambre Microscopio de disección Espátula de metal 353001

Referencias

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