Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

Summary

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Abstract

Las células se exponen continuamente a diversos agentes perjudiciales del ADN, induciendo diferentes respuestas celulares. La aplicación de enfoques bioquímicos y genéticos es esencial para revelar eventos celulares asociados con el reclutamiento y el ensamblaje de complejos de reparación del ADN en el sitio del daño del ADN. En los últimos años, se han desarrollado varias herramientas poderosas para inducir daños en el ADN específicos del sitio. Además, las nuevas técnicas seminales nos permiten estudiar estos procesos a nivel de resolución unicelular utilizando células fijas y vivas. Aunque estas técnicas se han utilizado para estudiar diversos procesos biológicos, aquí presentamos los protocolos más ampliamente utilizados en el campo de la reparación del ADN, inmunotinción por fluorescencia (IF) e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que en combinación con el daño del ADN específico del sitio basado en endonucleasa permiten visualizar y cuantificar la ocupación genómica de los factores de reparación del ADN de una manera dirigida y regulada, respectivamente. Estas técnicas proporcionan herramientas poderosas para que los investigadores identifiquen nuevas proteínas unidas al locus genómico dañado, así como sus modificaciones postraduccionales necesarias para su regulación de ajuste fino durante la reparación del ADN.

Introduction

Nuestro genoma está siendo constantemente desafiado por varios agentes dañinos del ADN. Estos ataques pueden derivar de fuentes ambientales, como la luz UV o la irradiación, así como de fuentes endógenas, como subproductos metabólicos causados por estrés oxidativo o errores de replicación^1,2. Estas lesiones pueden afectar la integridad de una o ambas cadenas de ADN, y si los errores generados se vuelven persistentes, con frecuencia conduce a translocaciones e inestabilidad del genoma, lo que puede resultar en tumorigénesis^3,4. Para mantener la integrid....

Protocol

1. Inmunodetección de proteínas específicas

1. Preparación del cultivo celular y configuración experimental
   1. Mantenga las células de U2OS en monocapas en el medio de cultivo de DMEM complementado con el suero fetal del becerro del 10%, la glutamina de 2 milímetros, y la solución antibiótico-antimicótica del 1%.
      NOTA: Para la inducción de daño en el ADN basada en endonucleasas, utilice un medio tratado con carbón o libre de esteroides para evitar fugas en el sistema.
   2. Crecen células en un ambiente humidificado al 5% de_CO2 a 37 °C hasta un 80% de confluencia, renovando el medio cada 2-3 días.
   3. Aspirar el....

Results

El estudio de los procesos de reparación inducidos por DSB dirigidos al sitio en las células se puede lograr a través de la transfección estable o transitoria. Sin embargo, cabe señalar que la transfección estable asegura una población celular homogénea, lo que da una respuesta celular unificada y por lo tanto más confiable. En el caso de la transfección transitoria, sólo una pequeña proporción de la población celular toma y mantiene el plásmido, lo que introduce diversidad en el experimento. El establecimiento de sistem.......

Discussion

Aunque la reparación de la DNA sea un campo de investigación relativamente reciente, nuestro conocimiento se está ampliando rápidamente con la ayuda de varios métodos bioquímicos y microscópicos. Preservar la información genética es crucial para las células, ya que las mutaciones que ocurren en los genes involucrados en los procesos de reparación se encuentran entre las principales causas de tumorigénesis y, por lo tanto, es esencial dilucidar los pasos clave de las vías de reparación del ADN.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarosa	Lonza	50004
Solución Antibiótica-Antimicótica (100×),	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A estabilizada. X (fosfo S139) anticuerpo	Abcam	ab26350
Albúmina V de la fracción sérica bovina	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Tampón de carga cian/amarillo	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM con 1,0 g/L de glucosa, sin L-glutamina	Lonza	12-707F
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Ovejas Anti-Ratón IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Ovejas Anti-Conejo IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Etanol	Molar Productos Químicos	02910-101-340
Suero fetal bovino (origen en América del Sur), aprobado por la UE	Gibco	ECS0180L
Solución de formaldehído al 37% libre de ácido	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ Suplemento	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycine	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Alcohol isoamílico	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatina de Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Polvo sin Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phenol	Sigma Aldrich	P4557
TUBOS	Sigma Aldrich	P1851
Polisorbato 20 (Tween 20)	Productos químicos molares	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ Oro Antidecoloración Mountant con DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Inhibidor de la proteasa Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinasa K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs anticuerpo	Abcam	ab18192
RNasa A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acetato-Tampón EDTA	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Tripsina de páncreas porcino	Sigma Aldrich	T4799
Tripsina-EDTA (0,5%), rojo sin fenol	Gibco	15400054