Artículo de método

Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial

DOI:

10.3791/62183

⸱

18 de febrero de 2021

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute, University of California

En este artículo

Resumen

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Este artículo describe una técnica de trasplante de tejido que fue diseñada para probar las propiedades de señalización y patrones del prosencéfalo basal durante el desarrollo craneofacial.

Resumen

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El embrión aviar se ha utilizado como sistema modelo durante más de un siglo y ha llevado a una comprensión fundamental del desarrollo de los vertebrados. Una de las fortalezas de este sistema modelo es que el efecto y la interacción entre los tejidos se pueden evaluar directamente en embriones quiméricos. Hemos demostrado previamente que las señales del cerebro anterior contribuyen a la morfogénesis facial al regular la forma del dominio de expresión del erizo sónico (SHH) en la zona ectodérmica frontonasal (FEZ). En este artículo, se describe el método para generar las quimeras del cerebro anterior y proporcionar ilustraciones de los resultados de estos experimentos.

Introducción

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Gran parte de la investigación contemporánea en biología del desarrollo se centra en el papel de los genes en la formación de embriones. Existen buenas herramientas para examinar los mecanismos de desarrollo desde una perspectiva genética. Sin embargo, los embriones se ensamblan y sufren morfogénesis en respuesta a las interacciones tisulares. El sistema aviar es una herramienta clásica utilizada para evaluar la variedad de interacciones tisulares que regulan el desarrollo por las siguientes razones: la embriología es bien entendida, los embriones son fácilmente accesibles, las herramientas para el análisis de los sistemas aviares están bien desarrolladas y los embriones son baratos.

El sistema de trasplante aviar ha sido ampliamente empleado para el rastreo del linaje y para evaluar las interacciones tisulares durante el desarrollo durante casi un siglo 1,2,3,4. Este sistema fue utilizado para investigar un centro de señalización, la Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ), que regula la morfogénesis del maxilar superior5, y se publicó un video describiendo esa técnica previamente6. Además de la codorniz-polluelo, otras especies también se han utilizado para producir quimeras para el análisis de las interacciones tisulares. Por ejemplo, el ratón FEZ fue trasplantado de ratones salvajes tipo7 y mutantes8, y otros han utilizado sistemas de pato, codorniz y polluelo para evaluar el papel de la cresta neural en el modelado del esqueleto facial 9,10,11,12.

En este trabajo, se evaluó el papel del cerebro anterior en la regulación del patrón de expresión génica en el FEZ mediante el trasplante del prosencéfalo ventral recíprocamente entre embriones de codorniz, pato y pollo, porque se requiere una señal del cerebro anterior para inducir la expresión del erizo sónico en el FEZ. Los trasplantes de prosencéfalo no son únicos en el campo. Estos trasplantes se utilizaron para evaluar el desarrollo de la motilidad en embriones de codorniz y pato13, aunque en estos experimentos también se trasplantaron tejidos que contribuyeron a derivados no neurales. En otros trabajos, los circuitos auditivos en aves han sido evaluados por trasplante de prosencéfalo14, pero estos trasplantes contenían presuntas células de la cresta neural, que contribuyen a la forma facial 9,10 y participan en la regulación de la expresión de SHH en el FEZ 15. Por lo tanto, se diseñó un sistema para trasplantar solo el prosencéfalo ventral de una especie de ave a otra antes del cierre del tubo neural para evaluar el papel del cerebro en la forma facial16 (Figura 1A, B). Este método carecía de contaminación de la cresta neural del injerto. En este artículo, se ilustra el método y se describen los resultados esperados, y se discuten los desafíos enfrentados.

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Protocolo

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El pato blanco de Pekín (Anas platyrhynchos), el pollo Livorno blanco (Gallus gallus) y la codorniz japonesa (Cortunix coturnix japonica) se incuban a 37 °C en una cámara humidificada hasta que se ajustan a HH7/817.

1. Preparación del tejido del donante

NOTA: Se ha descrito la preparación de reactivos y herramientas y cómo abrir huevos para la manipulación experimental6.

  1. Prepare medios DMEM con rojo neutro, una pipeta de transferencia de vidrio y agujas de tungsteno afiladas.
  2. Exponga los embriones (como se muestra en6).
  3. Recolectar injertos de tejido del lado izquierdo del prosencéfalo basal de embriones en etapa 7/8. Use agujas de tungsteno afiladas curvas6 para incidir suavemente un pedazo del prosencéfalo que mide ~0.3 mm de largo por 0.2 mm de ancho, asegurándose de no incluir el endodermo subyacente deslizando la aguja debajo del cerebro anterior para que la aguja quede paralela al eje del tubo neural.
  4. Usando la pipeta de transferencia de vidrio, recoja el injerto del embrión donante.
  5. Transfiera el injerto a DMEM que contenga rojo neutro (0.01% en PBS, 23 ° C) durante 2 minutos para teñirlo, y luego coloque el injerto teñido en DMEM que no contenga rojo neutro hasta que esté listo para el injerto.

2. Preparación del anfitrión

  1. Incubar huevos fertilizados de gallina blanca Livorno (Gallus gallus) a 37 °C en una cámara humidificada hasta HH7/8 17.
  2. Exponga los embriones (como se muestra en6).
  3. Usando agujas de tungsteno afiladas, prepare el sitio del injerto cortando suavemente, luego extrayendo una pieza de 0.3 mm por 0.2 mm de prosencéfalo basal del lado izquierdo para acomodar el injerto como se hizo para aislar el tejido del donante.
  4. Tenga cuidado de evitar la interrupción excesiva del endodermo subyacente, que será evidente ya que los gránulos de yema comenzarán a filtrarse a través de cualquier desgarro que se haga. Esto requiere práctica y no todos los intentos tendrán éxito.
  5. Después de transferir al huésped6, coloque el injerto para reemplazar el prosencéfalo basal extirpado del huésped.
  6. Coloque la cinta adhesiva firmemente sobre el orificio y devuelva el embrión a la incubadora a 37 °C durante el tiempo adecuado para el análisis.

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Resultados

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Evaluación del quimerismo y la contaminación por trasplantes
Para evaluar las quimeras, se debe abordar el alcance del quimerismo y la contaminación del injerto con otros tipos de células. La creación de quimeras mediante el trasplante de tejidos de codorniz en embriones de pollo permite este tipo de análisis. Usando el anticuerpo QCPN las células de codorniz se pueden visualizar y distinguir de los tejidos del huésped (Figura 1 C, D). En este caso, solo ...

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Discusión

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El método descrito permite examinar las interacciones tisulares entre el prosencéfalo basal y el ectodermo adyacente. Este enfoque difiere de los métodos anteriores de trasplante del cerebro anterior, porque el tejido del donante estaba restringido al prosencéfalo ventral. Esto elimina el trasplante de las células de la cresta neural, que han demostrado participar en la morfología facial de patrones 9,10. Por lo tanto, restringir el injerto al prosencéfalo basal ...

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Divulgaciones

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Todos los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de adjudicación R01DE019648, R01DE018234 y R01DE019638.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBSTEKTEKZR114
35x10 mm Placa de PetriFalcon1008
DMEMThermofisher11965084
PortaagujasFine Science Tools26016-12
Neutro RojoSigma553-24-2
Nº 5 Pinzas DumontFine Science Tools11252-20
Pasteur PipetsThermofisher13-678-6B
QCPNanticuerpo Estudios del desarrollo Banco de hibridomas, Universidad de Iowa, Iowa, EE. UU.
Tijeras Herramientas deciencia fina14058-11
Aguja de tungstenoHerramientas de ciencia fina26000

Referencias

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  1. Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
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  3. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  4. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
  5. Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
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  7. Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
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