Estudios de alta resolución de proteínas en membranas naturales mediante RMN de estado sólido

Resumen

Este trabajo detalla rutinas básicas sólidas sobre cómo preparar muestras de proteínas de membrana marcadas con isótopos y analizarlas a alta resolución con métodos modernos de espectroscopia de RMN de estado sólido.

Resumen

Las proteínas de membrana son vitales para la función celular y, por lo tanto, representan importantes dianas farmacológicas. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de estado sólido (ssNMR) ofrece un acceso único para sondear la estructura y la dinámica de dichas proteínas en membranas biológicas de complejidad creciente. Aquí, presentamos la espectroscopia moderna de RMN de estado sólido como una herramienta para estudiar la estructura y la dinámica de las proteínas en membranas lipídicas naturales y a escala atómica. Dichos estudios espectroscópicos se benefician del uso de métodos de ssNMR de alta sensibilidad, es decir, ssNMR detectado por protones (¹H) y ssNMR compatible con DNP (polarización nuclear dinámica). Utilizando la proteína BamA de la membrana externa bacteriana y el canal iónico KcsA, presentamos métodos para preparar proteínas de membrana marcadas con isótopos y para derivar información estructural y de movimiento mediante ssNMR.

Introducción

Los estudios estructurales y de movimiento de proteínas de membrana en entornos fisiológicamente relevantes plantean un desafío a las técnicas tradicionales de biología estructural¹. Los métodos modernos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear de estado sólido (ssNMR) ofrecen un enfoque único para la caracterización de las proteínas de membrana ^2,3,4,5,6,7 y se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar las proteínas de membrana, incluidas las bombas de proteínas incrustadas en la membrana⁸, los canales ^9,10,11 o los receptores ^12,13,14,15. Los avances técnicos, como los campos magnéticos ultra altos >1.000 MHz, las frecuencias de giro de ángulo mágico rápido >100 kHz y las técnicas de hiperpolarización¹⁶ han establecido la ssNMR como un método poderoso para el estudio de proteínas de membrana en entornos de complejidad cada vez mayor, desde liposomas hasta membranas celulares e incluso células completas. Por ejemplo, el DNP se ha convertido en una herramienta poderosa para este tipo de experimentos (ver referencia 17,18,19,20,21,22,23,24,25). Más recientemente, la ssNMR detectada por ¹H ofrece cada vez más posibilidades para estudiar proteínas de membrana con alta resolución espectral y sensibilidad 25,26,27,28,29. Este trabajo destaca dos proteínas de membrana bacteriana que están involucradas en funciones esenciales, es decir, la inserción de proteínas y el transporte de iones. Las proteínas correspondientes, BamA 25,30,31,32,33 y KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (o variantes quiméricas de las mismas ^10,40) han sido examinadas por ssNMR métodos durante más de una década.

Aquí se presenta un protocolo representativo para la preparación y caracterización de ssNMR de proteínas de membrana de origen bacteriano. Los diferentes pasos del protocolo se muestran en la Figura 1. En primer lugar, se explica la expresión, el marcaje de isótopos, la purificación y la reconstitución de la membrana de BamA. A continuación, se presenta un flujo de trabajo general para la caracterización de la proteína de membrana por ssNMR; específicamente, la asignación de esqueletos de proteínas de membrana ^utilizandossNMR detectado 1 H en un giro de ángulo mágico rápido. Por último, se detalla la configuración básica y la adquisición de experimentos compatibles con la polarización nuclear dinámica (DNP), que aumentan significativamente la sensibilidad de la señal ssNMR.

Protocolo

1. Producción de BamA-P4P5 etiquetados uniformemente con 2 H, ¹³C, ¹⁵N

NOTA: Si bien este protocolo requiere trabajar con bacterias Gram negativas no patógenas, es imprescindible cumplir con los procedimientos básicos de seguridad biológica, es decir, usar gafas de seguridad, batas de laboratorio, guantes y seguir los procedimientos operativos estándar institucionales para el trabajo con microorganismos.

1. Utilice una sola colonia de E. coli BL 21 Star (DE3) que contenga el plásmido pET11aΔssYaeT que codifica para E. coli BamA-P4P5 para inocular 50 mL de caldo de Lysogeny suplementado con 50 μg/L de ampicilina.
2. Cultive el cultivo a 37 °C a 200 rpm hasta alcanzar un diámetro exterior de₆₀₀ de 0,6. Girar a 2.000 x g durante 10 min. Vuelva a suspender el pellet en 50 mL de M9 (ver Tabla 1) hasta un DE_{máximo de 600} de 0,1.
   NOTA: Todos los pasos de crecimiento futuros se llevan a cabo en las condiciones establecidas anteriormente, a menos que se indique lo contrario.
3. Aumente el cultivo hasta OD₆₀₀ de 0,5. Girar a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el pellet en 50 mL de M9 que contenga un 90% de D₂O (consulte la tabla 1 para la receta) hasta un diámetro exterior máximo de₆₀₀ de 0,1. Cultive el cultivo durante la noche a 30 °C a 200 rpm.
4. Centrifugar el cultivo a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el pellet en el precalentado 50 mL 90% D₂O M9 hasta un diámetro exterior máximo de₆₀₀ de 0,1. Crezca hasta alcanzar un OD₆₀₀ de 1.0.
5. Centrifugar el cultivo a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Prepare 100 mL de medio 100% D₂O M9 con cantidades enriquecidas con isótopos de glucosa no enriquecida y cloruro de amonio. Vuelva a suspender en medio 100% D₂O M9 hasta un OD máximo de₆₀₀ de 0,1. Crezca hasta alcanzar un OD₆₀₀ de 0,7.
6. Centrifugar el cultivo a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 mL de medio 100% D₂O M9 con isótopos (ver Tabla 1) hasta un OD_{máximo 600} de 0,1.
7. Permita que el cultivo crezca hasta que se alcance un OD₆₀₀ de 0,6-0,9. Inducir con 1 mM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Extraer durante 4 h y recolectar las celdas a 4.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente.

2. Purificación, repliegue y formación de proteo-liposomas BamA-P4P5

NOTA: Todos los pasos de esta sección deben realizarse en una campana extractora. Se debe tener especial cuidado al abrir los tubos después de la centrifugación y limitar los aerosoles nocivos.

1. Descongele el pellet en hielo. Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de tampón frío 1. Consulte la Tabla 2 para ver los búferes.
2. Centrifugar la solución a 4.000 x g durante 20 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de H₂O destilado en frío. Deje que la suspensión se incube en hielo durante 10 min.
3. Girar la suspensión a 4.000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Vuelva a suspender en 10 mL de tampón frío 2 y deje incubar en hielo durante 30 min.
4. Complemente la mezcla con 10 ml adicionales de tampón frío 2 e incube durante 30 minutos más en hielo. Agregue 0.5% de n-Dodecil-B-D-Maltoside (DDM) y revuelva suavemente.
5. Sonicar la muestra en hielo a 13 kHz hasta que se utilicen pulsos de encendido/apagado de 10 s de duración. Centrifugar a 25.000 x g durante 20 min a 4 °C. Lavar tres veces con 20 mL de Buffer 3. Centrifugar a 25.000 x g durante 20 min a 4 °C.
6. Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de tampón 4. Incubar a 37 °C durante 30 min. Sonicar la muestra en hielo a 13 kHz, hasta que se utilicen pulsos de encendido/apagado de 10 s de duración.
7. Centrifugar la muestra a 25.000 x g durante 20 min a 4 °C. Repita los pasos 2.4 a 2.6 omitiendo la adición del inhibidor de la proteasa y la incubación a 37 °C.
8. Lave el pellet con 20 mL de agua y dos veces con Buffer 3. Centrifugar a 25.000 x g durante 20 min a 4 °C. Alícuota la suspensión en tubos de microcentrífuga de 1 mL y haga girar los tubos de microcentrífuga a máxima velocidad en una centrífuga de sobremesa durante 20 minutos. La pureza del cuerpo de inclusión se evalúa con un 10% de gel SDS-Page, ver Figura 2A. El rendimiento esperado para BamA-P4P5 purificado triplemente (²H, ¹³C, ¹⁵N) etiquetado es de 30 mg/L.
9. Solubilizar cuerpos de inclusión en 200 μL de tampón 5 y 300 μL de_H2O. Añadir cloruro de guanidio (GdnCl) 6M. Ajustar el volumen del tubo de microcentrífuga a 1 mL con H₂O. Vortex la mezcla e incubar durante 4 h a temperatura ambiente. Agite los tubos de la microcentrífuga periódicamente (cada 30 min).
10. Centrifugar a 100.000 x g durante 1 h a 4 °C. Utilice la ley de Beer-Lambert para determinar la concentración de proteínas en 280 nm. El coeficiente de extinción molar es de 117.120 ^{M-1 cm-1}. Si la concentración es >100 μM, diluir con 1x Tampón 5 con 6 M de GdnCl. Diluir rápidamente la proteína 10x en Tampón 6. Incuba la mezcla durante la noche a temperatura ambiente.
    NOTA: Para la ultracentrifugación, utilice tubos de 1,5 ml de grado de ultracentrifugación.
11. Determine la eficiencia del repliegue utilizando un gel SDS-Page seminativo. Tome dos alícuotas de 10 μL del paso 2.10 y agregue 10 μL de tampón Lameili (tampón 8) a cada alícuota. Hervir una muestra durante 10 min a 95 °C; Deja la otra alícuota en hielo. A continuación, pase ambas muestras a 14 mA en un gel SDS-Page al 10%. Las partes de apilamiento y funcionamiento de los geles carecen de agente reductor y SDS. La tinción de proteínas se logra utilizando el colorante Coomassie. Los resultados esperados se muestran en la Figura 2B.
12. Centrifugar la muestra a 4.000 x g durante 20 min a 4 °C. Concentrar la muestra hasta un volumen de trabajo de 8 mL utilizando un filtro centrífugo de 30 kDa. Centrifugar la muestra a 4.000 x g durante 20 min a 4 °C. Mida la absorbancia de proteínas a 280 nm. Al igual que en el paso 2.10, determine la concentración de proteína.
13. Calcule la cantidad de lípidos necesaria para una proporción de lípidos a proteínas de 10:1 (LPR-mol/mol). A partir de una caldo de cloroformo, añadir la cantidad necesaria de lípidos, calculada en el paso 2.12, en un matraz de fondo redondo (RBF) de 100 mL. Evacúe el cloroformo del RBF bajo un suave chorro de nitrógeno. Coloque RBF en alto vacío durante 3 h. Hidratar la película lipídica con 1 mL de Tampón 7. Incubar RBF durante 10 min a 37 °C.
14. Agregue la mezcla de proteínas (del paso 2.12) al RBF.
15. Diluir la mezcla de proteínas/lípidos (a partir del paso 2.14) hasta el volumen final de 50 mL en el RBF. Utilice Buffer 7 suplementado con 1x inhibidor de proteasa disuelto en DMSO e incube durante 30 min a 37 °C.
16. Diálisis frente a 100 volúmenes de tampón 7 durante 2 semanas (utilice un tubo de diálisis de corte de peso molecular de 12-14 kDa). Durante las primeras 24 horas, realice la diálisis a temperatura ambiente con la adición de Buffer 7 fresco cada 8 horas. Posteriormente, cambie el tampón una vez al día y realice la diálisis a 4 °C.

3. Llenado del rotor ssNMR

1. Después del paso 2.16, centrifugar durante 30-60 min a 10.000 x g a 4 °C para que se forme un pellet. Retire el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: La técnica que se describe a continuación se ha optimizado para un rotor de 3,2 mm, pero es aplicable para casi cualquier diámetro de rotor.
2. Pipetee la muestra en el rotor y gírela suavemente con una centrífuga de mesa.
   NOTA: Dependiendo de la consistencia de la muestra, se puede utilizar una herramienta de densificación para compactar la muestra, o una espátula en lugar de una pipeta para colocar la muestra en el rotor.
3. Repita este proceso 2-3 veces hasta que el rotor se llene a la altura correcta y verifique si queda suficiente espacio para la tapa, como lo indica la línea de marcador en la herramienta de densificación. Cierre el rotor con la herramienta de posicionamiento de tapas sobre una superficie uniforme. Marque la mitad del borde inferior del rotor.
   NOTA: Las nuevas generaciones de rotores ssNMR vienen con una marca láser duradera en el borde inferior para la detección óptica de la frecuencia de giro del rotor. De lo contrario, se sugiere el uso de un rotulador; ya que el detector MAS ha sido optimizado específicamente para la tinta sharpie.
4. Use una lupa para verificar si la tapa está bien colocada.

4. Caracterización de muestras por espectroscopía 2D ¹³C- ¹³C sssNMR

1. Inserte el rotor en el imán, utilizando la rutina de giro automático de la unidad MAS, gire la muestra hasta la frecuencia MAS deseada entre 10 y 20 kHz MAS mientras enfría la muestra a la temperatura establecida de 270 K. Sintoniza y combina los canales ¹H y ¹³C.
   NOTA: Para la elección de la frecuencia MAS, evite hacer coincidir accidentalmente la distancia de desplazamiento químico entre la región espectral Cα y la región de carbono carbonilo con la frecuencia de giro, es decir, evite la condición de resonancia rotacional de primer orden⁴¹.
2. Optimice un experimento de polarización cruzada⁴² (CP) de ^{1 H-13}C variando la potencia de rf en el canal de protones de 25 a 80 kHz. Los parámetros típicos son una potencia de rf de 45 kHz en ¹³C, un desacoplamiento heteronuclear ¹H de 80-100 kHz⁴³ durante la adquisición, un retardo de reciclaje de 1,8-2,0 s y 64 escaneos.
   1. Optimice el tiempo de contacto CP para obtener la máxima sensibilidad de la señal en los carbonos alifáticos.
   2. Determine la longitud del pulso de ¹H 90° en el experimento de ¹³C-CP multiplicando el pulso inicial por cuatro, es decir, optimizando un pulso de 360°, y varíe la longitud hasta que la señal haya desaparecido. Incluya un pulso rectangular directamente después de la transferencia de CP y optimice la longitud de pulso de ¹³C 90° de forma análoga.
3. Ejecute un experimento de difusión de espín impulsado por protones (PDSD) 2D ^{13 C-13}C, como PARIS, con un tiempo de transferencia de magnetización de 30 ms para detectar correlaciones intrarresiduales y medir la calidad de la muestra. Transfiera los niveles de potencia, el tiempo de contacto y las longitudes de pulso de 90° del experimento ¹³C-CP previamente optimizado. Utilice un tiempo de adquisición de 4-6 ms en la dimensión indirecta. Procese el espectro con funciones de campana de seno cuadrado (QSIN) o, para muestras insensibles, ensanchamiento de línea exponencial en ambas dimensiones.
4. Extraiga porciones de picos cruzados aislados y determine el ancho de línea a medias alturas. Un ancho de línea entre ~0,3-1,0 ¹³C ppm es indicativo de una muestra bien ordenada, ideal para la caracterización de ssNMR, mientras que un ancho de línea superior a 1,0 ¹³C ppm es indicativo de heterogeneidad conformacional que puede comprometer la caracterización de ssNMR. El espectro 2D CC PARIS de BamA que se muestra en la Figura 3A es un ejemplo de una proteína bien ordenada que proporciona espectros de alta calidad.

5. Asignación de la columna vertebral mediante espectroscopía ssNMR 3D detectada en ¹H

1. Adquisición de huellas dactilares espectrales NH 2D
   1. Llene la muestra en un rotor de 1,3 mm, como se ha descrito anteriormente. Inserte el rotor en el imán, haga girar la muestra a 10-20 kHz MAS y enfríe la muestra a una temperatura establecida de 240-250 K o menos, según las especificaciones del cabezal de la sonda ssNMR. Utilice la interfaz de la unidad MAS para aumentar la frecuencia MAS gradualmente en pasos de 5 kHz a 60 kHz MAS.
   2. Optimice las amplitudes de CP, los tiempos de contacto y las longitudes de pulso de 90° en experimentos de CP de ¹³C y ¹⁵N. Utilice amplitudes alrededor de 30-50 o 70-100 kHz en los canales heteronucleares y varíe la amplitud en el canal ¹H de 80-180 kHz. Utilice un retardo de reciclaje de 0,7-1,2 s, junto con un desacoplamiento de protones heteronucleares de baja potencia de 15 kHz⁴⁴. Además, consulte la referencia⁴⁵ para obtener más detalles prácticos sobre cómo configurar experimentos CP ssNMR.
   3. Adquiere un experimento NH 2D para medir la resolución de ¹H. Transfiera los ¹⁵parámetros N-CP y utilice aproximadamente 15 y 25 ms de tiempo de adquisición en las dimensiones directa e indirecta. Para la primera transferencia de ¹H a ¹⁵N CP, utilice el tiempo de contacto previamente optimizado. Para la retrotransferencia de ¹⁵N a ¹H, utilice un tiempo de contacto de 0,7-1,0 ms para minimizar la transferencia de magnetización interresidual.
   4. Utilice 50-250 ms de agua MISSISSIPPI^{supresión 46}, dependiendo del contenido de agua de la muestra. Procese el espectro con funciones de campana de seno cuadrado (QSIN) en ambas dimensiones. Extraiga porciones de picos cruzados aislados y determine el ancho de línea a medias alturas. En la Figura 3B se muestra un ejemplo de un espectro NH^{2D 25} de alta calidad para BamA-P4P5 integrado en membrana.
2. Asignaciones de red troncal
   1. Optimice un experimento CP específico de 1D ¹⁵N a ¹³Cα⁴⁷. Coloque el portador de ¹³C en el centro de la región Cα alrededor de 55 ppm. Utilice una amplitud de rf de ¹³C de 20 kHz y varíe la amplitud de ¹⁵N de 35 a 45 kHz para una transferencia máxima a las señales Cα y una transferencia mínima a las señales de carbonilo. Optimice el tiempo de contacto de 3 a 10 ms en incrementos de 1 ms.
   2. Ejecute un experimento CαNH en 3D. Transfiera todas las amplitudes CP, los tiempos de contacto y las longitudes de pulso de los pasos previamente optimizados. Utilice aproximadamente 10 ms y 30 ms en las dimensiones de adquisición directa e indirecta. Procese el espectro con funciones de campana sin' al cuadrado (QSIN) en las tres dimensiones.
   3. Optimice una transferencia de magnetización 1D Cα a CO DREAM⁴⁸. Comience con una transferencia de CP específica de ¹⁵N a ¹³Cα. Luego, transfiera la magnetización de Cα a CO usando un bloqueo de espín en el canal ¹³C. Varíe la amplitud de RF de 20 a 35 kHz para una transferencia óptima. Optimice el tiempo de transferencia de 4 a 10 ms.
   4. Ejecute un experimento 3D Cα(CO)NH. Transfiera todas las amplitudes de RF, los tiempos de contacto y las longitudes de pulso de los pasos optimizados anteriormente. Utilice aproximadamente 10 ms y 30 ms en las dimensiones de adquisición directa e indirecta. Procese el espectro con funciones de campana sin' al cuadrado (QSIN) en las tres dimensiones.
   5. Repita y adapte los pasos 1 a 4 para los experimentos análogos 3D de CONH y CO(Cα)NH. Utilice este cuarteto de experimentos 3D para caminatas secuenciales de Cα y CO para asignar la columna vertebral de la proteína, como se muestra en el ejemplo de KcsA en la Figura 4²⁸.

6. Dinámica de proteínas por espectroscopía ssNMR detectada en ¹H

1. Para estudios de ¹⁵N T₁ , utilice el experimento NH 2D previamente optimizado a 60 kHz MAS e incluya un retardo después del primer paso de ^{polarización}cruzada de 1 H a ¹⁵N. Adquiera una serie de experimentos NH 2D y varíe el retardo de 0 a 16 s utilizando pasos de, por ejemplo, 0, 2, 4, 8 y 16 s.
2. Represente las intensidades normalizadas de las señales resueltas en función del aumento del tiempo de retardo. Ajuste el decaimiento de T₁ a exponenciales simples de acuerdo con y = exp^(-x/T1), siendo y la intensidad de la señal en el tiempo de decaimiento x.
3. Análogamente, para estudios de ¹⁵N T_1rho, incluya un impulso de bloqueo de espín en el programa de impulsos en el canal de ¹⁵N con una amplitud de rf entre 15 y 20 kHz después del primer paso de polarización cruzada de ¹H a ¹⁵N^26,49. Adquiera una serie de experimentos NH 2D y varíe el retraso de 0 a 150 ms y ajuste el decaimiento T_1rho de las señales resueltas a exponenciales simples. En la Figura 5^27,28 se muestran datos ilustrativos de ¹⁵N T_1rho para los canales de K⁺ incrustados en la membrana.

7. Polarización nuclear dinámica

NOTA: Los siguientes pasos preparatorios se relacionan con el uso de configuraciones DNP comerciales que utilizan rotores MAS de zafiro de 3,2 mm (Figura 6)²⁰. El uso de los rotores de circonio u otros equipos DNP puede conducir a mejoras de la señal DNP más bajas.

1. Resuspenda el pellet de proteína de membrana (del paso 3.1) en 50 μL de tampón DNP deuterado (60% (v/v) de d8- y glicerol deuterado, y 15 mM de AMUPol⁵⁰. Para experimentos a 800 MHz, recomendamos utilizar NATriPOL-3^{51 de} 10 mM. Véase también la referencia⁵² para más detalles sobre los aspectos prácticos de los experimentos DNP ssNMR.
2. Centrifugar durante 10-20 min a 100.000 x g a 4 °C para que se forme un pellet. Retire el sobrenadante con una pipeta.
3. Enfriar previamente el adaptador centrífugo y los componentes del rotor MAS de zafiro de 3,2 mm a <4 °C. Los siguientes pasos (7.4-7.7) deben realizarse lo más rápido posible para evitar que los agentes DNP se reduzcan.
4. Coloque el rotor de zafiro de 3,2 mm en el adaptador de centrífuga y llénelo con la suspensión de proteoliposomas del paso 7.2.
5. Pipetear cuidadosamente la muestra de proteína de membrana resuspendida contra la pared interna del rotor con una punta de pipeta de 200 μL. Deje que la solución se deslice hacia abajo hasta la parte inferior del rotor. Asegúrese de que no se formen burbujas de aire.
6. Girar la muestra en el rotor durante 5-10 minutos a 4.500 x g a 4 °C. Elimine el sobrenadante que contiene el exceso de jugo de DNP pipeteándolo con cuidado sin alterar la pelletización de la celda. Repita los pasos 6.4-6.6 hasta que el rotor esté lleno.
7. Coloque con cuidado el espaciador de politetrafluoroetileno (PTFE) utilizando el tornillo espaciador en la parte superior del rotor.
8. Coloque el rotor, con la tapa hacia abajo, en un émbolo de rotor⁵³ y sumerja el rotor en nitrógeno líquido. Espere al menos 30-60 s para que el rotor y la muestra se congelen.
9. Ponga en marcha la unidad intercambiadora de calor y enfríe la sonda DNP a ~90K.
10. Ponga la unidad MAS en modo manual y ajuste la temperatura variable (VT) a 135 l/h y los caudales de gas de los rodamientos y la transmisión a ~6 l/h.
11. Engage Eject en la consola MAS.
12. Transfiera la muestra congelada del paso 7.8 del N2 líquido al recogedor de muestras y colóquela en la sonda (consulte también la referencia⁵³).
13. Aumente manualmente la presión del cojinete de la sonda (Bp) a ~500 mbar antes de conectar el "Inserto". Esto es aconsejable para un giro estable y seguro del rotor.
14. Aumente la tasa MAS al valor deseado utilizando el procedimiento descrito en la referencia⁵³.
15. Verifique las mejoras de DNP con y sin microondas utilizando experimentos CP 1D estándar (ver también, por ejemplo, referencia^51,54) (Figura 7) antes de continuar con experimentos multidimensionales, por ejemplo, experimentos CC 2D descritos en la sección 3 de este artículo.

Resultados

La Figura 2 muestra geles representativos para la pureza del cuerpo de inclusión (Panel A) y el repliegue de los cuerpos de inclusión (Panel B3). La Figura 2 confirma la purificación exitosa de BamA-P4P5 marcado con ^{13 C,15}N.

La Figura 3A muestra un espectro 2D ^{13 C-13}C típico de una proteína de membrana bien ordenada, y la Figura 3B

Discusión

Las proteínas de membrana son actores clave en la regulación de funciones celulares vitales tanto en organismos procariotas como eucariotas; Por lo tanto, comprender sus mecanismos de acción a niveles atómicos de resolución es de vital importancia. Las técnicas de biología estructural existentes han llevado bastante lejos la comprensión científica de las proteínas de membrana, pero se han basado en gran medida en datos experimentales recopilados de sistemas in vitro desprovistos de membr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Molibdato de amonio	Merck	277908
Cloruro de amonio-15N	Cortecnet	CN80P50
Ampicilina	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonase	EMD Millipore Corp	70746-3
Ácido bórico	Merck	B6768
azul de bromofenol	Sigma	B0126
dicloruro de calcio	Merck	499609
Cloruro de colina	Sigma	C-1879
Cloruro de cobalto	Merck	449776
Sulfato de cobre	Merck	C1297
D-Biotina	Merck	8512090025
Óxido de deuterio	Cortecnet	CD5251P1000
Dimetilsulfóxido	Merck	D9170
Etilendiaminoácido tetraacético	Sigma Aldrich	L6876
Ácido fólico	Sigma	F-7876
Glucosa 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
Glicerol	Honeywell	G7757
Glicerol (12C3, 99.95% D8, 98%)	Euliótopo	CDLM-8660-PK
glicerol (no enriquecido)	Honeywell	G7757-1L
Glycine	Sigma Aldrich	50046
Clorhidrato de guanidina	Roth Carl	NR.0037.1
Sulfato de hierro	Merck	307718
isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido	Thermofisher	R0392
Caldo de lisogén	Merck	L3022
Lisozyme	Sigma Aldrich	L6876
Cloruro de magnesio - hexahidratado	Fluka	63064
sulfato de magnesio	Merck	M5921
fosfato monopotásico	Merck	1051080050
mioinositol	Sigma	I-5125
n-Dodecil-B-D-maltósido	Acros Organics	3293702509
N,N-dimetildodecilamina N-óxido Merck		40236
Nicatinamida	Sigma	N-3376
Ácido pantoténico	Sigma	21210-25G-F
inhibidor de la proteasa	Sigma	P8849
Pyridoxal-HCl	Sigma Aldrich	P9130
Riboflavina	Aldrich	R170-6
Cloruro de sodio	Merck	K51107104914
Dihidrógeno fosfato de sodio - monohidrato	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
Dodecil sulfato de sodio	Thermo-scientific	28365
Hidróxido de sodio	Merck	1,06,49,81,000
Sacarosa	Sigma Life Science	S9378
Tiamina-HCl	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
Cloruro de zinc	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1.5 mL Ultra-tubos	Beckman Filtro	357448
30 kDa	Amicon UFC903024
zafiro de 3,2 mm Rotor DNP con tapones	Cortecnet	H13861
Inserto de teflón de 3,2 mm	Cortecnet	B6628
Empacador/desempacador de muestras de 3,2 mm	Cortecnet	B6988
Rotor MAS de pared regular de 3,2 mm	Cortecnet	HZ16913
Rotor MAS de pared regular de 3,2 mm	Cortecnet	HZ09244
kit de herramientas para rotor de pared delgada de 3,2 mm	Cortecnet	B136904
rotor MAS de 1,3 mm + tapones	Cortecnet	HZ14752
herramienta de llenado de 1,3 mm	Cortecnet	HZ14714
empacadora de muestras de 1,3 mm	Cortecnet	HZ14716
removedor	de tapas de 1,3 mmCortecnet	HZ14706
1,3 mm Herramienta de juego de tapones	Cortecnet	HZ14744
Tubo de diálisis 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie -	Negro Merck	HS15094