Evaluación y cuantificación de micro brechas epiteliales en la mucosa colónica mediante tinción de inmunofluorescencia

Summary

Aquí, describimos un nuevo método para visualizar la ubicación específica donde se mejora la permeabilidad transcelular y paracelular en la mucosa colónica inflamada. En este ensayo, aplicamos un colorante fluorescente de 10 kDa conjugado con un dextrano fijable en lisina para visualizar regiones de alta permeabilidad (HPR) en la mucosa colónica.

Abstract

Las células epiteliales que recubren la mucosa intestinal crean una barrera física que separa el contenido luminal del intersticio. El deterioro de la barrera epitelial se ha asociado con el desarrollo de diversas patologías como las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). En la mucosa inflamada, las erosiones superficiales o microerosiones que corrompen las monocapas epiteliales corresponden a sitios de alta permeabilidad. Varios mecanismos han sido implicados en la formación de microerosiones, incluyendo el desprendimiento celular y la apoptosis. Estas microerosiones a menudo representan brechas epiteliales microscópicas distribuidas aleatoriamente en el colon. La visualización y cuantificación de esas brechas epiteliales se ha convertido en una herramienta importante para investigar la función de la barrera epitelial intestinal. Aquí, describimos un nuevo método para visualizar la ubicación específica donde se mejora la permeabilidad transcelular y paracelular en la mucosa colónica inflamada. En este ensayo, aplicamos un colorante fluorescente de 10 kDa conjugado con un dextrano fijable en lisina para visualizar regiones de alta permeabilidad (HPR) en la mucosa colónica. El uso adicional de marcadores de muerte celular reveló que la HPR abarca focos apoptóticos donde se produce la extrusión/desprendimiento epitelial. El protocolo aquí descrito proporciona un enfoque simple pero efectivo para visualizar y cuantificar las microerosiones en el intestino, que es una herramienta muy útil en modelos de enfermedad, en los que la barrera epitelial intestinal está comprometida.

Introduction

La mucosa gastrointestinal (GI) crea una barrera física que separa el entorno extracelular y el entorno interno del huésped, y participa en la absorción de nutrientes, agua y electrolitos. La barrera intestinal abarca una capa de moco constituida por glicoproteínas, una monocapa de células epiteliales, y la lámina propia subyacente son células inmunes y estromales residen. Las células epiteliales intestinales que forman la barrera física están unidas entre sí por diferentes complejos proteicos, que incluyen la unión adherente (AJ), la unión estrecha (TJ) y los desmosomas (DM). El deterioro de la función de barrera epitelial aumenta la....

Protocol

Todos los procedimientos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) del CINVESTAV.

1. Preparación de materiales y reactivos

1. Precalentar la solución de Hartmann (130 mM de NaCl, 28 mM de lactato, 4 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂) a 37 °C mientras burbujea con 95% de O₂/5% de CO₂. Mantener el pH fisiológico (7,4) de la solución.
2. Para analizar la permeabilidad paracelular pasiva, prepare una solución de trabajo disolviendo 1 mg/mL de FITC-Dextrano (4 kDa) y 1 mg/mL de RITC-Dextrano (10 kDa) en ....

Results

En la mucosa inflamada, las erosiones superficiales o microerosiones comprometen la integridad de la monocapa de células epiteliales y representan sitios de alta permeabilidad ^7,8. Para evaluar estas posibilidades, analizamos la permeabilidad pasiva en la mucosa colónica inflamada en un modelo murino de colitis por sulfato sódico de dextrano. En resumen, durante 5 días, los ratones C57BL/6J recibieron un 2,5% de DSS (p/v, 40-50 kDa) disuelto en agua potable. Este.......

Discussion

La homeostasis epitelial resultante del equilibrio de la proliferación celular y la apoptosis epitelial mantiene una barrera intestinal adecuada y funcional. Muchos trastornos clínicos, como la EII, se acompañan o caracterizan por alteraciones de la permeabilidad intestinal, inflamación de la mucosa y alteración de la homeostasis epitelial¹. La interacción entre esos procesos sigue siendo muy controvertida. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos enfoques de investi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpo activo contra la caspasa-3 (1:1000)	Señalización celular	9664	Caspasa-3 escindida (Asp175)(5AE1) Conejo mAb
Alexa Fluor 488  anti conejo (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti ratas (1:1000)	Invitrogen	A21209
Microscopio confocal (Leica TCS SP8x)	Detectores Leica		HyD  y láser de luz blanca
Anticuerpo E-Cadherin (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 anticuerpo Etanol
70%	Genérico
Fixable-Dextrano	Invitrogen	D22914	Dextrano, Alexa Fluor, 10,000 MW, aniónico,
fijable FITC Dextrano	Sigma	46944	Isotiocianato de fluoresceína– dextrano M. Peso 4 kDa
Solución de Hartmann	PiSA	HT Incubadora PiSA
(AutoFlow NU-8500)Lector de	Nuaire
(Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Placa de poliestireno blanco y negro	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehído	Sigma	P6148
Faloidina (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Faloidina
RITC Dextrano	Sigma	R8881-100MG	Rodamina B Isotiocianato-Dextrano. M. Peso 10 kDa
Anticuerpos secundarios (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Anticuerpos secundarios conjugados con HRP
Hilos de sutura	Genérico		Seda trenzada y poliéster trenzado Se prefieren las suturas quirúrgicas.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1