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Artículo de método

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

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DOI:

10.3791/62206

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12 de febrero de 2021

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1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Resumen

La generación de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre ha atraído un gran interés en la medicina de precisión sobre las enfermedades cardiovasculares. La diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) está modulada por vías de señalización definidas que son esenciales para el desarrollo del corazón embrionario. Se han desarrollado numerosos métodos de diferenciación cardíaca en plataformas 2-D y 3-D con diversas eficiencias y rendimiento de cardiomiocitos. Esto ha desconcertado a los investigadores fuera del campo, ya que la variedad de estos métodos puede ser difícil de seguir. Aquí presentamos un protocolo integral que elabora una generación y expansión robustas de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Primero describimos un protocolo de reprogramación iPSC de alta eficiencia a partir de la muestra de sangre de un paciente utilizando vectores del virus de Sendai no integrados. A continuación, detallamos un pequeño método de diferenciación monocapa mediado por moléculas que puede producir cardiomiocitos de latido robusto a partir de la mayoría de las líneas iPSC humanas. Además, se introduce un protocolo de expansión de cardiomiocitos escalable utilizando una molécula pequeña (CHIR99021) que podría expandir rápidamente los cardiomiocitos derivados del paciente para aplicaciones de grado industrial y clínico. Al final, se representan protocolos detallados para la identificación molecular y la caracterización electrofisiológica de estos iPSC-CM. Esperamos que este protocolo sea pragmático para principiantes con conocimientos limitados sobre desarrollo cardiovascular y biología de células madre.

Introducción

El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas por humanos ha revolucionado la medicina cardiovascular moderna1,2. Las iPSC humanas son capaces de autorrenovarse y generar todos los tipos de células en el corazón, incluidos los cardiomiocitos, las células endoteliales, las células del músculo liso y los fibroblastos cardíacos. Los cardiomiocitos derivados de iPSC para pacientes (iPSC-CM) pueden servir como recursos indefinidos para modelar enfermedades cardiovasculares genéticamente hereditarias (ECV) y probar la seguridad cardíaca de nuevos medicamentos3. En particular, los iPSC-CM de los pacientes están bien preparados para investigar etiologías genéticas y moleculares de las ECV que se derivan de defectos en los cardiomiocitos, como el síndrome de QT largo4 y la miocardiopatía dilatada (DCM)5. Combinados con la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9, los iPSC-CM de los pacientes han abierto una vía sin precedentes para comprender la compleja base genética de las ECV, incluidos los defectos cardíacos congénitos (CHD)6,7,8. Los iPSC-CM humanos también han exhibido potenciales para servir como fuentes de células autólogas para reponer el miocardio dañado durante un ataque cardíaco9. En los últimos años, se ha vuelto primordial generar iPSC-CM humanos de alta calidad con subtipos definidos (auricular, ventricular y nodal) para la regeneración cardíaca y las pruebas de drogas10.

La diferenciación cardíaca de las iPSC humanas ha avanzado mucho en la última década. Los métodos de diferenciación han pasado de la diferenciación espontánea basada en el cuerpo embrionario (EB) a la diferenciación cardíaca químicamente definida y dirigida11. Las moléculas de señalización clave esenciales para el desarrollo embrionario del corazón, como Wnt, BMP, Nodal y FGF, se manipulan para mejorar la diferenciación de los cardiomiocitos de las iPSC humanas10,12. Los avances significativos incluyen la modulación secuencial de la señalización Wnt (activación seguida de inhibición) para la generación robusta de cardiomiocitos a partir de iPSCs humanas13,14. Se han explorado recetas de diferenciación cardíaca definidas químicamente para facilitar la producción a gran escala de cardiomiocitos de latido15,16, que tienen el potencial de actualizarse a la producción a nivel industrial y clínico. Además, la expansión robusta de los primeros iPSC-CM humanos se logra mediante la exposición a la activación constitutiva de Wnt utilizando un pequeño producto químico (CHIR99021)17. Más recientemente, los cardiomiocitos específicos del subtipo se generan a través de la manipulación de las vías de señalización de ácido retinoico (AR) y Wnt en ventanas de diferenciación específicas durante el compromiso del linaje de cardiomiocitos de iPSCs humanas18,19,20,21,22.

En este protocolo, detallamos un procedimiento de trabajo para la generación robusta y proliferación de CM humanos originados en células mononucleares de sangre periférica del paciente. Presentamos protocolos para 1) reprogramar PBMC humanos a iPSCs, 2) generación robusta de cardiomiocitos de latidos a partir de iPSCs humanos, 3) expansión rápida de iPSC-CMs tempranos, 4) caracterización molecular de iPSC-CMs humanos, y 5) medición electrofisiológica de iPSC-CM humanos a nivel de una sola célula por pinza de parche. Este protocolo cubre los procedimientos experimentales detallados para convertir las células sanguíneas de los pacientes en cardiomiocitos que golpean.

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Protocolo

Los protocolos experimentales y el consentimiento informado para sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en el Nationwide Children's Hospital.

1. Preparación de medios de cultivo celular, soluciones y reactivos

  1. Preparar medios PBMC
    1. Mezclar 20 ml de medios de cultivo PBMC basales (1x) y 0,52 ml de suplemento. Añadir 20 μL de SCF y FLT3 cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 y EPO cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL) y 200 μL de L-glutamina alternativa (100x). Mézclalos bien. Filtrar en una campana estéril utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm. Nombra esto como Medios de Sangre Completos.
    2. Mezclar 20 mL de medios de cultivo PBMC basales (1x) y 0.52 mL del Suplemento. Añadir 200 μL de L-glutamina alternativa (100x). Mézclalos bien. Filtre con una unidad de filtro de 0,22 μm. Nombra esto como Suplemento de Medios sanguíneos.
  2. Preparar medios E8 completos
    1. Mezcle 500 ml de medios basales E8 y 10 ml de suplemento de E8 (descongelado durante la noche a 4 ° C) para hacer medios E8 completos. Equilibre a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
  3. Preparar medios de paso de iPSC
    1. Añadir 40 μL de inhibidor de roca Y-27632 (dilución 1:5.000, concentración de stock: 10 mM) a 200 mL de medio E8 completo. Mézclalo bien. Equilibrar a RT antes de usar.
  4. Preparar medios de diferenciación de cardiomiocitos
    1. Media I: Mezclar 500 mL de RPMI1640 con 10 mL de B27 menos suplemento de insulina (50x).
    2. Medio II: Añadir un volumen apropiado de material CHIR99021 (inhibidor de GSK3) al Medio I (concentración final de CHIR99021 de 6 μM). Homogeneizar.
    3. Medio III: Añadir un volumen apropiado de material IWR-1 (inhibidor de Wnt) a Media I (concentración final de IWR-1 de 5 μM). Homogeneizar.
    4. Media IV: Mezclar 500 mL de RPMI1640 con 10 mL de suplemento de B27 (50x). Homogeneizar.
    5. Media V: Mezclar 500 mL de RPMI1640 (sin glucosa) con 10 mL de suplemento de B27 (50x). Homogeneizar.
    6. Medio VI: Añadir un volumen apropiado de material CHIR99021 a la Media IV (concentración final chiR99021 de 2 μM). Homogeneizar.
  5. Preparar medios de paso iPSC-CM
    1. Agregue 10 ml de reemplazo sérico knockout (KSR) a 90 ml de media IV (concentración final de KSR: 10%). Mezclar bien.
  6. Preparar medios de congelación iPSC-CM
    1. Agregue 1 ml de DMSO a 9 ml de KSR (concentraciones finales: 10% DMSO/ 90% KSR) y mezcle bien.
  7. Preparar placas de matriz de membrana basal de recubrimiento medio
    1. Descongelar el medio de matriz de membrana basal a 4 °C durante la noche y alícuota en tubos de 1,5 ml. Agregue 1 ml de este medio a 250 ml de medios DMEM/F12 (dilución 1:250) y mézclelos bien. Aplicar 2 ml de la solución diluida por pocillo en una placa de 6 pocillos e incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante 30 min antes de su uso.

2. Reprogramación iPSC de PBMC

  1. Separe los PBMC de las muestras de sangre.
    1. Recolectar muestras de sangre del paciente (~5 ml) y transferirlas a tubos de separación de células sanguíneas (ver Tabla de materiales). Mezclar invirtiendo 10x.
    2. Centrifugar a 1.500 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
    3. Saque los tubos con cuidado y rocíe con etanol al 70%. Bajo una capucha de bioseguridad, retire las tapas sin perturbar las células mononucleares (capa buffy). Los PBMC estarán en una capa blanquecina justo debajo de la capa de plasma(Figura 1A). Recoge toda la capa buffy usando una pipeta de 1000 μL y transfiérela a un tubo cónico de 15 mL.
    4. Cuente el número de celda utilizando un contador de celda automatizado. Gire el tubo a 300 x g durante 25 min en RT.
    5. Deseche el sobrenadante. Lavar con 10 mL de DPBS (Ca2+/Mg2+ libre).
    6. Gire el tubo a 300 x g durante 15 min en RT.
    7. Retire el sobrenadante. Pellets de células de resuspend en 1 ml del medio de congelación (KSR más 10% DMSO). Ajuste la densidad celular para hacer 1 x 106 células por vial.
    8. Coloque los crioviales de PBMC en un recipiente de congelación celular y manténgalos a -80 °C durante la noche. Transfiera a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo al día siguiente.
  2. Reprogramación de iPSC.
    1. Agregue 3 ml de suplemento de medios sanguíneos en un tubo cónico de 15 ml. Descongele los PBMC en un baño de agua a 37 °C y transfiéralos a un tubo cónico. Girar a 300 x g durante 7 min en RT.
    2. Deseche el sobrenadante. Resuspend PBMCs con medios sanguíneos completos. Sembrarlos en dos pocillos de 24 placas de cultivo de tejido de pocillos (sin matriz de membrana basal).
    3. Incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante la noche. Al día siguiente retire suavemente la mitad de los medios viejos (0,5 ml) y agregue 0,5 ml de medios sanguíneos completos frescos.
    4. Cambie los medios cada dos días refrescando la mitad de los viejos medios.
    5. Después de una semana, lave agresivamente el pozo con 1 ml de suplemento de medios sanguíneos y transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 ml.
    6. Cuente el número de celda. Tomar 2 x 105 células y centrifugar a 300 x g durante 7 min.
    7. Deseche el sobrenadante. Resuspend células con 300 μL de medios sanguíneos completos. Realice la transfección agregando el volumen apropiado de vectores de reprogramación del virus Sendai de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Transfiéralos a un pocillo de una placa de 24 pocillos (sin matriz de membrana basal). Incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante la noche.
    8. Al día siguiente girar a 300 x g durante 7 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 2 ml de medios sanguíneos completos. Transfiera a un pozo de una placa de 6 pocillos pre-recubierta con matriz de membrana basal. Este es el día 1 (D1).
    9. No toques el plato al día siguiente.
    10. En D3, elimine 1 ml de los medios antiguos. Agregue 1 ml de suplemento de medios sanguíneos.
    11. Repita el paso 2.2.10 en D5.
    12. En D7, elimine 1 ml de los medios antiguos. Agregue 1 ml de medios E8 completos.
    13. En D8, repita el paso 2.2.12.
    14. En D9, quite los medios antiguos. Agregue 2 ml de medios E8 completos. Se espera que las células completamente reprogramadas se adhieran y comiencen a formar colonias.
    15. Actualice con 2 ml de medios E8 completos todos los días.
    16. Alrededor de 2 semanas después de la transducción del virus de Sendai, aparecerán grandes colonias de iPSC y estarán listas para la recolección.
    17. Corte las colonias de iPSC bajo un estereomicroscopio en la campana y transfiera colonias individuales a una placa de 24 pocillos recubierta de matriz de membrana basal precargada con 0,5 ml de medios de paso iPSC.
    18. Actualice con 0,5 ml de medios E8 completos todos los días hasta que las colonias de iPSC crezcan lo suficientemente grandes como para pasar a una nueva placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal.

3. Mantenimiento y pase de iPSC humano

  1. Cuando las iPSC humanas alcancen más del 90% de confluencia, elimine los medios antiguos. Enjuague con 3 ml de DPBS una vez.
  2. Agregue 1 ml de EDTA de 0,5 mM en la solución DPBS. Incubar en 5% CO2 a 37 °C durante 5-8 min.
  3. Eliminar el EDTA por aspiración. Agregue 1 ml de medios de paso iPSC. Desaloje manualmente las iPSC.
  4. Tome 600-900 μL de suspensión de una sola célula y vuelva a placas en una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal (dilución: 1: 6 a 1: 10). Incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante la noche.
  5. Actualice con 2 ml de medios E8 completos todos los días. Los cultivos iPSC suelen alcanzar la confluencia después de 3-4 días.

4. Diferenciación de cardiomiocitos definida químicamente

  1. Cultive iPSCs humanas en medios E8 completos hasta un 95% de confluencia (3-4 días).
  2. Elimine los medios antiguos. Agregue 2 ml de diferenciación de CM Media II (6 μM CHIR en RPMI1640 más B27 menos suplemento de insulina) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Esto es D0. No toque D1.
  3. En D2, reemplace con 2 ml de diferenciación de CM Media I (RPMI1640 más B27 menos suplemento de insulina).
  4. En D3, reemplace con 2 ml de diferenciación de CM Media III (5 μM IWR-1 en RPMI1640 más B27 menos suplemento de insulina). No toque D4.
  5. En D5, sustituir por 2 mL de diferenciación CM Media I.
  6. En D7, reemplace con 2 ml de CM diferenciación Media IV (RPMI1640 más suplemento B27). A partir de entonces, actualice los medios de comunicación cada dos días.
  7. En D11 cuando se observen células contraídas, sustituir por 2 mL de diferenciación cm Media V (sin glucosa).
  8. En D13, reemplace con 2 ml de diferenciación CM Media V.
  9. En D15, sustituir por 2 mL de diferenciación CM Media IV.
  10. En D17-D21, reemplace con 2 ml de diferenciación CM Media IV cada dos días.

5. Paso humano iPSC-CMs

  1. Retire los medios viejos y enjuague las células con 3 ml de DPBS una vez.
  2. Aplique 1 ml de solución de disociación CM (ver Tabla de materiales)a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar en 5% CO2 a 37 °C durante 5-8 min.
  3. Disociar mecánicamente iPSC-CM en células individuales mediante pipeteo vigoroso.
  4. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 2 ml de medios de paso cm (10% KSR en RMPI1640 más suplemento B27) para neutralizar la solución de disociación CM.
  5. Girar a 300 x g durante 5 min en RT.
  6. Deseche el sobrenadante. Resuspend células con un volumen deseado de medios de paso CM. Sembrarlos en una placa / plato recubierto de matriz de membrana basal. Los iPSC-CM humanos reanudan la latir 1-3 días después de la transmisión.

6. Expansión de los iPSC-CM humanos

  1. Enjuague D10-12 batiendo iPSC-CM con 3 ml de DPBS por cada pocillo de una placa de 6 pocillos una vez. Añadir 1 ml de solución de disociación de CM (paso 5.2). Incubar en 5% CO2 a 37 °C durante 7-10 min.
  2. Disociar mecánicamente iPSC-CM en células individuales mediante pipeteo vigoroso.
  3. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 2 ml de medios de paso de CM para neutralizar la solución de disociación de CM.
  4. Girar a 300 x g durante 5 min en RT.
  5. Deseche el sobrenadante. Resuspend células con un volumen apropiado de medios de paso CM. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para hacer suspensión de una sola celda. Sembra un millón de iPSC-CM en un plato de 10 cm recubierto de matriz de membrana basal.
  6. Al día siguiente retire los medios antiguos. Añadir 10 ml de medios de proliferación de cardiomiocitos (Media VI: 2 μM CHIR99021). Cambia los medios de comunicación cada dos días.
  7. Cuando los iPSC-CM se vuelvan confluentes después de 7-9 días de cultivo, repita el paso de paso para una mayor expansión de los iPSC-CM.

7. Inmunofluorescencia

  1. Antes de la tinción por inmunofluorescencia, sembra iPSC-CM en cubiertas recubiertas de matriz de membrana basal que se colocan en una placa de 24 pocillos (densidad de siembra: 0.5-1 x 106 células / ml). Mantenga iPSC-CM en cultivo durante al menos 4 días.
  2. Lave las células con 1 ml de DPBS una vez.
  3. Añadir 0,5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) e incubar durante 15 min a RT.
  4. Lavar las células con 1 ml de DPBS. Repita una vez.
  5. Añadir 0,5 mL de Tritón X-100 al 0,1% e incubar durante 20 min en RT.
  6. Lavar con 1 ml de DPBS dos veces.
  7. Añadir 0,5 mL de BSA al 0,2% en DPBS (solución de bloqueo). Incubar en RT durante 1 h.
  8. Añadir 200 μL de anticuerpo primario diluido con solución bloqueadora (dilución: 1:400-1:1000). Incubar a 4 °C durante la noche.
  9. Lave las células con 0,5 ml de solución bloqueadora durante 3 min con agitación. Repetir dos veces.
  10. Añadir 200 μL de anticuerpo secundario diluido en la solución bloqueadora. Incubar en RT durante 1 h.
  11. Enjuague las células tres veces con 0,5 ml de DPBS, cada una durante 3 minutos con agitación.
  12. Contratinúe núcleos con DAPI (dilución 1:2000) e incube durante 5 min a RT.
  13. Enjuague las células tres veces con 0,5 ml de DPBS.
  14. Monte células en las latas en un portaobjetos de microscopio utilizando 5 μl de medios de montaje. Conservar a 4 °C y proteger de la luz.

8. Preparación de muestras de citometría de flujo

  1. Lave los iPSC-CM humanos con 3 ml de DPBS una vez.
  2. Añadir 1 ml de solución de disociación de CM e incubar en CO2 al 5% a 37 °C durante 7-10 min.
  3. Desaloje las células con una pipeta de 1.000 μL. Transfiera la suspensión celular a un tubo REDONDO FACS a través de una tapa de colador. El tubo FACS se rellena previamente con 1 ml de medios de paso iPSC-CM (10% KSR) para neutralizar la actividad enzimática.
  4. Girar a 300 x g durante 5 min.
  5. Retire el sobrenadante sin alterar la bolita celular. Añadir 250 μL de solución de fijación/permeabilización (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 20 min a 4 °C.
  6. Añadir 1 ml de tampón Perm/Wash. Vórtice brevemente y gire a 300 x g durante 4 min.
  7. Deseche el sobrenadante. Añadir 100 μL de anticuerpos primarios diluidos (1:200-1:500) en 1x tampón Perm/Wash. Vórtice brevemente e incube durante la noche a 4 °C.
  8. Lave las células agregando 1 ml de tampón Perm/Wash. Vórtice brevemente y gire a 300 x g durante 4 min.
  9. Deseche el sobrenadante. Añadir 100 μL de anticuerpos secundarios diluidos (1:500-1:1.000). Vórtice brevemente e incube en RT durante 1 h. Proteger de la luz si los anticuerpos secundarios se conjugan con fluorescencia sensible a la luz.
  10. Lave las células agregando 1 ml de tampón Perm/wash. Vórtice brevemente y gire a 300 g durante 4 min.
  11. Deseche el sobrenadante. Células resuspend con 400 μL de tampón de tinción FACS (PBS/4% FBS). Conservar a 4 °C hasta su carga en un instrumento FACS.

9. qPCR en tiempo real

  1. Elimine los medios antiguos en la cultura iPSC-CM humana. Agregue 500-700 μL de tampón de lisis a las células lisadas. Incubar durante 3 min en RT. Lisado de células scape y transferir a un tubo libre de RNasa de 1,5 ml. Proceda a la extracción total de ARN inmediatamente o almacene a -80 °C.
  2. Aísle el ARN total utilizando un kit de extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Medir la concentración de ARN y evaluar la calidad del ARN total mediante un espectrofotómetro.
  4. Realice una reacción de transcripción inversa utilizando un kit de síntesis de ADNc. El volumen total de la reacción RT es de 20 μL, incluyendo 4 μL de mezcla de reacción (5x), 1 μL de transcriptasa inversa, 1 μg de ARN total y agua libre de RNasa.
  5. Incubar la mezcla completa de reacción RT en un termociclador utilizando el siguiente protocolo: 25 °C durante 5 min; 46 °C durante 20 min; 95 °C durante 1 min; mantener a 4 °C.
  6. Diluya el ADNc en 1:10 usando agua libre de nucleasas. Configure la reacción qPCR en tiempo real mezclando 1 μL de plantilla de ADNc, 1 μL de cebadores/sonda, 10 μL de mezcla maestra de qPCR y 8 μL de agua libre de nucleasas.
  7. Ejecutar en un sistema de PCR en tiempo real. El protocolo de ciclo es de 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 seg, 60 °C 1 min, repetir durante 40 ciclos.
  8. Recolectar valores de CT para cada gen en cada muestra. La abundancia relativa de ARNm se calcula restando el valor CT del gen objetivo del valor CT de un gen de limpieza. La expresión génica relativa se analiza mediante el método2 -ΔΔCT.

10. Grabación de abrazadera de parche de celda entera

  1. Disociar iPSC-CM en células individuales utilizando la solución de disociación de CM como se describió anteriormente.
  2. Células de semillas a baja densidad en cubiertas recubiertas de matriz de membrana basal. Cultivarlos durante 3-4 días en Media IV.
  3. Extraiga pipetas (resistencia 0.9-1.5 MΩ) de capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor horizontal de microelectrodos.
  4. Incubar células en solución de Tyrode (pH=7,35).
  5. Llene las pipetas con solución de electrodo (pH=7.3) compuesta por los siguientes productos químicos: 120 mM de ácido aspártico, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.3 mM Na-GTP, 14 mM de fosfocreatina, 4 mM de K-ATP y 2mM de creatina fosfoquinasa.
  6. Coloque las celdas en el modo de abrazadera actual utilizando un pulso de corriente de umbral diastólico de 1,5-2 5 ms a 1 Hz.
  7. Registre potenciales de acción (AP) utilizando un amplificador de microelectrodo y una placa de adquisición impulsada por software.

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Resultados

Reprogramación de iPSC humanos desde PBMC
Después del precultivo con medios sanguíneos completos durante 7 días, los PBMC se vuelven grandes con núcleos y citoplasma visibles(Figura 1B),lo que indica que están listos para la transfección del virus. Después de la transfección con los factores de reprogramación del virus de Sendai, los PBMC se someterán a un proceso de reprogramación epigenética durante otra semana. Por lo general, obtenemos...

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Discusión

Durante la reprogramación de iPSC, es fundamental cultivar PBMC durante 1 semana hasta que se agranden con núcleos y citoplasma claros. Debido a que los PBMC no proliferan, un número de células apropiado para la transducción viral es importante para una reprogramación exitosa de iPSC. El número celular de PBMC, la multiplicidad de la infección (MOI) y el título del virus deben considerarse y ajustarse para alcanzar los resultados óptimos de transducción. Para la diferenciación cardíaca, la densidad de siembra inicial es ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional 18CDA34110293 (M-T.Z.) de la American Heart Association (AHA), los premios AVIF y SVRF de La American Heart Association (M-T.Z.), las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 y R01HL096962 (I.D.). El Dr. Ming-Tao Zhao también recibió el apoyo de fondos iniciales del Instituto de Investigación Abigail Wexner en el Nationwide Children's Hospital.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ABI 7300 Sistema rápido de PCR en tiempo realThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Amplificador de microelectrodosMolecular DevicesAmplificador de microelectrodos
B27 suplementoThermo Fisher Scientific17504044
B27 sin insulinaThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Kit de fijación/permeabilizaciónBD Biosciences554714solución de fijación/permeabilización, tampón de permanente
BD Vacutainer Tubo CPTBD Biosciences362753Tubo de separación de células sanguíneas
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Kit de reprogramación SendaiThermo Fisher ScientificA16517Sendai
Digidata 1200BAxon InstrumentsPlaca de adquisición
Kit de minipreparación de ARN de zol directo Kit deextracción de ARNZymo ResearchR2050
DMEM/F12Medio Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8Medios Thermo Fisher ScientificA1517001E8 para cultivo de iPSC
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Alternativa a la L-glutamina
Reducción del factor de crecimiento MatrigelCorning356231Matriz de membrana basal
Kit de Snythesis de ADNc iScript SíntesisADNc1708891 Bio-Rad
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
Reemplazo de suero knockOut (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Dispositivos moleculares Electrofisiologíasoftware de adquisición y análisis de datos
EPO humano recombinanteThermo Fisher ScientificPHC9631
FLT3 humano recombinanteThermo Fisher ScientificPHC9414
IL3 humano recombinantePeprotech200-03
IL6 humano recombinanteThermo Fisher Scientific
SCF humano recombinantePeprotech300-07
RPMI 1640 medioThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medio, sin glucosaThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Mountant Antifade ThermoFisher ScientificS36936Medios de montaje
StemPro-34 SFMThermo Medioscultivo Fisher Scientific 10639011 PBMC
Mezcla maestra avanzada rápida TaqManThermo Fisher Scientific4444964mezcla maestra de qPCR
TrypLE Select Enzyme 10x, sin rojo fenolSolución de disociaciónThermo Fisher ScientificA1217703
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC solución de disociación
Y-27632 2HClProductos químicos SelleckS1049
/lavado de PHC0065 de CM

Referencias

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