Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.
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Artículo de método
Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes
En este artículo
Resumen
Resumen
La generación de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre ha atraído un gran interés en la medicina de precisión sobre las enfermedades cardiovasculares. La diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) está modulada por vías de señalización definidas que son esenciales para el desarrollo del corazón embrionario. Se han desarrollado numerosos métodos de diferenciación cardíaca en plataformas 2-D y 3-D con diversas eficiencias y rendimiento de cardiomiocitos. Esto ha desconcertado a los investigadores fuera del campo, ya que la variedad de estos métodos puede ser difícil de seguir. Aquí presentamos un protocolo integral que elabora una generación y expansión robustas de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Primero describimos un protocolo de reprogramación iPSC de alta eficiencia a partir de la muestra de sangre de un paciente utilizando vectores del virus de Sendai no integrados. A continuación, detallamos un pequeño método de diferenciación monocapa mediado por moléculas que puede producir cardiomiocitos de latido robusto a partir de la mayoría de las líneas iPSC humanas. Además, se introduce un protocolo de expansión de cardiomiocitos escalable utilizando una molécula pequeña (CHIR99021) que podría expandir rápidamente los cardiomiocitos derivados del paciente para aplicaciones de grado industrial y clínico. Al final, se representan protocolos detallados para la identificación molecular y la caracterización electrofisiológica de estos iPSC-CM. Esperamos que este protocolo sea pragmático para principiantes con conocimientos limitados sobre desarrollo cardiovascular y biología de células madre.
Introducción
El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas por humanos ha revolucionado la medicina cardiovascular moderna1,2. Las iPSC humanas son capaces de autorrenovarse y generar todos los tipos de células en el corazón, incluidos los cardiomiocitos, las células endoteliales, las células del músculo liso y los fibroblastos cardíacos. Los cardiomiocitos derivados de iPSC para pacientes (iPSC-CM) pueden servir como recursos indefinidos para modelar enfermedades cardiovasculares genéticamente hereditarias (ECV) y probar la seguridad cardíaca de nuevos medicamentos3. En particular,....
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Protocolo
Los protocolos experimentales y el consentimiento informado para sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en el Nationwide Children's Hospital.
1. Preparación de medios de cultivo celular, soluciones y reactivos
- Preparar medios PBMC
- Mezclar 20 ml de medios de cultivo PBMC basales (1x) y 0,52 ml de suplemento. Añadir 20 μL de SCF y FLT3 cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 y EPO cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL) y 200 μL de L-glutamina alternativa (100x). Mézclalos bien. Filtrar en una campana estéril utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm. Nombra....
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Resultados
Reprogramación de iPSC humanos desde PBMC
Después del precultivo con medios sanguíneos completos durante 7 días, los PBMC se vuelven grandes con núcleos y citoplasma visibles(Figura 1B),lo que indica que están listos para la transfección del virus. Después de la transfección con los factores de reprogramación del virus de Sendai, los PBMC se someterán a un proceso de reprogramación epigenética durante otra semana. Por lo general, obtenemos.......
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Discusión
Durante la reprogramación de iPSC, es fundamental cultivar PBMC durante 1 semana hasta que se agranden con núcleos y citoplasma claros. Debido a que los PBMC no proliferan, un número de células apropiado para la transducción viral es importante para una reprogramación exitosa de iPSC. El número celular de PBMC, la multiplicidad de la infección (MOI) y el título del virus deben considerarse y ajustarse para alcanzar los resultados óptimos de transducción. Para la diferenciación cardíaca, la densidad de siembra inicial es .......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional 18CDA34110293 (M-T.Z.) de la American Heart Association (AHA), los premios AVIF y SVRF de La American Heart Association (M-T.Z.), las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 y R01HL096962 (I.D.). El Dr. Ming-Tao Zhao también recibió el apoyo de fondos iniciales del Instituto de Investigación Abigail Wexner en el Nationwide Children's Hospital.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 Sistema rápido de PCR en tiempo real | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Amplificador de microelectrodos | Molecular Devices | Amplificador de microelectrodos | |
| B27 suplemento | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 sin insulina | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit de fijación/permeabilización | BD Biosciences | 554714 | solución de fijación/permeabilización, tampón de permanente |
| BD Vacutainer Tubo CPT | BD Biosciences | 362753 | Tubo de separación de células sanguíneas |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Kit de reprogramación Sendai | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Placa de adquisición | |
| Kit de minipreparación de ARN de zol directo Kit de | extracción de ARN | Zymo Research | R2050 |
| DMEM/F12 | Medio Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 | Medios Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 para cultivo de iPSC |
| Suplemento GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Alternativa a la L-glutamina |
| Reducción del factor de crecimiento Matrigel | Corning | 356231 | Matriz de membrana basal |
| Kit de Snythesis de ADNc iScript Síntesis | ADNc | 1708891 Bio-Rad | |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| Reemplazo de suero knockOut (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Dispositivos moleculares Electrofisiología | software de adquisición y análisis de datos | |
| EPO humano recombinante | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| FLT3 humano recombinante | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| IL3 humano recombinante | Peprotech | 200-03 | |
| IL6 humano recombinante | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCF humano recombinante | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medio | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medio, sin glucosa | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Mountant Antifade Thermo | Fisher Scientific | S36936 | Medios de montaje |
| StemPro-34 SFM | Thermo Medios | cultivo Fisher Scientific 10639011 PBMC | |
| Mezcla maestra avanzada rápida TaqMan | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | mezcla maestra de qPCR |
| TrypLE Select Enzyme 10x, sin rojo fenol | Solución de disociación | Thermo Fisher Scientific | A1217703 |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC solución de disociación |
| Y-27632 2HCl | Productos químicos Selleck | S1049 |
Referencias
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
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Reimpresiones y permisos
