Artículo de método

Flujo de trabajo y herramientas para la detección de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin

DOI:

10.3791/62208

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3 de marzo de 2021

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1Macromolecular Crystallography, Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Structural Biochemistry Group, Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 3BioMAX, MAX IV Laboratory, 4Drug Design Group, Institute of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-Universität Marburg, 5Department Sample Environment, Helmholtz-Zentrum Berlin

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cribado de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin se realiza utilizando un flujo de trabajo con bibliotecas de compuestos dedicadas, herramientas de manejo de cristales, instalaciones de recopilación de datos rápidas y análisis de datos en gran parte automatizado. El protocolo presentado tiene la intención de maximizar la salida de tales experimentos para proporcionar puntos de partida prometedores para el diseño de ligandos basados en la estructura aguas abajo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La detección de fragmentos es una técnica que ayuda a identificar puntos de partida prometedores para el diseño de ligandos. Dado que los cristales de la proteína diana están disponibles y muestran propiedades de difracción de rayos X de alta resolución, la cristalografía se encuentra entre los métodos más preferidos para la detección de fragmentos debido a su sensibilidad. Además, es el único método que proporciona información 3D detallada del modo de unión del fragmento, que es vital para la evolución racional posterior del compuesto. El uso rutinario del método depende de la disponibilidad de bibliotecas de fragmentos adecuadas, medios dedicados para manejar un gran número de muestras, líneas de haz de sincrotrón de última generación para mediciones de difracción rápidas y soluciones en gran parte automatizadas para el análisis de los resultados.

Aquí, se presenta el flujo de trabajo práctico completo y las herramientas incluidas sobre cómo realizar la detección de fragmentos cristalográficos (CFS) en el Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Antes de este flujo de trabajo, las condiciones de remojo de cristales, así como las estrategias de recopilación de datos, están optimizadas para experimentos cristalográficos reproducibles. Luego, típicamente en un procedimiento de uno a dos días, se emplea una biblioteca centrada en cfs de 96 miembros proporcionada como placas secas listas para usar para remojar 192 cristales, que luego se enfrían individualmente. Los experimentos finales de difracción se pueden realizar en el plazo de un día en las líneas de haz compatibles con montaje de robot BL14.1 y BL14.2 en el anillo de almacenamiento de electrones BESSY II operado por la HZB en Berlín-Adlershof (Alemania). El procesamiento de los datos cristalográficos, el refinamiento de las estructuras de proteínas y la identificación de aciertos es rápido y en gran medida automatizado utilizando tuberías de software especializadas en servidores dedicados, que requieren poca entrada del usuario.

El uso del flujo de trabajo de CFS en el HZB permite experimentos de detección de rutina. Aumenta las posibilidades de identificación exitosa de los golpes de fragmentos como puntos de partida para desarrollar aglutinantes más potentes, útiles para aplicaciones farmacológicas o bioquímicas.

Introducción

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El primer paso en el desarrollo de fármacos es la detección de compuestos contra un objetivo de interés. Tradicionalmente, las grandes bibliotecas de compuestos del orden de 100.000-1.000.000 de entradas se utilizan en ensayos bioquímicos de alto rendimiento en la industria farmacéutica. Esta estrategia se complementó con el diseño de fármacos basado en fragmentos (FBDD), un método más nuevo que tuvo un fuerte aumento durante los últimos 20 años y se convirtió en una estrategia general para generar candidatos de plomo de alta calidad debido a varias ventajas inherentes del método1. El término "fragmento" se refiere a una pequeña molécula orgánica que contiene típicamente menos de 20 átomos no hidrógeno o pesados (HAs). Por lo tanto, un fragmento es significativamente más pequeño que las moléculas similares a fármacos o plomo (generalmente menos de 30 HAs) exploradas en la detección convencional de alto rendimiento. Los fragmentos son aglutinantes de afinidad débil. Sin embargo, en comparación con las moléculas más grandes, los fragmentos son más versátiles, ya que incluso una pequeña colección de ellos puede representar mejor el espacio químico respectivo de moléculas del mismo tamaño2. Además, la evolución de los golpes de detección de fragmentos en moléculas de plomo es considerablemente más efectiva que la optimización de moléculas ya más grandes2,3,4,5. Eso significa que, a la espera de una sensibilidad suficiente de la detección, el cribado de fragmentos se puede emplear de manera eficiente y produce puntos de partida de alta calidad para una mayor evolución de los compuestos. Se pueden aplicar varios métodos biofísicos para la detección de fragmentos, siendo los más populares la resonancia magnética nuclear, la cristalografía de rayos X, la resonancia de plasmones superficiales y los ensayos de desplazamiento térmico. Estos métodos se utilizan de forma paralela o secuencial, con el objetivo de aumentar la confianza en los aciertos y reducir el número de falsos positivos o falsos negativos, respectivamente. Sin embargo, un estudio comparativo realizado recientemente6 sugirió que las cascadas de cribado secuenciales deben evitarse debido a la baja superposición entre los diferentes métodos.

La cristalografía de rayos X es un método bien establecido para la determinación de la estructura en detalle atómico, pero recientemente también se ha desarrollado como una herramienta para finesde detección 7,8. Como los cristales de proteínas toleran altas concentraciones de fragmentos (por ejemplo, 100 mM), el cribado cristalográfico de fragmentos (SFC) puede competir con otros métodos biofísicos para el cribado de fragmentos o incluso superarlos como método de cribado de primer paso6,9. Sin embargo, un requisito previo vital para el SFC es un sistema de cristalización validado de la proteína diana que entrega de forma reproducible cristales con propiedades de difracción a una resolución considerablemente alta, típicamente mejor que 2 Å.

Un beneficio exclusivo del SFC en comparación con todas las demás metodologías de cribado de fragmentos es el suministro de información 3D detallada sobre el modo de unión de los fragmentos identificados. Esta información estructural es absolutamente crucial para la optimización racional de los golpes del fragmento a los aglutinantes de la alto-afinidad. Las estrategias de elaboración establecidas están creciendo, fusionándose y vinculando fragmentos de hits5. De tal modo la eficacia relativamente alta del ligand se proporciona desde el principio, y la introducción de grupos innecesarios o espacial no convenientes puede ser evitada, así reduciendo costes químicos de la síntesis. Con todo, el SFC tiene ventajas inigualables como estrategia de partida para el diseño de fármacos.

Dado que un objetivo biológico en particular cumple con los altos requisitos del SFC con respecto a la calidad del cristal, hay algunos factores principales que maximizan las posibilidades de un resultado exitoso de tales campañas de detección. Depende de la calidad de la biblioteca de fragmentos utilizada, de un flujo de trabajo eficiente para llevar a cabo los experimentos antes del experimento de difracción, de las líneas de haz de sincrotrón con suficiente velocidad de automatización y recopilación de datos, así como de las formas y los medios para el procesamiento y análisis de datos en gran medida automatizados. Aquí, se presenta el flujo de trabajo completo desde los experimentos de remojo de cristales hasta la identificación del golpe, en la forma en que se establece con éxito en las líneas de haz de cristalografía macromolecular en BESSY II (Figura 1). La instalación está abierta a usuarios académicos e industriales para la colaboración. Además, los usuarios académicos de países de la UE fuera de Alemania pueden solicitar financiación directamente a través del proyecto iNEXT Discovery.

Existen requisitos indispensables para poder iniciar una campaña de SFC y llevar a cabo el protocolo descrito en este trabajo: se dispone de cristales bien difraccionantes de la proteína diana que se pueden cultivar de forma reproducible en grandes cantidades, que son estables a temperatura ambiente y que se cultivaron utilizando un cóctel de cristalización sin ingredientes altamente volátiles. Otro requisito previo es la idoneidad de la red cristalina para el experimento. En una red apropiada, los sitios interesantes de la proteína diana deben estar expuestos hacia los canales solventes y, por lo tanto, accesibles. Otro paso anterior que es opcional pero sin embargo muy recomendable para asegurar el éxito en el flujo de trabajo de la campaña cfs es la optimización de la condición de remojo para el experimento. Las estadísticas de referencia vitales aquí son el poder de difracción del cristal y los indicadores de calidad de datos relevantes, que se determinan durante el procedimiento de escalado de datos. Los factores típicos a optimizar son dmso-tolerancia, concentración de tampón y crio-protector. Aunque no es un requisito previo estricto como se detalla más adelante, DMSO como co-solvente puede ayudar a aumentar la solubilización de fragmentos. Las pruebas típicas deben incluir remojar de 0, 3, 6, o 10% (v/v) DMSO durante la noche. Un aumento de la concentración del almacenador intermediario a 200 o 300 milímetros ayuda a prevenir la pérdida en calidad de la difracción debido a los efectos ocasionales del pH-cambio derivados de las altas concentraciones del fragmento que se utilizarán. Por último, es decisivo averiguar si se requiere y qué crioprotector adicional y si ya se puede incluir en la condición de remojo. En muchos casos, sin embargo, no se necesita un crioprotección adicional, porque dmso sí mismo puede actuar como un crio-protector. Si es así, esto ahorrará un paso de manejo en el experimento final. La mayoría de los cristales necesitan menos crio-protector si se enfrían con flash en bucles de tamaño apropiado, minimizando o evitando el licor madre circundante tanto como sea posible. Sin embargo, en casos raros, una capa del licor madre es de hecho necesaria para evitar daños al cristal al enfriarse.

El número de aciertos obtenidos en una campaña de SFC no sólo depende de la farmacobilidad de la proteína diana y de la idoneidad de la red cristalina (véase más arriba), sino que también depende de la calidad de la biblioteca. La calidad de la biblioteca comprende dos aspectos: la selección de los compuestos para la biblioteca y la confección de los compuestos (es decir, en qué forma física se presentan para el experimento). Para la selección compuesta se pueden emplear diferentes estrategias. La mayoría de los diseños de bibliotecas incluyen la maximización de la diversidad química de los fragmentos. Un enfoque estratégico podría ser incluir la manejabilidad química de los fragmentos para el diseño de seguimiento, que se ha aplicado, por ejemplo, en la biblioteca preparada Diamond-SGC-iNEXT10. Sin embargo, otro enfoque estratégico para el diseño de bibliotecas podría ser maximizar la representación del espacio químico disponible comercialmente de los fragmentos mediante agrupamiento basado en formas y farmacoforos, como se ha ejemplificado por las bibliotecas F2X desarrolladas en HZB11. Más específicamente, se han desarrollado la biblioteca universal F2X de 1103 miembros y el subconjunto representativo de 96 compuestos para las campañas iniciales de CFS, que se llama F2X-Entry Screen, y la pantalla de entrada F2X se ha validado con éxito11. La pantalla de entrada F2X es la opción principal para las campañas de CFS en HZB. Posteriormente, se pueden llevar a cabo campañas más grandes utilizando la Biblioteca Universal F2X o la biblioteca fragmentaria12 DE 1056 miembros de EU-OPENSCREEN que también se ofrece en HZB. En la actualidad, estas bibliotecas están disponibles para los usuarios de las líneas de haz de cristalografía macromolecular del sincrotrón BESSY II en Berlín de forma gratuita sobre la base de un contrato de colaboración. Eso también se aplica a los usuarios a través de las propuestas de iNEXT Discovery. Además, la pantalla de entrada F2X está disponible para todos los científicos interesados sobre la base de un acuerdo de transferencia de material.

Con respecto a la presentación física de una biblioteca, se adoptan comúnmente dos enfoques: los fragmentos se utilizan como soluciones de stock DMSO o los fragmentos se secan e inmovilizan en placas listas para usar. En HZB, tanto la pantalla de entrada F2X como los compuestos no volátiles de la biblioteca universal F2X se presentan como compuestos secos en una placa de cristalización de bajo perfil MRC de 3 lentes y 96 pozos. La presentación de los fragmentos inmovilizados en placas de cristalización tiene dos ventajas vitales: En primer lugar, permite el transporte de las placas de cribado al laboratorio casero del usuario. Por lo tanto, los pasos de remojo y manejo de cristales del flujo de trabajo presentado aquí (pasos 1-3) se pueden llevar a cabo en cualquier lugar. En segundo lugar, se puede emplear una solución libre de DMSO. Por lo tanto, los objetivos sensibles a la DMSO pueden examinarse fácilmente, conservando en gran medida las tasas de aciertos esperadas11. Sin embargo, DMSO aumenta la solubilidad del fragmento, por lo tanto, vale la pena comprobar la tolerancia DMSO de un sistema cristalino de elección de antemano como se describió anteriormente.

El protocolo descrito a continuación describirá un experimento típico con una pantalla compuesta de 96 como la pantalla de entrada F2X. Para eso, aproximadamente 250 cristales necesitan ser preparados a tiempo para ser utilizados recientemente. Es muy recomendable preparar los remojo para los 96 compuestos por duplicado. Se recomienda, pero opcional, preparar simulacros adicionales que luego ayudarán con el análisis de datos utilizando el enfoque de análisis de densidad de datos panorámicos (PanDDA) para la identificación de aciertos13. Los remojo simulado se definen como experimentos de remojo en cristales de proteínas que utilizan la misma solución de remojo que el fragmento se empapa durante el mismo tiempo de incubación, pero no hay fragmentos presentes. Si la solución de remojo es igual a la condición de cristalización, los cristales pueden ser cosechados directamente de la placa de cristalización.

Dependiendo de las capacidades del cambiador de muestras robótico, es posible que se tengan que usar diferentes formatos de disco. Por el momento, las muestras para la línea de haz operada por HZB BL14.1 deben prepararse en formato Unipuck, las muestras para la línea de haz operada por HZB BL14.2 deben prepararse en formato de disco SPINE. En este protocolo, se supone la preparación en formato Unipuck.

Protocolo

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1.Cristales de remojo

  1. Tome la placa de cribado (aquí, una placa de pantalla de entrada F2X, Figura 2)del congelador de -20 ° C y colótela en el banco / mesa durante aproximadamente 30 minutos para precalentarlo a temperatura ambiente, evitando así la humedad por condensación.
  2. Organice el lugar de trabajo con dos microscopios estrechamente dispuestos y todas las herramientas necesarias (Figura 3A). Los materiales se enumeran en la Tabla de materiales.
  3. Elija 3-4 bucles del tamaño adecuado para la transferencia de los cristales a remojar y colóquelos cerca de los microscopios.
  4. Llene las cavidades de la placa puntual de vidrio con agua desionada o destilada.
  5. Preparar 5 mL de solución de remojo.
  6. Abra la bolsa de la placa de cribado precalentada a temperatura ambiente.
  7. Retire la tapa y la lámina de la placa de cribado, mientras mantiene la placa colocada en el banco / mesa.
  8. Decantar los 5 mL de solución de remojo en el depósito del reactivo.
  9. Llene cada uno de los 96 depósitos con 40 μL de solución de remojo utilizando la pipeta de 12 canales.
  10. Coloque el marco EasyAccess en la parte superior de la placa de cribado y colóquelo con las abrazaderas incluidas deslizándolas sobre los lados izquierdo y derecho del dispositivo.
    NOTA: El EasyAccess Frame es un dispositivo especial para el manejo de múltiples cristales, que fue desarrollado en el HZB14. Permite un fácil acceso a cada pozo desplazando las baldosas móviles mientras protege los otros pozos de la evaporación.
  11. Coloque la placa de cribado (incluido el marco EasyAccess) debajo del primer microscopio y la placa de cristalización, incluidos los cristales que se empaparán bajo el segundo microscopio.
  12. Deslice bien el pozo A1 de la placa de cribado moviendo la baldosa de vidrio acrílico respectiva del marco EasyAccess, ya sea con un dedo o con la herramienta de pluma suministrada.
  13. Añadir 0,4 μL de solución de remojo del depósito al fragmento que contiene el pozo (lente superior izquierda) utilizando una punta de pipeta fresca. Compruebe a través del microscopio que la gota cubre el fragmento seco, para que pueda disolverse.
    NOTA: Alternativamente, este paso se puede llevar a cabo utilizando un robot de pipeteo antes del montaje del marco EasyAccess. De esta manera, las gotas de remojo de todos los pozos podrían colocarse en un procedimiento automático. Sin embargo, los autores recomiendan agregar la solución de remojo directamente antes del paso de remojo como se describe para asegurarse de que el fragmento se solubiliza lentamente y en presencia del cristal. Esto evita que el cristal experimente un choque repentino al transferirse a una gota con una alta concentración de fragmentos.
  14. Bajo el segundo microscopio, corte la lámina de sellado de la placa de cristalización en uno de los pozos que contiene los cristales objetivo.
  15. Transfiera dos cristales usando un lazo de tamaño apropiado montado en la varita de cristal al pozo A1 de la placa de cribado bajo el primer microscopio.
  16. Lave el lazo en la placa de vidrio preparada y séquela tocando suavemente el pañuelo. Haga esto después de cada transferencia para evitar la contaminación cruzada con fragmentos que contienen soluciones de remojo.
  17. Utilice el microscopio para comprobar que los cristales se han colocado correctamente.
  18. Pase al siguiente pozo (por ejemplo, B1).
  19. Repita los pasos 1.13-1.18 con los 96 pozos de la placa de cribado hasta que cada gota de remojo contenga dos cristales.
  20. Retire la placa de cribado (incluido el marco EasyAccess) de debajo del microscopio y colóquela en el banco / mesa.
  21. Retire el marco EasyAccess de la placa de cribado.
  22. Selle la placa de cribado con papel de sellado y colóquela en la incubadora de cristalización o en el armario, respectivamente, donde se cultivaron los cristales.
  23. Incubar para el tiempo de remojo optimizado. Pasar la noche suele ser conveniente.
  24. (opcional) Preparación de aproximadamente 40 cristales apo (es decir, remojo simulado)
    1. Tome una placa de cristalización de perfil bajo MRC de 3 lentes y 96 pocillos y llene dos columnas con 40 μL de solución de remojo por pocillo usando la pipeta de 12 canales.
    2. Coloque el marco EasyAccess en la parte superior de la placa de cristalización y colóquelo con las abrazaderas incluidas deslizándolas sobre los lados izquierdo y derecho del dispositivo.
    3. Deslice abierta la baldosa de vidrio acrílico del pozo A1.
    4. Coloque 0,4 μL de solución de remojo en cada una de las dos lentes izquierdas del pozo.
    5. Transfiere 2-3 cristales a cada gota. Después de cada transferencia, lave el lazo en la placa de vidrio preparada y séquete tocando suavemente el tejido.
    6. Muévase al siguiente pozo (por ejemplo, B1).
    7. Repita los pasos 1.24.4-1.24.6 hasta que unos 40 cristales estén listos para la incubación.
    8. Retire la placa de cristalización (incluido el marco EasyAccess) de debajo del microscopio en el banco / mesa y retire el marco EasyAccess.
    9. Selle la placa de cristalización con papel de sellado y colóquela en la incubadora o armario de cristalización antes mencionado.
    10. Incubar durante el mismo tiempo que la placa de cribado.

2.Cosecha de cristales

  1. Saque la(s) placa(s) de incubación de la incubadora o del armario, respectivamente.
  2. Organice el lugar de trabajo con un microscopio y todas las herramientas necesarias (Figura 3B). Los materiales se enumeran en la Tabla de materiales.
  3. Prepare un dewar de espuma Unipuck con 3 tapas Unipuck (es decir, gabinetes de muestra) y llénalo con nitrógeno líquido (LN2).
    NOTA: Observe las precauciones de seguridad apropiadas para trabajar con LN2 (es decir, use gafas de seguridad y use el equipo de protección adecuado). Lo mejor es obtener LN2 fresco varias veces durante la sesión para evitar la condensación de agua en la lata de almacenamiento de LN2. A través de todo el siguiente procedimiento, asegúrese de que el nivel de LN2 en el dewar de espuma siempre está llegando al borde superior del dewar. Asegúrese también de que el LN2 esté libre de hielo; con frecuencia reemplace el LN2 (por ejemplo, una vez cada 45 minutos), o más tarde si el hielo comienza a acumularse. Luego, llene el segundo dewar de espuma y transfiera Unipucks a él. Vacíe la espuma helada dewar y retire el hielo residual y la humedad con el secador.
  4. Retire la lámina de la placa de cribado y coloque el easyaccess frame en la parte superior.
  5. Deslice bien abierto A1.
  6. Cosechar dos cristales de la gota y flash-enfriarlos en LN2 (uno por uno) sumergiéndose con un movimiento vertical rápido en el LN2 y luego insertando la muestra en la posición de disco adecuada. Tome notas relevantes en la hoja de seguimiento de la muestra.
  7. Paso de crioprotección (si es necesario para los cristales diana). En tal caso, realice este paso en lugar de 2.6.
    1. Coloque 0,4 μL de solución de remojo incluyendo crioprotección en la lente inferior izquierda del pozo.
    2. Tire del bucle con un cristal montado desde la gota en la lente superior izquierda lentamente a través de la solución en la lente inferior izquierda mientras mantiene el cristal en el bucle, y luego flash-cool en LN2. Cosecha dos cristales de esta manera.
      Nota: En los pasos 2.6 y 2.7, asegúrese de que el tiempo que el cristal está en el bucle y expuesto al aire se mantiene muy corto. El hundimiento (es decir, la caída vertical de la muestra en el dewar relleno de LN2)debe realizarse lo más rápido posible. Esto garantiza una alta calidad de la muestra y la prevención de anillos de hielo en los datos. Realice un seguimiento de las muestras (es decir, tenga en cuenta si los cristales tienen daños, etc.) para priorizar cualquiera de los duplicados para las siguientes mediciones de rayos X, use la plantilla para eso. Incluso si los cristales tienen grietas, "pelos" u otros defectos debido al remojo, todavía se pueden usar y siempre deben cosecharse. En caso de que los cristales se rompieran en varios pedazos, dos de las piezas más grandes / de mejor aspecto deben ser cosechadas. La figura 5 muestra algunos ejemplos de cómo pueden verse estos cristales. Todos los cristales mostrados dieron conjuntos de datos todavía útiles en la campañarespectiva 11,subrayando que vale la pena cosechar cristales después del tratamiento de remojo, incluso si se produjeron cambios morfológicos sustanciales.
  8. Vaya al siguiente pozo y repita los pasos 2.5 - 2.6./2.7 hasta que se llenen los tres discos.
  9. Añadir las bases Unipuck en la parte superior de las tapas después de pre-enfriarlos en LN2.
  10. Guarde los Unipucks en bastidores de almacenamiento en un dewar de transporte o dewar de almacenamiento.
  11. Repita los pasos anteriores hasta que se hayan procesado todos los pozos de la placa de cribado.
  12. (opcional) Si se prepararon cristales empapados en simulacro, cosecharlos de una manera similar a como se describió anteriormente.
    NOTA: Si dos cristales para cada una de las 96 condiciones de la placa de cribado pudieran enfriarse por flash, habrá espacio para 32 cristales apo empapados simulados, para llenar los 14 Unipucks.
  13. Guarde los Unipucks en LN2 hasta la medición.

3.Recopilación de datos

  1. Transfiera el Unipucks a la línea de haz BL14.1. Si se han utilizado discos SPINE en el paso 2, transfiríbalos a la línea de haz BL14.2.
  2. Lleve a cabo mediciones estándar en la línea de haz utilizando las recomendaciones específicas que se indican a continuación. Los detalles sobre la instalación y el programa de control del experimento MXCuBE2 se han presentado previamente15,16. La Figura 4 muestra el interior de las cabañas experimentales de las líneas de haz BL14.1 y BL14.2, así como una captura de pantalla de ejemplo del software de control MXCuBE2 en la línea de haz BL14.1.
    1. Para maximizar la eficacia del tiempo y el rendimiento, omita la colección de imágenes de prueba. La distancia de muestra a detector se fijará a un valor que sea adecuado para el límite de resolución superior del sistema cristalino determinado en experimentos anteriores. Si la estrategia de recopilación de datos no se optimizó de antemano, recopile 1800 imágenes de 0,2 grados cada una con un tiempo de exposición de 0,1 s por imagen.
    2. Idealmente, pruebe la estrategia de recopilación de datos en experimentos anteriores utilizando cristales apo empapados en simulacro. Para grupos de espacios de simetría más altos, 1200 imágenes o incluso 900 imágenes (es decir, 240° o 180°, respectivamente) ya darán conjuntos de datos completos con buenas estadísticas, independientemente del ángulo inicial de la recopilación de datos.
      NOTA: Una mayor redundancia y un corte más fino pueden producir una calidad de datos superior17. Sin embargo, el uso de esta estrategia de "suficiente pero no más" propuesta aquí es un excelente equilibrio entre la calidad, el tiempo de recopilación de datos, así como los requisitos computacionales para el análisis más adelante. De la manera descrita, 200 recopilaciones de datos en 24 horas son bien posibles en las líneas de haz BL14.1 y BL14.2. No obstante, se debe dar prioridad a las muestras.
    3. Primero recopile conjuntos de datos de difracción para una muestra por condición de fragmento, basándose en la priorización en el paso 2.6./2.7 (es decir, recopile los datos para el duplicado priorizado más alto).
    4. Para aquellos experimentos en 3.2.3 donde la recolección de datos falló, se perdió difracción o se produjeron anillos de hielo severos, recopile datos para la segunda muestra duplicada de la condición de fragmento respectiva.
    5. Recopile conjuntos de datos de difracción de cristales apo (si se preparan de acuerdo con los pasos 1.24 y 2.12).
    6. Recopile conjuntos de datos de difracción de los duplicados restantes de cada condición de fragmento.
    7. En el programa MXCuBE2, haga coincidir los identificadores de conjunto de datos de una campaña de CFS con el siguiente patrón: --[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (por ejemplo, MyProtein-F2XEntry-B05a, donde "B05" representa el pozo (es decir, la condición de fragmento en la pantalla) y la siguiente "a" para el primer duplicado).

4.Tratamiento de datos

  1. Para el análisis de datos de la campaña cfs, utilice FragMAXapp, una solución basada en la web para controlar un análisis múltiplex para el procesamiento de auto-refinamiento y panDDA evaluación de aciertos de datos CFS18 (Lima et al. FragMAXapp, datos no publicados). En la versión de FragMAXapp desplegada en HZB están disponibles los siguientes programas/pipelines: XDSAPP19,Xia2-DIALS y Xia2-XDS20,fspipeline7,DIMPLE21,Phenix LigFit22,PanDDA13,23. Utilice un modelo de entrada bien refinado de la proteína objetivo como entrada para el refinamiento automático; de lo contrario, realice un refinamiento meticuloso de un cristal empapado en simulacro de alta resolución que se recolectó durante la campaña.
    Nota : un elemento clave para la identificación de aciertos es PanDDA. Los detalles se explican en las respectivas publicaciones13,23. En resumen, PanDDA calcula automáticamente los mapas de densidad electrónica de un conjunto de conjuntos de datos en una campaña de SFC. A continuación, se asumen como condiciones de fragmento no vinculantes y se promedian para generar el denominado modelo de estado fundamental. El modelo de estado fundamental se utiliza para derivar discrepancias locales entre cada mapa de densidad de electrones y el mapa de estado fundamental, utilizando puntuaciones Z asociadas a voxel. Luego, para áreas de puntuaciones Z altas, se crea un llamado mapa PanDDA mediante la resta ajustada de la densidad de estado fundamental del mapa respectivo. Esto mejora en gran medida la visibilidad de los eventos de enlace de fragmentos.
  2. Para maximizar el resultado de PanDDA, utilice un enfoque de dos pasos. En primer lugar, realizar una ejecución de PanDDA (pandda.analyse) con la configuración estándar. Incluso si se han recopilado cristales empapados simulados, su identidad no se incluirá como parámetro (lo que es posible sin embargo) para permitir una generación imparcial del modelo de estado fundamental por PanDDA a partir de todos los datos disponibles. Posteriormente, los datos de salida son evaluados por el usuario a través de una inspección llamada PanDDA en Focha24. Aquí, se deben tener en cuenta los golpes con una confianza relativamente alta, concluyendo el primer paso.
  3. En segundo lugar, vuelva a ejecutar el paso pandda.analyse excluyendo los aciertos preliminares (determinados en el primer paso) del modelo de estado fundamental a través de la opción de línea de comandos --exclude_from_characterisation="". Se describen más detalles en las páginas de ayuda de PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). De esta manera, se ignoran los conjuntos de datos que son aciertos claros y, por lo tanto, ocultarían el modelo de estado fundamental si se incluyen. Esto conduce a un modelo de estado fundamental mejorado y, por lo tanto, a mejores resultados en general. Finalmente, se realiza una inspección exhaustiva de PanDDA para completar la identificación del golpe.
    NOTA: FragMAXapp incluye también una opción de salida para guardar los estados enlazados modelados o preparar los datos para el envío de PDB, para obtener más detalles, consulte páginas web de FragMAX (https://fragmax.github.io/).

Resultados

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Como parte de las campañas de validación previamente reportadas de la pantalla de entrada F2X11,se llevaron a cabo tres campañas en la línea de haz BioMAX en MAX IV y una campaña se llevó a cabo en la línea de haz BL14.1 en HZB. En la última campaña, un conjunto particular de condiciones de pantalla de entrada F2X utilizando una condición de remojo que no contenía DMSO se cribó contra el complejo proteína-proteína de la levadura Aar2 y el dominio RNaseH-like de levadura Prp8 (AR). El conjunto seleccionado de condiciones comprende los golpes que se encontraron en una campaña anterior de la pantalla de entrada F2X contra AR en una condición de remojo que contiene DMSO11,(es decir, en la campaña realizada en HZB esos golpes se volvieron a examinar en ausencia de DMSO). La Figura 7 muestra una visión general de los aciertos obtenidos después de analizar los datos con la combinación FragMAXapp de XDSAPP para el procesamiento, fspipeline para el refinamiento automático y la posterior búsqueda de aciertos mediante PanDDA.

figure-results-1
Figura 1:Representación esquemática del flujo de trabajo de un experimento de cribado de fragmentos cristalográficos (CFS) centrado en el entorno especial en el Helmholtz-Zentrum Berlin. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Figura 2:Formulación y envasado de la pantalla F2X-Entry. La pantalla de 96 compuestos está disponible en una placa de perfil bajo MRC de 3 lentes y 96 pocillos, sellada con papel de aluminio y envasada al vacío. Los 96 compuestos de la pantalla se secan de las soluciones DMSO en dos de las tres lentes de cada pozo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Figura 3:Fotografía del banco de trabajo del CFS en el laboratorio de preparación de HZB. Se muestran los conjuntos de herramientas necesarias para A) remojo y para B) cosecha de cristales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Figura 4:Estaciones finales de recopilación de datos y software de control. A)Fotografía del hutch experimental de las líneas de haz HZB-MX BL14.1 (izquierda) y BL14.2 (derecha)15. B) Captura de pantalla de la interfaz de control del experimento MXCuBE216 utilizada en BL14.1 para la recopilación de datos de difracción. En BL14.2 se utiliza una interfaz muy similar. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.  

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Figura 5: Instantáneas fotográficas de algunas muestras cristalinas en ambiente criogénico antes de la recolección de datos. Esto ilustra la variabilidad de las morfologías de los cristales después de realizar el remojo del fragmento y la recolección de cristales. Las fotografías fueron tomadas en la línea de haz BioMAX (sincrotrón MAX IV, Lund, Suecia) para muestras de AR recogidas allí como parte de la validación de la pantalla de entrada F2X11. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Figura 6:Captura de pantalla de la FragMaxApp18 instalada en el HZB para un análisis de datos conveniente. Más detalles en Lima et al., FragMAXapp, datos inéditos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Figura 7: Descripción general de los resultados de la campaña F2X-Entry del CFS frente a AR (sin DMSO). El complejo de la proteína AR se muestra en la vista de dibujos animados, con Aar2 coloreado en gris y el dominio similar a RNaseH de Prp8 coloreado en azul. Los golpes del fragmento de la campaña se colorean en colores del elemento (C - amarillo, O - rojo, N - azul, S - naranja, Cl - cian ligero). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discusión

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Para que una campaña de CSA tenga éxito, es vital adherirse a los requisitos previos descritos (consulte introducción). Se necesita un sistema de cristalización confiable para el crecimiento reproducible de muchos cristales bien difraccionados, y se necesita una estructura bien refinada como modelo apo de entrada para el refinamiento automatizado. También es importante comprobar que el sitio objetivo en la proteína (sitio activo, o área de interfaz) es accesible para los fragmentos en la red cristalina. Es crucial optimizar las condiciones de remojo de antemano para garantizar que el remojo no deteriore significativamente la calidad del cristal. Descuidar estos aspectos muy probablemente conducirá a un experimento subóptimo, que será de uso limitado y, en el peor de los casos, requerirá una repetición de todo el experimento.

El protocolo descrito anteriormente describe los procedimientos que se siguen durante una campaña estándar de CSA. Si se cumplen todos los requisitos previos, al menos el 90% de todos los cristales empapados deben mostrar difracción a alta resolución en un experimento de difracción. Si este no es el caso, los tiempos de remojo pueden acortarse a unas pocas horas o incluso minutos. Debido a la buena solubilidad de la mayoría de los fragmentos, esto debería ser suficiente para obtener valores de ocupación decentes. Además, una campaña típica de CFS resultará en una tasa de aciertos de aproximadamente 10% o más. Para las campañas de validación de pantalla de entrada F2X11 y las campañas de usuario en curso con la misma biblioteca se han observado tasas de aciertos aún más altas (20% o más, datos no mostrados).

Una advertencia general de la investigación cristalográfica del fragmento es la presencia de sitios cristalográficos del contacto. Estos podrían ocluir sitios activos conocidos a priori (para ser revisados antes de la detección, ver arriba), o estos sitios de contacto también a menudo proporcionan bolsillos y puntos calientes donde los fragmentos pueden unirse. Tales golpes de fragmentos serán artefactos de la red de cristalización y probablemente no se unirán a la proteína en solución. Estos eventos tienden a ocurrir más a menudo en experimentos de remojo que en experimentos de co-cristalización (probablemente debido a las concentraciones de fragmentos más altas empleadas en experimentos de remojo). Sin embargo, según la experiencia anterior, generalmente constituyen sólo una porción menor de los golpes obtenidos. Por ejemplo, en la campaña de validación de la pantalla de entrada F2X utilizando endotiapepsina (EP) y el complejo proteína-proteína spliceosomal de Prp8RNaseH y Aar2 (AR), la mayoría de los éxitos ocurrieron en sitios prometedores11. Para el EP, 27 fuera de los 37 eventos obligatorios observados fueron situados en el sitio activo (es decir, la hendidura del péptido de esta proteasa). Los 10 eventos de unión remota comprenden dos eventos de unión expuestos a disolventes y ocho eventos de unión de contacto con cristales (correspondientes a cinco aciertos únicos). La exclusión de esos golpes de contacto de cristal todavía reflejaría una tasa general de 24% de visitas únicas para la campaña del PE. También es importante notar que los eventos de unión a distancia de un sitio activo conocido (excepto los aglutinantes de contacto cristalino) también podrían ser potencialmente interesantes (por ejemplo, revelar nuevos puntos calientes o sitios alosteréricos de la proteína). Para la campaña de AR (en la misma publicación), de los 23 eventos de unión observados, siete se ubicaron en contactos cristalinos, uno se ubicó en la interfaz directa de las dos proteínas, siete se ubicaron en sitios conocidos de interacciones proteína-proteína con otros socios de unión del contexto biológico más amplio (por lo tanto, diferentes etapas de ensamblaje del spliceosoma), ocho eventos de unión revelaron dos puntos calientes en AR de función aún desconocida y uno en una superficie expuesta a solventes de Prp8RnaseH. Por lo tanto, excluyendo los eventos en los contactos de cristal y el singleton Prp8RnaseH, el número de eventos de unión potencialmente útiles es 15 (correspondiente a 14 aciertos únicos), por lo tanto, una tasa de aciertos del 15,6%. Estos éxitos pueden ser puntos de partida para el diseño de moduladores de interacción proteína-proteína o para compuestos de herramientas destinados a explorar los dos puntos calientes de Aar2 descubiertos. En conjunto, también en línea con las campañas de usuario realizadas, a menudo solo una porción menor de los golpes en la detección de fragmentos cristalográficos debe ser ignorada como artefactos. Sin embargo, esto también dependerá en gran medida del objetivo.

Si la tasa de aciertos es significativamente menor, esto puede indicar uno de los siguientes problemas relacionados con la proteína diana. Por ejemplo, en una campaña del CFS contra una proteasa viral de la cisteína un índice de golpe de el solamente 3% fue observado (datos no mostrados). Resultó que la proteína utilizada probablemente fue modificada químicamente en su sitio activo. En tal caso, una preparación de proteína diferente puede resolver el problema. Si los cristales son muy intolerantes a DMSO, la pantalla de entrada F2X también se puede utilizar sin DMSO, aunque los resultados pueden diferir hasta cierto punto. La mayoría de los aciertos obtenidos en presencia de DMSO también aparecerán en su ausencia. También habrá algunos golpes que no se pueden observar en ausencia de DMSO, aunque se pueden observar en su presencia. Y por último, habrá algunos que sólo aparecen en ausencia de DMSO.

La dificultad más severa ocurre si la proteína experimenta un movimiento inducido-ajuste sobre la unión de la sustancia. Lo más probable es que la red cristalina no tolere el movimiento de la proteína y los cristales se desintegren. En tal caso, la única opción es recurrir a la co-cristalización de la proteína y los fragmentos. Esto puede, sin embargo, conducir a nuevas formas cristalinas. Por lo tanto, gran parte de la automatización de todo el proceso ya no funcionará de manera eficiente. Afortunadamente, en la mayoría de las campañas de CFS realizadas en el HZB hasta ahora, este tipo de problema no se ha encontrado. Puede ser, que la unión débil de un fragmento, no proporciona suficiente energía para inducir un movimiento de la proteína, en particular si la conformación cristalizada se estabiliza por las fuerzas de embalaje de cristal.

Otra limitación seria del método que los autores han encontrado hasta ahora es cuando el cóctel de cristalización (y por lo tanto la solución de remojo) contiene compuestos volátiles. Entonces se vuelve casi imposible realizar todo el manejo de cristales de una manera significativa.

Diferentes proteínas pueden contener sitios farmacológicos en mayor o menor medida. Por ejemplo, las interacciones proteína-proteína generalmente están mediadas por superficies planas extendidas que son más difíciles de atacar. Por lo tanto, la tasa de aciertos de unión a fragmentos probablemente dependerá de la estructura de la superficie molecular de la proteína. En un caso extremo, una proteína podría no contener ningún punto caliente superficial adecuado que sirva como sitios objetivo para la unión de fragmentos. Por lo tanto, a pesar de un experimento meticulosamente realizado, ningún fragmento resultará de la proyección. Sin embargo, los autores no se han encontrado hasta ahora con tal situación.

En principio, utilizando el protocolo descrito anteriormente, la parte de remojo y cosecha de cristales de una campaña de SFC se puede realizar en cualquier laboratorio que esté equipado para el manejo de cristales. Esto distingue la metodología en HZB de otras instalaciones de CFS y puede ser una ventaja en algunos casos. Por ejemplo, si los cristales no se pueden reproducidos fácilmente en otro sitio o si el viaje de los experimentadores es limitado (por ejemplo, en una situación de pandemia mundial), los usuarios de HZB reciben todo el equipo (discos, herramientas, easyaccess frame, soportes de muestras, etc.) como un conjunto portátil.

Sin embargo, los requisitos para un gran número de soportes de muestras y capacidades de almacenamiento criogénico todavía se cumplen más convenientemente en las instalaciones dedicadas al SFC. Además, la necesidad de recopilación de muchos conjuntos de datos de difracción aboga firmemente por la localización de estas instalaciones cerca de las líneas de haz que están orientadas hacia un alto rendimiento de la muestra. Ejemplos de esto son las líneas de haz I04-1 en la Diamond Light Source y la instalación XChem asociada en el Reino Unido8,25,las líneas de haz MASSIF en el ESRF en Francia26 o la instalación FragMAX en la línea de haz BioMAX en MAX IV en Suecia18.

En el futuro, se podría prever el diseño de experimentos de SFC sin la necesidad de manipulación de cristales por completo. Se han reportado los primeros avances en esta dirección. Por ejemplo, mediante transferencia acústica de líquido que permite mezclar tanto las soluciones que contienen cristales como las soluciones de fragmentos directamente en soportes de muestras de tipo malla27. Otro acercamiento fue utilizado para XFEL-basado ligand-investigación. En un experimento de prueba de principio, se preparó una suspensión de cristal en lote, y se realizó la recolección de datos de remojo y difracción en un chip de blanco fijo de silicio28. Sin embargo, estos enfoques todavía están en desarrollo y lejos de ser aplicables a una amplia gama de dianas proteicas o factibles para las instalaciones de SFC como una rutina.

Con el protocolo en este trabajo se han esbozado instrucciones detalladas para realizar con éxito campañas de SFC directamente en HZB (y en otros lugares) y se han dado orientación general y consejos prácticos útiles en la preparación y realización de tales experimentos con mayores posibilidades de éxito. En última instancia, las mejores probabilidades y tasas de éxito en la detección de SFC contribuyen en gran medida a proporcionar de manera eficiente puntos de partida para el desarrollo posterior de compuestos de herramientas o candidatos a fármacos.

Divulgaciones

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Helmholtz-Zentrum Berlin ha presentado una solicitud de patente relativa al marco EasyAccess ante la Oficina Alemana de Patentes y Marcas con el número de registro DE 10 2018 111 478,8. Además, se ha presentado una solicitud internacional de patente por la vía del PCT, utilizando la prioridad de la patente alemana.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los numerosos grupos de usuarios que han realizado campañas de CFS en el HZB. Sus comentarios condujeron a la mejora incremental de nuestro flujo de trabajo. Queremos agradecer al grupo de diseño de fármacos de la Universidad de Marburgo y al grupo FragMAX de MAX IV, ya que las estrechas colaboraciones fueron la base de varios saltos de desarrollo para mejorar el SFC. Agradecemos el apoyo del Ministerio Federal alemán de Educación y Ciencia (BMBF), a través de los proyectos Frag2Xtal y Frag4Lead (números 05K13M1 y 05K16M1). Además, agradecemos el apoyo a través de iNEXT-Discovery, proyecto número 871037, financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 y micro; PipetaL EppendorfEP3123000012
pipeta de 12 canales, 100 µ LEppendorfEP4861000791
Secador de peloTH-Geyer9.106 788
Placas decristales Contiene cristales para remojar
IncubadoraProporciona temperatura constante para el experimento de cristalización, en HZB: 20 grados; C
MicroLoops (LD) de doble espesor de diferentes tamaños de aperturaMiTeGenvarios, por ejemplo
bucles M5-L18SP-75LD		250 en el tamaño adecuado necesario para el protocolo, pueden ser proporcionados por HZB 
EasyAccess FrameHZBEl EasyAccess Frame es un dispositivo especial para el manejo de múltiples cristales, que se desarrolló en el HZB (Barthel et al., 2021).
Placa de criba F2X-Entrypor HZBCriba de entrada F2X (Wollenhaupt et al., 2020)
Placa puntual de vidrioVWRMARI1406506
NitrógenoAl menos una lata de 5 L llena
Lata de almacenamiento de nitrógeno líquido
cristal MagenticMiTeGenM-R-1013198
MicroscopiosLeican.a.MRC
3 lentes Placa de cristalización de perfil bajo de 96 pocillosSwissCI3W96TLP-UVPPara cristales simulados (opcional)
Depósito de reactivosCarl RothEKT6.1Volumen de 25 ml
Plantillahttps://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.
xlsx
BisturíB. BraunBA825SU
Lámina de sellado para placas de microtitulaciónGreinerBioOne676070
Bastones de envío de discos en estanterías (para Unipucks)MiTeGenM-CP-111-0652 bastones de aluminio; puede ser proporcionado por la solución de
remojo HZB Se necesitan al menos 5 ml
Solución de remojo que incluye crioprotector, 150 y micro; LSolo es necesario si la solución de remojo aún no es crioprotectora
Pañuelos Roth (Kimberly Clark Professional)AA64.1
Transport dewar (Whartington dry shipper)MiTeGenTW-CX1002 Travel dewars para el almacenamiento de las 2 cañas unipuck, alternativamente se podría utilizar un dewar de almacenamiento del tipo VHC35 o similar.
Unipuck dewars de espuma con tapaMiTeGenM-CP-111-022dos dewars de espuma especialmente adecuados para el manejo de unipuck descrito en el protocolo
si se utilizan discos SPINE, es posible que se deban aplicar diferentes dewars de espuma.
Juego de inicio UnipuckMiTeGenM-CP-UPSK001Puede ser proporcionado por el HZB
UnipucksMiTeGenM-CP-111-02114 unipucks; puede ser proporcionado por el HZB
cristalización que contienen de cristalización desarrollada líquido n.a.n.a.Varita de de seguimiento de muestras

Referencias

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