Describimos un protocolo rápido y robusto para enriquecer células T asesinas naturales invariantes (iNKT) del bazo de ratón y expandirlas in vitro a números adecuados para estudios in vitro e in vivo.
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Artículo de método
Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo
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Resumen
Resumen
Las células T asesinas naturales invariantes (iNKT) son linfocitos T innatos que expresan un receptor de células T semiinvariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos propios o microbianos presentados por la molécula no polimórfica MHC de clase I CD1d. Los estudios preclínicos y clínicos respaldan un papel de las células iNKT en el cáncer, la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas. Las células iNKT están muy conservadas en todas las especies y su investigación ha sido facilitada por modelos de ratón, incluidos ratones deficientes en CD1d o deficientes en iNKT, y la posibilidad de detectarlas inequívocamente en ratones y hombres con tetrámeros CD1d o mAbs específicos para el TCR semiinvariante. Sin embargo, las células iNKT son raras y necesitan ser expandidas para alcanzar números manejables para cualquier estudio. Debido a que la generación de la línea celular iNKT primaria de ratón in vitro ha demostrado ser difícil, hemos establecido un protocolo robusto para purificar y expandir las células iNKT esplénicas de los ratones transgénicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), en los que las células iNKT son 30 veces más frecuentes. Mostramos aquí que las células iVα14Tg iNKT esplénicas primarias se pueden enriquecer a través de un proceso de separación inmunomagnética, produciendo aproximadamente un 95-98% de células iNKT puras. Las células iNKT purificadas son estimuladas por perlas anti-CD3/CD28 más IL-2 e IL-7, lo que resulta en una expansión de 30 veces por día +14 del cultivo con una pureza del 85-99%. Las células iNKT expandidas se pueden manipular genéticamente fácilmente, proporcionando una herramienta invaluable para diseccionar los mecanismos de activación y función in vitro y, lo que es más importante, también en la transferencia adoptiva in vivo.
Introducción
Las células T asesinas naturales invariantes (células iNKT) son linfocitos T innatos que expresan un receptor de células T αβ (TCR) semiinvariante, formado en ratones por una cadena invariante Vα14-Jα18 emparejada con un conjunto limitado de diversas cadenas Vβ1,que es específico para los antígenos lipídicos presentados por la molécula relacionada con MHC clase I CD1d2. Las células iNKT se someten a un programa de selección de agonistas que resulta en la adquisición de un fenotipo efector activado/innato ya en el timo, que se produce a través de varias etapas de maduración3,
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Protocolo
Los procedimientos aquí descritos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (no. 1048) en el Instituto Científico San Raffaele.
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles. Todos los reactivos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Procesamiento del bazo
- Eutanasiar ratones iVα14-Jα18 por inhalación de CO2 según la política institucional.
NOTA: Los ratones iVα14-Jα18 deben tener 8 semanas de edad o más. Para evitar el rechazo de las células por la transferencia in vivo de las célu....
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Resultados
El protocolo descrito en este manuscrito permite enriquecer células iNKT del bazo de ratones transgénicos iVa14-Ja18 a través de un proceso de separación inmunomagnética resumido en la Figura 1A. Las células T del bazo total se seleccionan primero negativamente agotando las células B y los monocitos, seguidas de la clasificación inmunomagnética positiva de las células iNKT con tetrámeros CD1d cargados con antígeno lipídico PBS-57, que permiten teñir específicamente solo las células iNKT. Est.......
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Discusión
Aquí mostramos un protocolo reproducible y factible para obtener millones de células iNKT listas para usar. Debido a la escasez de estas células in vivo, era muy necesario un método para expandirlas. El protocolo que proponemos no requiere ni una instrumentación particular ni un alto número de ratones. Explotamos ratones transgénicos iVα14-Jα18 a propósito para reducir el número de ratones necesarios para el procedimiento.
Otro protocolo exitoso para la expansión de células iNKT de ratones tra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Paolo Dellabona y Giulia Casorati por el apoyo científico y la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos al NIH Tetramer Core Facility por el tetrámero CD1d de ratón. El estudio fue financiado por la Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) y la beca de la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC) 2019-22604 (a G.D.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de cloruro-amonio-potasio (ACK) | en casa | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microperlas | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| microperlas anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clon 6D5 |
| CD1d-tetrámero -PE | NIH tetrámero central | ratón PBS57-Cd1d-tetrámeros | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clon RM4-5 |
| Fc bloqueador | Bioscience | 553142 | |
| inactivado por calor y filtrado .22 antes de usar | |||
| FOXP3 Tampón de tinción de factor de transcripción | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clon AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columnas | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columnas | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Tampón MACS (MB) | albúmina sérica | bovina al 0,5% (BSA; Sigma-Aldrich) y EDTA de 2 mm | |
| Columnas MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140-035 | |
| Penicilina y estreptomicina (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Fosfato tamponado solución salina (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Filtros de preseparación (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Ratón recombinante IL-7 | R& D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 con glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| piruvato de sodio | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clon H57-597 |
| α CD3CD28 ratón T activador Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoetanol | Gibco | 31350010 |
Referencias
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. <....
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Reimpresiones y permisos
