Estudio De Los Efectos De La Temperatura En La Nucleación Y El Crecimiento De Las Nanopartículas Por Microscopía Electrónica De Transmisión De Células Líquidas

Resumen

El control de la temperatura durante los experimentos de microscopía electrónica en fase líquida abre nuevas perspectivas para estudiar la dinámica de las nanopartículas en entornos líquidos que imitan su formación o medios de aplicación. Utilizando células líquidas de calentamiento recientemente desarrolladas, observamos directamente la influencia de la temperatura en los procesos de nucleación y crecimiento de las nanopartículas de oro en el agua.

Resumen

El control de temperatura es un desarrollo reciente que proporciona un grado adicional de libertad para estudiar la nanoquímica mediante microscopía electrónica de transmisión de células líquidas. En este trabajo, se describe cómo preparar un experimento de calentamiento in situ para estudiar el efecto de la temperatura en la formación de nanopartículas de oro impulsadas por la radiólisis en el agua. El protocolo del experimento es bastante simple, involucrando una celda líquida especial con capacidades de calentamiento uniformes de hasta 100 °C, un soporte TEM de celda líquida con capacidades de flujo y una interfaz integrada para controlar la temperatura. Mostramos que los mecanismos de nucleación y crecimiento de las nanopartículas de oro se ven drásticamente afectados por la temperatura en las células líquidas. Utilizando imágenes STEM y nanodiffraction, la evolución de la densidad, el tamaño, la forma y la estructura atómica de las nanopartículas en crecimiento se revelan en tiempo real. Los algoritmos automatizados de procesamiento de imágenes se explotan para extraer datos cuantitativos útiles de secuencias de vídeo, como las tasas de nucleación y crecimiento de las nanopartículas. Este enfoque proporciona nuevos insumos para comprender los complejos procesos fisicoquímicos en juego durante la síntesis en fase líquida de nanomateriales.

Introducción

Las nanopartículas metálicas (NPs) tienen propiedades fisicoquímicas prometedoras que pueden ser utilizadas en diversos dominios como la detección óptica^1,la medicina² o la energía^3. La síntesis química húmeda es un método muy versátil para fabricar NPs de metal con un tamaño y una forma bien definidos. En las últimas décadas, se han desarrollado muchas estrategias para obtener control sobre la síntesis de NPs: crecimiento mediado por semillas^4,método de bloqueo facial^{5, síntesis}cinéticamente controlada^6,grabado selectivo⁷ o síntesis de temperatura controlada^8. Sin embargo, mientras que las reacciones químicas que impulsan la síntesis son bastante simples, los mecanismos de nucleación y crecimiento no lo son, porque muchos parámetros juegan un papel en los procesos de formación y su influencia individual es difícil de recuperar de las instantáneas ex situ de los nanomateriales resultantes extraídos de su medio de formación en puntos de tiempo dados de la síntesis. Para comprender realmente los procesos de nucleación y crecimiento y establecer formas de controlarlos, debemos emplear herramientas in situ que permitan su observación en tiempo real en un entorno líquido finamente controlado.

En ese sentido, la Microscopía Electrónica de Transmisión de Células Líquidas (LCTEM) ha sido un método muy poderoso para arrojar nueva luz sobre la síntesis de nanopartículas metálicas^{9,10,11,12,13.} Al obtener imágenes de la dinámica de nanoestructuras individuales directamente en sus medios de formación líquida, esta técnica ha proporcionado una comprensión más profunda de los mecanismos de nucleación y crecimiento, en particular el papel de los defectos cristalinos, la morfología de semillas y los ligandos orgánicos que permiten impulsar procesos de crecimiento direccional o grabado yobtener nanomateriales con formas específicas (nanorods, nanoestrellas, nanoplacas, nanoconchas)^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19.} Cuando el haz de electrones de un TEM interactúa con líquidos, los procesos de radiólisis producen fuertes especies reductoras y oxidantes que modifican la química de la solución en el área irradiada y se pueden utilizar para impulsar procesos de crecimiento o grabado. Curiosamente, se sabe que la concentración de productos radiolíticos aumenta con la tasa de dosis de electrones, un parámetro que se puede ajustar con precisión en un microscopio electrónico²⁰. Por lo tanto, esta dependencia de la tasa de dosis de la radiólisis se ha explotado para controlar la velocidad de reacción y revelar efectos cinéticos sobre los procesos de formación y la morfología final de las nanoestructuras^11,15,20.

Aunque la temperatura es un parámetro crucial en la síntesis de nanomateriales, sus efectos no han sido investigados cuidadosamente hasta ahora por LCTEM, porque las células líquidas comerciales con un control de temperatura confiable se han desarrollado recientemente. Sin embargo, tales estudios in situ son indispensables para desentrañar la compleja cinética y los efectos termodinámicos inducen por los cambios de temperatura. De hecho, por un lado el aumento de la temperatura tiene impactos drásticos en los procesos de facetado durante el crecimiento, acelera la difusión atómica y molecular en líquido y modifica las velocidades de reacción. Por otro lado, el diagrama de nanofases de nanoestructuras también es muy sensible a la temperatura. En este artículo, explotamos las células líquidas de calentamiento recientemente desarrolladas para seguir el crecimiento radiolítico de nanopartículas de oro en agua con un control de temperatura entre la temperatura ambiente y 100 °C. Esta metodología que combina imágenes STEM y difracción en un entorno que se acerca cada vez más a las condiciones reales de síntesis reduce la brecha entre las observaciones tem in situ y las síntesis a escala de banco.

Protocolo

1. Alinee el microscopio electrónico de transmisión para las imágenes STEM HAADF

1. Siga las instrucciones del fabricante para la alineación del microscopio.
2. Utilice una muestra seca convencional para alinear el microscopio. No utilice una muestra líquida.
3. Para minimizar la velocidad de crecimiento, minimice la tasa de dosis de electrones (ver sección de discusión), lo que implica el uso de una apertura de condensador pequeña y un tamaño de punto pequeño para reducir la corriente del haz.

2. Manejo de chips electrónicos

NOTA: Los soportes de líquidos comerciales se ajustan a casi todos los TEM, pero usan el soporte que está diseñado específicamente para la marca del microscopio y la pieza del poste. Una célula líquida está hecha de dos chips de silicio basados en MEMS llamados E-chips, los cuales son sustratos de silicio con una ventana de 500 x 50 μm cubierta por una película de nitruro de silicio amorfo (SiN) de 50 nm de espesor que es transparente a los electrones(Figura 1A). Estos dos e-chips tienen diferentes tamaños. El pequeño es de 2 x 2 mm con espaciadores de oro que fijan la distancia entre los dos E-chips (150 nm aquí) y el espesor del líquido. El grande es de 4 x 6 mm y tiene una resistencia incrustada dentro del sustrato de silicio que permite un calentamiento uniforme de la muestra líquida (Figura 1B). Debido a la forma en que se fabrican en salas limpias, los E-chips tienen dos lados diferentes: uno donde la ventana se ve pequeña (aquí después llamada la parte frontal) y la otra donde la ventana es grande con una forma de fregadero (aquí después llamada la parte posterior).

1. Al manipular los E-chips, nunca toque la ventana con pinzas y agarre los chips por los lados. Para evitar rayar la superficie del sustrato de silicio, utilice pinzas con punta de carbono.
2. Si coloca un E-chip en una superficie, asegúrese de que la parte posterior esté en contacto con la superficie porque la película de SiN es frágil y está depositada en la parte frontal.

3. Limpieza del soporte de celda líquida (antes del experimento)

1. Retire la tapa que cubre la punta del soporte. Retire las células líquidas ficticias con pinzas. Retire la junta utilizada con las células líquidas ficticias.
   NOTA: Las células líquidas ficticias son células líquidas sin la ventana de SiN y sólo silicio. Se utilizan para almacenar el soporte de celda líquida en la bomba de vacío. Preste atención al estado de los tornillos de latón porque se desmoronan fácilmente con el tiempo. En particular, si las cabezas de los tornillos están dañadas, los tornillos deben cambiarse. De lo contrario, puede ser difícil desenroscarlos después del experimento y los pequeños desechos también pueden interrumpir la carga de la muestra.
2. Inyecte manualmente 2 ml de agua destilada dentro del soporte utilizando jeringas y el tubo PEEK externo para conectarse a la parte posterior del soporte.
   NOTA: Hay 3 túneles microfluídicos dentro del soporte. Los tres deben limpiarse con agua. Preste atención al agua que sale de la parte delantera del soporte: si el agua está coloreada debido a un experimento anterior, continúe colocando agua dentro del soporte hasta que el líquido no esté coloreado.
3. Si inyecta una solución en la célula líquida durante el experimento (1 mM de HAuCl₄ en agua en nuestro caso), llene el tubo del porta muestras con esta solución.
4. Seque la punta del soporte de celda líquida con una pistola de aire comprimido.

4. Preparación de la célula líquida (E-chips)

1. Limpieza de las células líquidas.
   1. Llene una placa de Petri de vidrio con acetona.
   2. Llene una placa de Petri de vidrio con metanol.
      PRECAUCIÓN: Debido a la toxicidad del metanol, la placa de Petri con metanol debe colocarse bajo una campana extractora de humos. El metanol debe manipularse con el equipo de protección adecuado (guantes).
   3. Ponga un E-chip pequeño y uno grande en la placa de Petri con acetona y espere 2 minutos.
      NOTA: Los chips electrónicos están recubiertos con una capa protectora que debe eliminarse antes del experimento. La acetona eliminará el fotorresistrito y limpiará los E-chips de escombros. Para mejorar la limpieza, la solución se puede agitar suavemente.
   4. Ponga ambos E-chips en la placa de Petri con metanol y espere 2 minutos. El metanol limpiará los E-chips de la acetona y el resto de los escombros.
      PRECAUCIÓN: La transferencia de los E-chips entre la acetona y el metanol debe hacerse lo más rápido posible para no dejar que los E-chips se sequen en el aire.
   5. Seque las células líquidas con una pistola de aire comprimido. Sostenga el E-chip usando pinzas mientras usa la pistola de aire comprimido. Tenga cuidado de no presionar demasiado en el gatillo de la pistola de aire, de lo contrario, el E-chip puede caer de las pinzas. Si abandonan, reinicie la limpieza con acetona y metanol.
   6. Verificar la integridad de la ventana de nitruro de silicio utilizando una lupa binocular o un microscopio óptico (Figura 2).
      NOTA: Asegúrese de que las ventanas de ambos E-chips estén limpias y no rotas. Si los E-chips no parecen limpios, trate de ponerlos de nuevo en acetona y metanol de nuevo. Si la suciedad todavía está en la ventana o si la ventana está rota, los E-chips deben cambiarse por otros nuevos.
   7. El plasma limpia los E-chips con una mezcla de argón y gas oxígeno durante 2 minutos. La limpieza por plasma de los E-chips permite que sean hidrófilos. Aquí están los detalles de la configuración de limpieza por plasma: flujo de gas argón = 35 sccm, flujo de gas de oxígeno = 11.5 sccm, tiempo de espera de flujo de gas = 20 s, objetivo de RF directa = 50 W, rango de RF directa = 5 W, RF máximo reflejado = 5 W.
2. Carga de las celdas líquidas en el soporte TEM (Figura 3).
   1. Cargue las juntas tóricas de la junta dentro del soporte de la celda líquida (Figura 3B). Verifique que la junta utilizada esté limpia. Si no, límpiese rápidamente con agua destilada. Séquelo con un papel de filtro limpio. Para eliminar los desechos y las fibras en la junta, presione entre dos hojas de parafilm varias veces.
   2. Coloque el pequeño E-chip dentro del soporte de celda líquida (Figura 3C). Para reducir la inclinación de las películas de SiN hacia el vacío del microscopio, coloque las ventanas de la célula líquida en una configuración cruzada. Por lo tanto, la ventana del pequeño E-chip debe ser paralela a la longitud del soporte y la parte delantera hacia arriba. Asegúrese de que el pequeño E-chip esté bien insertado dentro de la junta.
   3. Preparar la muestra líquida (aquí, 1 mM de HAuCl₄ en agua).
   4. Gota ≈2 μL de la muestra líquida en el pequeño chip E utilizando una micropipeta (Figura 3D). Si el pequeño chip E se ha limpiado correctamente por plasma, la muestra líquida acuosa se extenderá uniformemente por la superficie del chip.
   5. Retire el líquido extra con un papel de filtro. Con un trozo de papel de filtro cortado bruscamente, reduzca el grosor de la capa líquida en el pequeño E-chip hasta que forme una cúpula plana.
   6. Coloque el E-chip grande dentro del soporte de celda líquida (Figura 3E). Coloque el E-chip grande en el pequeño con su frente boca abajo (los lados frontales de los dos chips deben enfrentarse entre sí). Los electrodos en el E-chip grande deben estar en contacto con la almohadilla del electrodo en el soporte.
   7. Deslice la tapa hacia atrás sobre el soporte de la celda líquida. Apriete gradualmente cada tornillo (Figura 3F).
   8. Seque el líquido eventual que sale de los E-chips usando papel de filtro pequeño recortado. Verifique que no haya líquido saliendo a ambos lados de las celdas líquidas girando el soporte de la celda líquida alrededor de su eje.
3. Pruebe el sellado al vacío de la celda líquida en una estación de bombeo. Si el nivel de vacío de la bomba alcanza 5 x 10^-2 Pa, continúe con el protocolo. Si no es así, compruebe la integridad de la ventana (lo más probable es que esté rota) e inicie el protocolo desde el principio con un nuevo conjunto de chips electrónicos.
4. Verifique por última vez la integridad de la ventana de nitruro de silicio utilizando una lupa binocular o un microscopio óptico. A veces, la celda líquida será capaz de sostener el vacío de la estación de bombeo, incluso si la ventana está rota. Esto se debe a que cuando la ventana se rompe y el líquido se derrama, puede formar agregados de sal en la parte rota de la ventana, cubriendo así el agujero. Si sucede, prepare un nuevo conjunto de E-chips.
5. Cargue el soporte de celda líquida en el TEM y compruebe el nivel de vacío. Incluso si la celda líquida mantuvo el vacío de la estación de bombeo y no hay ningún problema visible con la ventana, la micro-fuga de la celda líquida puede evitar alcanzar el nivel de vacío requerido para operar el TEM. Si el microscopio no puede alcanzar el nivel de vacío requerido para funcionar (2-5 x 10^-5 Pa), retire el soporte de la muestra y prepare un nuevo conjunto de chips E.

5. Utilice el soporte de líquido en modo de flujo

1. Llenar 2 jeringas con unos mililitros de la solución a inyectar (1 mM de HAuCl₄ en agua en nuestro caso).
2. Conecte 2 tubos PEEK externos a las jeringas. Coloque las 2 jeringas en las bombas de la jeringa. Inserte los tubos PEEK externos en las 2 entradas del soporte de celda líquida. Inserte un tubo PEEK externo adicional para la salida del soporte de celda líquida.
3. Inyecte la solución con un caudal de 5 μL/min en cada entrada.

6. Calentamiento del ambiente líquido

1. Conecte la fuente de alimentación al soporte. Conecte la fuente de alimentación al ordenador en el que está instalado el software de calefacción.
2. Enciba el ordenador y abra el software de calefacción. Enciba la fuente de alimentación.
3. Haga clic en el botón de comprobación del dispositivo. Si el software indica "pasado", entonces el experimento puede continuar. De lo contrario, el E-chip grande podría tener un problema (carga incorrecta del E-chip, electrodos rotos...).
4. Haga clic en la pestaña Experimento. Haga clic en Manual para activar el modo manual de calefacción.
5. Seleccione la temperatura objetivo y cambie en consecuencia la tasa de temperatura. Presione aplicar para calentar los E-chips a la temperatura objetivo (Figura 4).
   NOTA: Los E-chips se pueden calentar hasta 100 °C. Si se utiliza una solución acuosa para el experimento (como en nuestro caso), evite calentar los E-chips por encima de 90 °C. De lo contrario, la muestra líquida puede secarse. Al calentar el líquido, la temperatura puede elevarse temporalmente por encima de la temperatura objetivo y luego volver a caer a la temperatura deseada. Utilice una velocidad de calentamiento baja para minimizar tales sobregiros (1 °C/s está bien).
6. Haga clic en Ambiente para volver a la temperatura ambiente (25 °C). Haga clic en Detener para detener la calefacción abruptamente. Haga clic en la pestaña Finalizar sesión para finalizar el experimento de calentamiento.

7. Imágenes STEM del crecimiento de nanopartículas

1. Utilice el microscopio en modo STEM utilizando el detector HAADF. Vaya a un área prístina de la muestra, cerca de una esquina de la ventana de observación donde el espesor del líquido es mínimo. Adquirir vídeos de crecimiento de nanopartículas para diferentes temperaturas del líquido (Figura 5).
   NOTA: Las nanopartículas de oro aparecen inmediatamente y crecen en el área escaneada. La grabación de vídeo con una velocidad de fotogramas de una imagen por segundo es un buen compromiso para observar los procesos de crecimiento con una buena relación señal/ruido y una buena resolución de tiempo.

8. Nanodiffraction STEM de nanopartículas individuales

1. Adquiera una imagen STEM HAADF de varios nano-objetos. Adquirir el patrón de difracción de nanopartículas individuales seleccionadas en la imagen utilizando el software STEMx (Figura 6).
   NOTA: Stem nanodiffraction es una técnica que permite adquirir el patrón de difracción de nanopartículas individuales en líquido durante los experimentos de crecimiento²².
2. Después de la adquisición de una imagen STEM HAADF, seleccione varios nano-objetos en la imagen y el software STEMx sincroniza automáticamente la posición de la sonda y la cámara CCD para adquirir el patrón de difracción en cada posición de la sonda. Para evitar la superposición de los puntos de difracción, utilice un pequeño ángulo de convergencia de la sonda STEM (7.4 mrad en nuestro caso) utilizando una pequeña apertura de condensador (10 μm en nuestro caso).

9. Limpieza del soporte de células líquidas (después del experimento)

NOTA: Aquí describimos un procedimiento de limpieza estándar para el soporte de celda líquida. Si esta limpieza no es lo suficientemente eficiente, es posible utilizar ácido nítrico diluido y metanol para eliminar los eventuales agregados de nanopartículas en el soporte de celda líquida. La documentación de compatibilidad química del soporte de celda líquida debe consultarse antes. En cualquier caso, siempre termine la limpieza con la inyección de agua destilada.

1. Retire la tapa. Retire los E-chips usados. Retire la junta interna.
   NOTA: Los E-chips usados se pueden almacenar en una caja adaptada. A continuación, es posible realizar análisis TEM o SEM ex situ de los nano-objetos que permanecieron unidos a las ventanas de SiN después de desprecintar la celda líquida¹⁵. No es aconsejable reutilizar los E-chips para otro experimento in situ, pero todavía es posible si la película de SiN no se ha roto durante el desprecintado de la célula líquida. A continuación, se pueden realizar experimentos de crecimiento excesivo en un disolvente diferente. ²³
2. Inyecte 5 mL de agua destilada en el tubo de entrada y salida del soporte de celda líquida.
3. Limpie la punta del soporte de celda líquida usando un baño ultrasónico durante 20 minutos. La almohadilla de contacto se puede sumergir en el baño. Sólo sumergir la parte que está cubierta con la tapa. No sumerja los orificios de ventilación en líquido.
4. Seque el soporte de celda líquida con una pistola de aire comprimido.
5. Vuelva a colocar la junta utilizada con las células líquidas ficticias. Vuelva a colocar las células líquidas ficticias y la tapa.
6. Guarde el porta muestras en una estación de vacío.

10. Análisis posterior al experimento utilizando Fiji (ImageJ)

NOTA: Se recomienda dividir cada fotograma del vídeo tomado en imágenes individuales. El propósito de este paso de análisis posterior al experimento es transformar los videos originales de las nanopartículas en videos binarios que puedan ser analizados por Fiji. Se utiliza un filtro mediano para mejorar el contraste de las nanopartículas en el fondo (Figuras 7B & 7E). Esto es esencial para facilitar la binarización del vídeo.

1. Abra el directorio de archivos que contiene las imágenes del video en Fiji haciendo clic en File | Importar | Secuencia de imágenes. Aparecerá la ventana de opciones de secuencia. Seleccione la imagen de inicio adecuada (si se va a descartar el principio del vídeo). Ingrese el número de incremento para la secuencia de imágenes (corresponde al número de fotogramas que toma para que el escaneo STEM llegue a la parte inferior de la imagen). Marque la casilla convertir a escala de grises de 8 bits. Guarde la secuencia de imágenes en formato tiff.
2. Recorte todos los artefactos no deseados del video (por ejemplo, la barra de escala o el borde de la ventana de celda líquida).
3. Haga clic en | de proceso Filtros | Mediana para aplicar un filtro de mediana en todas las imágenes. Guarde la secuencia de imágenes procesada en formato tiff.
   NOTA: Aparecerá una ventana emergente que preguntará el radio utilizado para el filtro mediano. Usamos un radio de 2 píxeles, pero siéntase libre de usar diferentes parámetros. Otros filtros también están disponibles en Fiji que podrían utilizarse para mejorar el procesamiento de imágenes. En particular, el algoritmo de fondo de resta se puede utilizar para hacer que la intensidad de fondo sea plana si no es uniforme. Para ello, haga clic en Procesar | Antecedentes del sustrato. En nuestro caso, este proceso crea pequeñas manchas blancas en el fondo de las primeras imágenes que pueden interpretarse como nanopartículas falsas. Por lo tanto, no utilizamos este proceso, pero debe probarse en otros conjuntos de datos, porque el aumento del espesor del líquido desde la esquina hasta el centro de la celda líquida generalmente induce una intensidad de fondo no uniforme en imágenes LCTEM de bajo aumento.
4. Haga clic en | de imagen Ajustar | Umbral. Muévase manualmente para una mejor precisión del umbral de la binarización hasta que solo las nanopartículas se coloreen en rojo. Pulse el botón aplicar. La ventana Convertir pila en binario aparecerá. Desmarque Calcular umbral para cada imagen. Guarde la secuencia de imágenes binarias en formato tiff (Figuras 7C & 7F).
   NOTA: Se recomienda comprobar si el umbral es satisfactorio en cada fotograma del vídeo.
5. Realice este paso solo si hay una inversión de contraste de las nanopartículas durante el vídeo. Haga clic en | de proceso | binario Dilatar. Hágalo una vez más si es necesario. Haga clic en | de proceso | binario Rellenar agujeros (Figura 7G, ver la sección de discusión).
6. Haga clic en Analizar | Analizar partículas. Definir el rango de tamaño de las nanopartículas analizadas observadas durante el experimento. Marque Resumir.
   NOTA: Es muy importante definir al menos el tamaño mínimo de las nanopartículas observadas. Sin ella, los pequeños puntos negros (ruido) que aparecen en la secuencia de imágenes binarias se considerarán nanopartículas. Como primer intento, elija el tamaño de las nanopartículas más pequeñas identificadas por el ojo, pero luego es necesario un proceso de ensayo y error para comprender el efecto de este parámetro y optimizar el análisis automatizado de datos (ver sección de discusión). Antes de este paso, para recuperar el área de las nanopartículas, haga clic en Analizar | Establecer medidas y comprobar área. Otras medidas están disponibles.
7. Guarde las ventanas Resultados y Resumen. El número de nanopartículas para cada fotograma se encuentra en la ventana Datos de resumen.

Resultados

La Figura 5 muestra dos series de imágenes STEM HAADF de formación de nanopartículas de oro adquiridas durante 80 segundos a 25 °C y 85 °C. En todos estos experimentos la nucleación y el crecimiento de nanopartículas es impulsado por la radiólisis del agua. Entre las especies químicas generadas por este fenómeno inducido por el haz de electrones, los agentes reductores fuertes (es decir, electrones acuosos y radicales de hidrógeno) pueden reducir el ácido tetracloroáutico que conduce a la formación de nanocristales de oro en la interfaz entre las ventanas de SiN y el líquido. Estas dos observaciones in situ realizadas con la misma tasa de dosis de electrones confirman que el presente método permite visualizar el impacto drástico de la temperatura en la formación de nanopartículas en medios líquidos. A baja temperatura, observamos el crecimiento de un conjunto muy denso de pequeñas nanopartículas, mientras que a alta temperatura se obtienen unas cuantas nanoestructuras grandes y bien facetadas. Como el contraste de las imágenes STEM HAADF es proporcional al grosor de las nanopartículas de oro, podemos ver que durante estos experimentos de crecimiento se forman dos poblaciones de objetos: nanopartículas 3D altamente contrastadas y grandes nanoestructuras 2D con forma triangular o hexagonal y un contraste más bajo (indicado por flechas rojas en la Figura 5).

El método de análisis de vídeo descrito en este protocolo permite cuantificar los procesos de nucleación y crecimiento midiendo a lo largo del tiempo el número de nanopartículas y su superficie media en la zona observada. Como se ve en la Figura 8,a baja temperatura se forman más de 800 nanopartículas en unas pocas decenas de segundos de observación, mientras que solo se forman 30 nanopartículas a alta temperatura. Aparte de dos nanoplacas triangulares y hexagonales, todas las nanopartículas ya están presentes en la primera imagen del seguimiento a alta temperatura. La Figura 9 muestra que el área media de superficie de las nanopartículas aumenta 40 veces más rápido a 85 °C que a 25 °C.

La Figura 6 representa una imagen STEM típica y el patrón de difracción de dos nanopartículas de oro que han sido seleccionadas directamente en la imagen (indicadas por flechas rojas en la Figura 6A). Aquí, podemos identificar la estructura cúbica centrada en la cara (FCC) del oro orientado a lo largo de los ejes de zona [001] (Figura 6B) y [112] (Figura 6C).

Figura 1: Esquema de los E-chips y la punta del soporte de celda líquida. (A) El e-chip grande con la resistencia utilizada para calentar la celda líquida (arriba) y el pequeño E-chip (abajo). (B) Ambos E-chips se cargan en el soporte de celda líquida. Los electrodos del E-chip grande están en contacto con las almohadillas del electrodo del soporte de la célula líquida. La resistencia del E-chip grande puede calentar la célula líquida. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. 

Figura 2: Imágenes de microscopio óptico de E-chips que ilustran: (A) Una ventana de SiN intacta que es necesaria para el experimento. (B) Una oblea de silicio dañada en el borde del E-Chip. Este tipo de E-chips se puede utilizar si el área dañada está fuera del área húmeda una vez que la celda líquida está sellada (es decir, si el daño está fuera del área definida por las juntas tóricas). (C) Residuos en la superficie del E-chip. Si dichos residuos no salen después de repetir los procesos de limpieza (ver sección 4.1), no utilice el chip E. (D a F) Ventanas SiN dañadas (E-chips inutilizables). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3: Fotos del proceso paso a paso de la carga de la celda líquida en el soporte TEM. (A) Porta muestra solamente. (B) Coloque la junta tórica en la cavidad. (C) Inserte el pequeño E-chip en las juntas tóricas de la junta. (D) Poner una gota de solución en los pequeños E-chips. (E) Ponga el E-chip grande sobre el pequeño. (F) Selle toda la celda líquida atornillando la tapa. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4: Captura de pantalla del software de calefacción que controla la temperatura de la celda líquida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5:Serie de imágenes STEM HAADF de bajo aumento del crecimiento de nanopartículas de oro. a) a 25 °C. b) a 85 °C. La hora correspondiente se indica en la esquina inferior izquierda de cada imagen. Las nanoestructuras 2D están indicadas por flechas rojas. Todas las imágenes se adquieren con la misma tasa de dosis de electrones de 3,4 electrones·s^-1·nm^-2. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6:Nanodiffraction STEM de nanopartículas individuales. (A) Imagen STEM utilizada para seleccionar las nanopartículas de difracción (las posiciones de la sonda durante las adquisiciones de difracción se indican mediante flechas rojas). B, C) Patrón de difracción de las dos nanopartículas seleccionadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 7:Procesamiento de datos y análisis de imágenes STEM HAADF utilizando Fiji. Las imágenes fueron adquiridas 40 segundos después del comienzo del crecimiento. (A a C) Imagen adquirida a 25 °C. (D a G) Imagen adquirida a 85 °C. (A,D) Imagen STEM en bruto. B, E) Imagen procesada (filtro mediano). (C,F) Imagen binaria. (G) Se aplica una dilatación de los píxeles dos veces y se aplica el proceso de "Rellenar agujeros". Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 8: Gráfico que representa el número de nanopartículas de oro en función del tiempo a 25 °C y 85 °C. Las dos curvas a 25°C se miden automáticamente con un tamaño de detección mínimo (S_min)de 20 (rojo) y 50 (azul) píxeles^2. Los puntos verdes medidos después de 12 y 60 segundos de adquisición representan el número de nanopartículas contadas manualmente en el video adquirido a 25 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Gráficos que representan la superficie media de las nanopartículas de oro en función del tiempo para 25 °C y 85 °C. Los puntos verdes representan mediciones manuales del área promedio de nanopartículas en puntos de tiempo dados del video adquirido a 85 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10:Serie de imágenes STEM HAADF de alto aumento del crecimiento de un solo nanocubo de oro a 85 °C. Esta serie de imágenes se adquirió con una tasa de dosis de electrones de 83,6^electrones-1.nm^-2. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Discusión

El protocolo descrito permite seguir la nucleación y el crecimiento de nanopartículas de oro impulsadas por radiólisis en un medio líquido de temperatura controlada. Combinado con el procesamiento de vídeo automatizado, permite medir el efecto de la temperatura sobre parámetros clave de la síntesis de nanopartículas como la densidad, el tamaño, la forma y la estructura atómica de las nanopartículas. Estos valiosos insumos permiten evaluar el efecto de la temperatura sobre las tasas de nucleación y crecimiento, detectar posibles transiciones de fase y visualizar los procesos de facetado que dictan el resultado final de las soluciones coloidales. Junto con la posibilidad de controlar la composición de los medios reactivos, la TEM de células líquidas con temperatura controlada es otro paso hacia la observación directa de los procesos de nucleación y crecimiento de diversas nanoestructuras en condiciones de síntesis realistas. La interpretación de los resultados presentados en este artículo y su comparación con los modelos de nucleación y crecimiento se discutirá en otra parte. Aquí, queremos destacar varios aspectos metodológicos que deben ser considerados para llevar a cabo experimentos tem in situ relevantes.

En primer lugar, es crucial identificar los efectos del haz de electrones en los medios de reacción porque pueden influir drásticamente en los resultados del experimento. Aquí, como la radiólisis del agua es la fuerza impulsora de la formación de nanopartículas, la velocidad de crecimiento aumenta rápidamente con la tasa de dosis de electrones que afectará la forma final de los nanoobjetivos^11,15. Por lo tanto, para estudiar los efectos de la temperatura sobre la nucleación y el crecimiento de las nanopartículas, es necesario comparar los experimentos de crecimiento adquiridos con la misma tasa de dosis de electrones. En el modo STEM, la tasa de dosis de electrones corresponde a la corriente del haz (en electrones por segundo) dividida por el tamaño de la imagen (en nm^2). Por lo tanto, una tasa de dosis de electrones constante implica mantener la misma corriente de haz (es decir, la misma apertura del condensador y el mismo tamaño de punto) y el mismo aumento para cada experimento. Cuantificar la corriente del haz de las condiciones de imagen utilizando una cámara CCD o una taza de Faraday es importante para interpretar y reproducir los datos. La magnificación y la tasa de dosis resultante deben seleccionarse en función de si se desea visualizar el crecimiento de un gran conjunto de nanopartículas para extraer resultados estadísticamente relevantes sobre la cinética de crecimiento (Figura 5) o los mecanismos de crecimiento a escala de nanopartícula única para identificar los sitios de adsorción preferencial en las superficies de nanopartículas (Figura 10). Si los procesos de nucleación y crecimiento son demasiado rápidos, particularmente a gran aumento, se debe seleccionar una apertura de condensador pequeña y un tamaño de punto pequeño para minimizar la tasa de dosis. La nucleación y el crecimiento de las nanopartículas también pueden ralentizarse al reducir la concentración de precursores metálicos en la solución analizada, pero tenga en cuenta que la concentración de productos radiolíticos aumentará con la temperatura. De manera general, también es importante tener en cuenta el historial de irradiación de electrones de toda la muestra. Aquí, por ejemplo, si se realizan rápidamente varios experimentos de crecimiento en áreas cercanas entre sí, la densidad de nanopartículas disminuirá con el tiempo porque la concentración de precursores de oro en el área estudiada disminuye. Este efecto se puede minimizar separando los experimentos de crecimiento tanto en el espacio como en el tiempo y utilizando el soporte de líquido en modo de flujo.

Los algoritmos de seguimiento de interfaz son extremadamente útiles para automatizar el análisis de videos y extraer resultados cuantitativos sobre la nucleación y el crecimiento de grandes ensamblajes de nanopartículas. Sin embargo, vale la pena señalar que el paso de binarización de imágenes siempre es específico de los datos, lo que significa que los filtros y el procesamiento de datos que se deben aplicar en las imágenes para optimizar la detección de la interfaz nanopartícula / líquido variarán de un experimento a otro. Además, es esencial comparar los resultados de estos análisis automatizados con las mediciones manuales realizadas en unas pocas imágenes para optimizar el flujo de trabajo de procesamiento de imágenes y conocer sus limitaciones. Aquí, por ejemplo, múltiples eventos de dispersión en las nanopartículas 3D cada vez más gruesas formadas a alta temperatura induce una inversión de contraste de su núcleo después de 30 segundos de observación porque el ensanchamiento angular de electrones dispersos resulta en una disminución de la señal recogida en el rango angular del detector anular. Para seguir midiendo el área de superficie real de estas nanopartículas, utilizamos un proceso de datos de "agujeros de relleno" después de la binarización de la imagen que llena el círculo interno de contrastes de forma de anillo (Figura 7F,G). Sin embargo, tuvimos que usar una pequeña dilatación de los objetos para asegurarnos de que estos contrastes de forma de anillo siempre estén completamente conectados. Este último paso conduce a una ligera sobrevaloración de la superficie media de las nanopartículas en las mediciones automatizadas (Figura 9). Del mismo modo, para la detección de nanopartículas, tenemos que definir un tamaño mínimo de objetos detectados (S_mim)para evitar detectar el ruido, pero este parámetro afecta a la tasa de nucleación medida. Como se ve en la Figura 8,el número de nanopartículas detectadas aumenta al comienzo del experimento hasta alcanzar una meseta. Cuando S_min es grande (50 píxeles² correspondientes a 1543 nm^2),las mediciones automáticas y manuales se acuerdan sobre el nivel de esta meseta (835 nanopartículas después de 60 segundos) pero la detección de nanopartículas se retrasa en el análisis automático ya que 835 nanopartículas se cuentan manualmente después de solo 12 s, pero no se detectan automáticamente hasta más tarde. Este tiempo de detección extendido conduce a una subvaloración de la tasa de nucleación. La reducción de S_min a 20 píxeles² (es decir, 617 nm²⁾reduce el error en el tiempo de nucleación del ensamblaje de nanopartículas, pero conduce a una sobrevaloración de la densidad de nanopartículas, especialmente en la etapa temprana de los experimentos (Figura 8), que también afecta a la tasa de nucleación. La detección y las mediciones de tamaño y forma de nanoobjetos con un comportamiento muy dinámico y una baja relación señal/ruido es un desafío común en tem en fase líquida que puede mejorarse aún más utilizando otros métodos de segmentación y denoización²⁴ o enfoques de aprendizaje automático²⁵.

Por último, pero no menos importante, la preparación de la célula líquida y la limpieza del soporte de líquido deben realizarse con mucho cuidado para evitar contaminaciones de los medios de reacción.

En general, el control de la temperatura de la muestra durante los análisis LCTEM ofrece la oportunidad de investigar los efectos térmicos sobre las reacciones químicas que se producen en la interfaz entre sólidos y líquidos. Por lo tanto, esperamos que el presente método allane el camino a otros experimentos tem in situ diseñados para revelar la dinámica de materiales duros, blandos o biológicos en medios líquidos de temperatura controlada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio electrónico 2100 Plus	Jeol
Acetona	Merck
Pistola
comprimido ARM 200F Microscopio electrónico	Jeol
Prismáticos o microscopio
Pinzas
Ordenador con software de calefacción	Software de Protochips
Agua
Chips electrónicos ficticios	Protochips
Juntas/juntas tóricas	Protochips
Solución acuosa de oro	Merck		1 mM de HAuCl4 - Preparado de antemano
Protochips			E-chip de calentamiento de líquidos de gran tamaño
Metanol	Cámara Merck
One View Placa
Número : 2
Tubo de			Número : 3
Destornillador con par de apriete
Protochips		E-chip de líquido pequeño	Espaciadores de 150 nm
Detector STEM HAADF	Jeol
STEMx Número
	: 2
	Número de aparato		: 2
Bomba de vacío	Gatan