Este protocolo proporciona una guía detallada para el alotrasplante generacional inicial y continuo de tumores de Drosophila en el abdomen de huéspedes adultos para estudiar diversos aspectos de la neoplasia. Utilizando un aparato autoinyector, los investigadores pueden lograr una mejor eficiencia y rendimientos tumorales en comparación con los logrados por los métodos manuales tradicionales.
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Artículo de método
Alotrasplante tumoral en Drosophila melanogaster con un inyector autononalquilador programable
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En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe el alotrasplante de tumores en Drosophila melanogaster utilizando un aparato de inyección de auto-nanolitrolitros. Con el uso de un aparato autoinyector, los operadores capacitados pueden lograr resultados de trasplante más eficientes y consistentes en comparación con los obtenidos utilizando un inyector manual. Aquí, cubrimos temas de manera cronológica: desde el cruce de líneas de Drosophila , hasta la inducción y disección del tumor primario, el trasplante del tumor primario en un nuevo huésped adulto y el trasplante generacional continuo del tumor para estudios extendidos. Como demostración, aquí utilizamos los tumores de anillo imaginal inducidos por la sobreexpresión del dominio intracelular Notch (NICD) para el trasplante generacional. Estos tumores pueden primero ser inducidos de manera confiable en un microambiente de zona de transición dentro de los anillos imaginales de las glándulas salivales larvales, luego aloinjertados y cultivados in vivo para estudiar el crecimiento continuo del tumor, la evolución y la metástasis. Este método de alotrasplante puede ser útil en posibles programas de detección de fármacos, así como para estudiar las interacciones tumor-huésped.
Introducción
Este protocolo proporciona una guía paso a paso para el alotrasplante de tumores de anillo imaginal de la glándula salival larval (SG) de Drosophila en el abdomen de huéspedes adultos utilizando un aparato de inyección de autonanolitros (por ejemplo, Nanoject). Este protocolo también proporciona instrucciones para el posterior reasignointe de tumores en nuevas generaciones de huéspedes adultos, lo que brinda oportunidades para el estudio longitudinal continuo de las características del tumor, como la evolución del tumor y las interacciones tumor-huésped. El protocolo también se puede aplicar a los experimentos de detección de drogas.
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Protocolo
1. Preparación del tumor del anillo imaginal SG
- Cruce moscas adultas con genotipos de UAS-NICD (macho: 10-15 moscas) y Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (hembra virgen: 10-15 moscas) y permítales reproducirse durante 1 día a 18 °C. Las moscas adultas seleccionadas deben tener entre 5 y 9 días de edad para garantizar una alta fertilidad.
- Permita que las moscas adultas pongan huevos en el alimento para moscas contenido en viales durante 24 h a 18 ° C, luego retire las moscas adultas.
NOTA: La comida para moscas se prepara utilizando la receta estándar de harina de maíz de Drosophila Stock Center
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Resultados
Aquí, llevamos a cabo el alotrasplante generacional de tumores de anillo imaginal SG utilizando el aparato autoinyector de inyección de nanolitros y realizamos imágenes en vivo del tumor posteriores con un microscopio de escaneo láser confocal, lo que permitió una inmersión más profunda en temas de crecimiento tumoral, migración de células tumorales e interacciones tumor-huésped. Cuando monte moscas, péguelas a un portaobjetos de microscopio y sujete a través de un bloque11 de polidimetilsiloxano .......
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Discusión
El alotrasplante tumoral puede ayudar a los investigadores a abordar ciertos problemas que surgen durante el crecimiento y la progresión del tumor de Drosophila. Uno de esos desafíos es la elusión de las muertes prematuras de larvas o adultos portadores de tumores durante el cultivo de tumores primarios12. En este contexto, el alotrasplante tumoral continuado permite que los tumores crezcan indefinidamente, lo que facilita los estudios longitudinales del crecimiento tumoral, la metástasis.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que declarar entre los autores.
Agradecimientos
Agradecemos a los ex miembros del laboratorio Dr. Sheng-An Yang y al Sr. Juan-Martin Portilla por su contribución en el desarrollo de este protocolo. Estamos agradecidos por el laboratorio del Dr. Yan Song en la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Pekín por compartir su protocolo sobre el alotrasplante manual. También agradecemos al Sr. Calder Ellsworth y al Sr. Everest Shapiro por la lectura crítica del manuscrito.
WMD recibió fondos (GM072562, CA224381, CA227789) para este trabajo del Instituto Nacional de Salud (https://www.nih.gov/) y fondos (IOS-155790) de la Fundación Nacional de Ciencias (htps://nsf.gov/). Los financ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio de escaneo láser confocal | Zeiss | LSM 980 | También conocido como "Zeiss LSM 980" |
| Alimento para moscas de harina de maíz | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | También conocido como "BDSC Standard Corn meal Food" |
| Aguja de disección (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Placa de disección | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Adaptador de fluorescencia para microscopio estereoscópico | Ciencias de la microscopía electrónica | SFA-UV | También conocido como "Adaptador de fluorescencia NightSea" |
| Microscopio de fluorescencia | Zeiss | 495015-0001-000 | También conocido como "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Pinzas | Herramientas de ciencia fina | 11251-10 | También conocido como "Pinzas Dumont #5" |
| Capilar de vidrio (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Pegamento | Elmer | E305 | También conocido como "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Microscopio | Zeiss | 435063-9010-100 | También conocido como "Zeiss Stemi 305" |
| Extractor de micropipetas | World Precision Instruments | PUL-1000 | También conocido como "Extractor de micropipetas de cuatro pasos" |
| Aparato Nanoject | Drummond | 3-000-204 | También conocido como "Inyector Nanoject II Auto-Nanolitro" |
| Jeringa de | 21720001 | ThermoFisher | |
| (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
Referencias
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem....
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Reimpresiones y permisos
