La emulsificación con plantilla de partículas permite ensayos de gotas sin microfluídica

Summary

Los ensayos de gotas de agua en aceite son útiles para la química analítica, la evolución enzimática y el análisis de células individuales, pero generalmente requieren microfluídica para formar las gotas. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque libre de microfluídica para realizar ensayos de gotas.

Abstract

Las reacciones realizadas en gotas monodispersadas permiten una mayor precisión y sensibilidad en comparación con las equivalentes realizadas a granel. Sin embargo, el requisito de los microfluídicos de formar gotas controladas impone una barrera a los no expertos, limitando su uso. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque para generar gotas monodispersas sin microfluídica. Utilizando esferas de hidrogel de plantillas, encapsulamos muestras en gotas monodispersadas mediante vórtice simple. Demostramos el enfoque utilizándolo para realizar PCR digital sin microfluídica.

Introduction

La microfluídica de gotas aprovecha la compartimentación en gotas de picolitros para aumentar la sensibilidad y la precisión de los ensayos en comparación con las reacciones a granel, y tiene numerosas aplicaciones en el cribado químico, la ingeniería de proteínas y la secuenciación de próxima generación1,2,3. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa de gotas digitales (ddPCR) ofrece una mayor precisión en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a granel (qPCR), con aplicaciones para la variación genética en cánceres, la detección de mutaciones causantes de enfermedades y el diagnóstico ^{prenatal4,5,6}. Sin embargo, un desafío de la microfluídica de gotas es el requisito de que los dispositivos microfluídicos dividan las muestras; mientras que la microfluídica permite un excelente control sobre las propiedades de las gotas, requieren experiencia especializada para construir y ^operar7,8. En consecuencia, los métodos basados en gotas se limitan en gran medida a laboratorios expertos o, en raras ocasiones, a aplicaciones en las que se dispone de un instrumento ^{comercial9,10}. Para ampliar el uso de ensayos de gotas, el requisito de instrumentación microfluídica especializada es un obstáculo que debe superarse.

En este artículo, describimos la emulsificación con plantilla de partículas (PTE), un método libre de microfluídica para realizar reacciones en gotas monodispersadas. En PTE, las partículas de plantillas envuelven la muestra en gotas en aceite portador mediante vórtice simple (Figura 1). A medida que el sistema se mezcla, la porción acuosa se fragmenta en gotas de tamaño reducido hasta que las gotas contienen partículas individuales, momento en el que no es posible una mayor fragmentación porque requiere romper las partículas. La muestra engullida rodea las partículas como una cáscara en las gotas, encapsulando así cualquier célula dispersa, reactivos o partes funcionales (Figura 1D). Por lo tanto, PTE no requiere equipo o experiencia para realizar reacciones de gotas más allá de un vórtice común. Además, la generación de gotas toma segundos en comparación con los minutos u horas con microfluídica, y la cantidad producida es proporcional al volumen del contenedor, no al tiempo de operación del dispositivo, lo que lo hace sumamente escalable. Estos beneficios hacen que la PTE sea ideal para realizar ensayos de gotas en una variedad de circunstancias en las que la microfluídica no es práctica. Aquí, demostramos PTE y lo usamos para realizar ddPCR.

Figura 1. Descripción general del proceso de emulsificación con plantilla de partículas. (A) Las partículas de plantillas se mezclan con reactivos. (B) El exceso de reactivos se elimina después de la centrifugación. (C) La adición de moléculas de plantilla ocurre antes de la adición de aceite. (D) El vórtice produce gotas que contienen una sola molécula de plantilla. (E) El termociclado y la imagen posteriores permiten el análisis digital de gotas de la plantilla objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Preparación de partículas de hidrogel para emulsificación por plantilla de partículas.

Las partículas de hidrogel utilizadas para la emulsificación de plantillas de partículas se pueden preparar utilizando dos métodos diferentes.

1. Preparación utilizando partículas disponibles comercialmente
   1. Añadir 0,5 g de partículas secas de poliacrilamida compatibles con PTE (por ejemplo, Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm de diámetro) a 30 ml de agua estéril en un tubo cónico de 50 ml y mezclar bien. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
2. Preparación mediante fabricación microfluídica de partículas
   NOTA: Las partículas de poliacrilamida compatibles con PTE se pueden preparar utilizando fabricantes de gotas disponibles comercialmente (por ejemplo, QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent), etc.), o mediante un diseño microfluídico personalizado.
   1. Fabricación de master personalizado
      1. Diseñe una máscara de fotolitografía suave utilizando un software de diseño asistido por computadora (CAD). Imprima la fotomáscara con una resolución de 10 μm en la película de la placa de circuito.
      2. Vierta 1 ml de fotorresistente en el centro de una oblea de 3 pulgadas de silicio. Utilice un recubrimiento de centrifugado para crear una capa de fotorresistente de 50 μm girándola a 500 rpm durante 30 segundos seguida de 1250 rpm durante 30 segundos. Coloque la oblea sobre una placa caliente a 95 °C durante 15 minutos para evaporar el disolvente.
      3. Asegure la fotomáscara en la oblea de silicio con un portaobjetos de vidrio de cubierta y exponga la oblea bajo un LED UV colimado de 190 mW y 365 μm durante 2,5 min. Coloque la oblea en una placa caliente ajustada a 95 °C durante 5 minutos para hornear después de la exposición.
      4. Desarrolle la oblea de silicio fotorresistente sumergiéndola en un baño de acetato de éter monometílico de propilenglicol 100% (PGMEA) durante un máximo de 15 min. Enjuague la oblea con 100% PGMEA fresco seguido de 100% isopropanol. Seque al aire la oblea.
      5. Retire cualquier isopropanol residual secando la oblea en una placa caliente a 95 °C durante 1 min. Coloque la oblea en un 3 limpio en placa de Petri.
   2. Fabricación del dispositivo microfluídico personalizado
      1. Mezcle la base de silicio de polidimetilsiloxano (PDMS) y el reactivo de curado en una proporción de 10:1 por masa. Desgasificar el PDMS mixto utilizando un desecador bajo vacío doméstico hasta que no se observen burbujas de aire.
      2. Vierta el PDMS desgasificado sobre el maestro en la placa de Petri, asegurando que la oblea de silicio esté completamente sumergida. Desgasifica la oblea de silicio y el PDMS para eliminar cualquier burbuja de aire que pueda haberse formado durante el vertido.
      3. Cure el PDMS colocando la oblea de silicio y el PDMS en un horno a 65 °C durante al menos 60 min. Elimine un bloque de PDMS que contiene las características microfluídicas de la placa de Petri con un bisturí. Tenga especial cuidado para evitar dañar cualquier característica presente en el maestro de silicio.
      4. Perfore las entradas y las salidas en el bloque PDMS correspondiente a las entradas y salidas en el dispositivo microfluídico utilizando una punción de biopsia de 0,75 mm. Elimine el polvo y las partículas con la aplicación repetitiva y la eliminación de la cinta de embalaje a la superficie del bloque PDMS.
      5. Limpie un portaobjetos de vidrio de 50 mm x 75 mm enjuagándolo con 100% isopropanol y posteriormente secando al aire la superficie. El plasma trata tanto el portaobjetos de vidrio como el PDMS (características hacia arriba) utilizando 1 mbar de plasma de _O2 durante 1 minuto utilizando un enlazador de plasma.
      6. Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio colocando el PDMS tratado con plasma con características hacia abajo en el portaobjetos de vidrio, con el lado tratado con plasma hacia arriba. Coloque el portaobjetos en un horno a 65 °C durante al menos 30 minutos para completar la unión.
      7. Trate todos los canales microfluídicos con un tratamiento superficial fluorado para garantizar la hidrofobicidad superficial y evitar la humectación. Hornea el dispositivo a 65 °C durante al menos 10 min.
   3. Fabricación de partículas de plantillas
      1. Preparar una solución de poliacrilamida (PAA) que consista en 6,2% de acrilamida, 0,18% de N,N′-metilenobis (acrilamida) y 0,3% de persulfato de amonio. Cargue esta solución en una jeringa de 1 ml con una aguja de 28G.
      2. Preparar una fase continua insoluble que consiste en 5% (p/p) de fluorosurfactante y 1% de N,N,NN-tetrametilendiamina (TEMED) en aceite de hidrofluoroéter (HFE) para la generación y estabilización de gotas. Cargue la solución en una jeringa nueva de 1 ml.
      3. Cargue las jeringas que contienen las jeringas que contienen paA y HFE en las bombas de jeringa (por ejemplo, NE-501). Conecte ambas jeringas al dispositivo microfluídico mediante tubos de polietileno insertados en la jeringa y en el dispositivo. Antes de la conexión, prepare las bombas para eliminar el aire de la tubería.
         NOTA: Dependiendo del modelo, las bombas de jeringa se pueden controlar con entrada incorporada, software de fabricación o un script personalizado (disponible en https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).
      4. Ejecute el dispositivo de generación de gotas con entradas de aceite PAA y HFE a 300 μL/h y 500 μL/h, respectivamente. Recoger 1 ml de las gotas en un tubo de recogida de 15 ml e incubar durante 3 h a temperatura ambiente para la polimerización. Después de la incubación, retire la capa inferior de aceite mediante pipeteo.
      5. Agregue 1 ml de perfluoro-1-octanol (PFO) al 20% (v/v) en aceite de HFE al tubo de recolección de 15 ml como demulsificante químico. Después de mezclar, gire el tubo de recolección de 15 ml a 2000 x g durante 2 minutos. Retire el sobrenadante PFO/HFE mediante pipeteo. Repita 1x.
      6. Agregue 2 ml de monooleato de sorbitano al 2% en hexano al tubo de recolección de 15 ml y al vórtice para mezclar. Girar el tubo a 3000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante mediante pipeteo para eliminar la solución de surfactante/hexano. Repita 2x.
      7. Agregue 5 ml de tampón TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0.2% Triton X-100) y mezcle bien. Girar hacia abajo a 3.000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante mediante pipeteo. Repita 3x.
      8. Resuspend en 5 mL TEBST. Esta solución puede almacenarse a 4 °C indefinidamente.

2. Emulsificación con plantilla de partículas.

Después de la preparación de las partículas de plantillas, PTE se utiliza para encapsular la muestra y los reactivos en gotas.

1. Prepare las partículas de poliacrilamida para la emulsificación por plantilla de partículas centrifugando a 6000 x g durante 1 min para granular las partículas, luego retire el sobrenadante mediante pipeteo y vuelva a suspender con agua estéril. Repita 3x para asegurar la eliminación de cualquier TEBST residual.
2. Determine la concentración y el diámetro de las partículas de plantilla utilizando un hemocitómetro (o equivalente). Calcule el diámetro de partículas individuales midiendo los diámetros en píxeles y convirtiéndolos a micras. La conversión de píxeles a micras se puede calcular utilizando el hemocitómetro (o equivalente) como una diapositiva de calibración y midiendo la distancia de cuadrícula conocida en píxeles.
3. Prepare la fase dispersa en un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml utilizando una mezcla maestra de PCR, los cebadores apropiados y una sonda de hidrólisis de fluoresceína de acuerdo con la Tabla 1. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min bajo agitación suave (10 rpm) utilizando un rotador de tubo para asegurar una distribución homogénea de los componentes.
   NOTA: El volumen y la concentración objetivo de las partículas se basan en la carga de Poisson. Como regla general, el número de partículas debe ser un orden de magnitud mayor que el número de muestras a encapsular. Para muestras de concentraciones desconocidas, es necesaria una serie de dilución para garantizar la carga de Poisson.

Volumen	Reactivo
100 μL	Partículas (450 partículas / μL)
200 μL	2x mezcla maestra de PCR
18 μL	Imprimación delantera de 10 μM
18 μL	Imprimación inversa de 10 μM
18 μL	Sonda de 10 μM
0,8 μL	Tritón X100
45,2 μL	Agua libre de nucleasas

Tabla 1. Preparación de la mezcla maestra de PCR utilizada con PTE para PCR de gotas digitales.

4. Centrifugar la fase dispersa a 6000 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante. Registre el volumen del sobrenadante extraído y utilizando el volumen total de fase de dispersión calculado en 2.3 determine el volumen de pellets.
   NOTA: La cantidad de sobrenadante extraído variará dependiendo del empaquetamiento de partículas, el diámetro y la concentración con un volumen mínimo esperado de 300 μL.
5. Añadir 1 μL de ADN genómico de 1,62 pg/μL de Saccharomyces cerevisiae al pellet de 2,4 y mezclar bien mediante pipeteo o tapping vigoroso.
   NOTA: La presencia de exceso de contenido acuoso puede disminuir la eficiencia de encapsulación. Si el volumen de la muestra supera el 1% del volumen del pellet, concentre la muestra. Si la muestra no se puede concentrar, escale la mezcla maestra de PCR y el volumen de pellets resultante de acuerdo con el volumen de muestra. PTE permite la emulsificación de volúmenes pequeños (10 μL) a grandes (2 mL) de partículas de plantillas. La mezcla maestra de PCR (2.3) y el aceite (2.6) se pueden escalar de acuerdo con el volumen objetivo (2.3) y medido (2.4) del pellet de partículas, respectivamente.
6. Agregue 200 μL de fluorosurfactante al 2% en aceite de HFE al tubo como la fase continua insoluble para la emulsificación. Asegúrese de que el pellet se desaloje mediante pipeteo o golpeteo / movimiento del tubo. Luego vórtice a 3000 rpm durante 30 segundos.
   NOTA: La configuración correspondiente a 3000 rpm puede variar según la marca y el modelo.
7. Deje que las emulsiones se asienten durante 1 min. Retire 100 μL de la fase de aceite inferior y reemplace este volumen con fluorosurfactante fresco al 2% en aceite HFE. Invierta suavemente el tubo varias veces para mezclar. Repita 3-5 veces o hasta que se hayan eliminado las pequeñas gotas de satélite.

3. PCR y análisis de gotas digitales.

1. Después de 2-5 minutos de sedimentación, retire la fase de aceite inferior. Reemplace este volumen con fluorosurfactante al 5% en aceite de fluorocarbono (por ejemplo, FC-40).
2. Usando una punta de pipeta de orificio ancho, pipetee cuidadosamente los 100 μL de muestra en tubos de PCR de 200 μL. Coloque los tubos de PCR en un termociclador y corra de acuerdo con la Tabla 2.

Paso	Temperatura	Duración	Notas
1	95 °C	2 min
2	95 °C	30 s
3	50 °C	Años 90
4	72 °C	Años 60 s
5			Repita los pasos 2 a 4 de x34
6	72 °C	2 min
7	4 °C	sostener

Tabla 2. Condiciones de termociclamiento para PCR digital de gotas utilizando emulsiones PTE.

3. Pipetear la muestra en una diapositiva de conteo utilizando una punta de pipeta de orificio ancho para imágenes fluorescentes. Tome una imagen de la muestra utilizando un microscopio fluorescente con excitación de 490 nm y longitudes de onda de detección de emisión de 525 nm.
4. Cuantificar las gotas fluorescentes positivas (_Np) y las gotas totales (_NT) para verificar la presencia y calcular el número de moléculas plantilla (λ) utilizando la fracción de gotas positivas (_Np/_NT) y las estadísticas de Poisson:
   
5. Calcule el intervalo de confianza del 95% (_zc = 1,96) mediante:
   
6. Calcule la concentración de la muestra (moléculas/μL) utilizando el volumen (ν en μL) de la muestra añadida en el paso 2.5, utilizando la ecuación que se indica a continuación. Determinar la media y la desviación estándar de la concentración de la muestra mediante réplicas técnicas.
   

Results

Figura 2. Encapsulación de la muestra en gotas mediante emulsificación con plantilla de partículas. A) partículas de plantillas utilizadas para la emulsificación de plantillas de partículas. (B) Separación del pellet de partículas de plantillas del sobrenadante después de la centrifugación. (C) Gotas resultantes de la emulsificación con plantilla de partículas con (D) cáscara acuosa identificable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En PTE, la monodispersidad de las emulsiones está dictada por la de las partículas de plantillas, porque las gotas tienen un diámetro ligeramente mayor que las partículas. Por lo tanto, las partículas uniformes son fundamentales para la encapsulación controlada de ^PTE11. Existe una variedad de métodos para generar partículas de plantillas uniformes, incluyendo métodos químicos (sol-gel, polimerización en emulsión), hidrodinámicos (emulsificación por membrana, homogeneización) y de filtración. Los enfoques microfluídicos, en particular, ofrecen una excelente monodispersidad (Figura 2A) y permiten que la ingeniería de partículas adicional mejore su funcionalidad en ^PTE12. Alternativamente, se pueden comprar partículas de plantillas, aunque su uniformidad, aunque adecuada, suele ser menor que con la generación ^{microfluídica11}.

Para realizar PTE, las partículas se mezclan con la muestra a encapsular (Figura 1A), y el exceso de sobrenadante se elimina por centrifugación y pipeteo (Figura 1B), como se ilustra con una fotografía de un pellet de partículas en la parte inferior de un tubo de PCR (Figura 2B). Luego se agrega el aceite encapsulante que contiene un surfactante estabilizador (Figura 1C) y la muestra se pipetea suavemente antes de vórtice durante 30 segundos (Figura 1D), para generar la emulsión (Figura 2C). Las gotas resultantes contienen un núcleo de partículas y una capa acuosa que comprende la muestra inicial, dentro de la cual residen los reactivos, las moléculas diana y las células necesarias para la reacción (Figura 2D). Al igual que en la encapsulación microfluídica de gotas, las entidades discretas como pequeñas cuentas o células se encapsulan al azar y de acuerdo con una distribución de Poisson, aunque casi todas las gotas contienen una partícula de plantillas debido a la naturaleza de la física de PTE.

Figura 3. Identificación y limpieza de gotitas de emulsificación con plantilla de partículas. (A) Ejemplo de generación de gotas no uniformes con múltiples partículas por gota de vórtice insuficiente. (B) Presencia esperada de satélites y gotas después de la emulsificación con plantilla de partículas y (C) el fraccionamiento de agua en aceite. (D) Emulsión resultante después del lavado con aceite. E) Generación excesiva de satélites resultante de la sobrenadante residual durante la emulsificación con plantilla de partículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Incluso en la PTE exitosa, existen gotas de doble o triple núcleo, aunque generalmente contribuyen de manera insignificante a la reacción, siempre que sean raras. Lograr una baja frecuencia de gotas multinúcleo mientras se conservan las carcasas adecuadas requiere la optimización de los parámetros del proceso, incluida la tensión superficial, las fuerzas de adhesión entre partículas, la viscosidad de la muestra, el tamaño del contenedor y la potencia y el tiempo de vórtice. Por ejemplo, una emulsificación mal optimizada puede contener gotas polidispersadas con muchas partículas de plantillas (Figura 3A), lo que indica que el vórtice fue insuficiente para emulsionar completamente la muestra. En tales casos, se pueden agregar detergentes para reducir la adhesión entre partículas y reducir la tensión superficial, o se puede aumentar la potencia o el tiempo de vórtice. Otro problema común es la generación de satélites excesivos, que son pequeñas gotas vacías (Figura 3B). Los satélites pueden ser inevitables en las emulsiones PTE dependiendo de la tensión interfacial y las propiedades reológicas de la muestra y el aceite portador. Sin embargo, a menudo son el resultado de no eliminar adecuadamente el exceso de muestra antes de la emulsificación (Figura 2B), o de un vórtice con demasiada potencia, despojando las conchas de las gotas. En una emulsificación PTE exitosa, los satélites no deben comprender más de ~ 10% del volumen total de muestra encapsulada (Figura 3C)¹¹. En este nivel, generalmente contribuyen de manera insignificante a la reacción y pueden ser ignorados. Para fines estéticos, se pueden eliminar de la emulsión lavando con aceite fresco (Figura 3D).

Figura 4. Evaluación de la pcrización digital de gotas de emulsificación de partículas. (A) Las imágenes fluorescentes de las gotas identifican gotas fluorescentes positivas y gotas no fluorescentes negativas. (B) Identificación de plantilla rara o bajas concentraciones de plantilla con PCR de gota digital. (C) Sobre abundante encapsulación de plantillas que resulta en un número variable de moléculas de plantilla por gota. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para demostrar la utilidad de la PTE, la utilizamos para realizar ^PCR11 digital libre de microfluídica. Usando el proceso, encapsulamos una muestra que comprende ADN genómico de S. cerevisiae y la termociclamos. En la PCR digital, las gotas que contienen objetivos amplificados se vuelven fluorescentes, mientras que las que no lo hacen permanecen tenues. Por lo tanto, una gota fluorescente indica un objetivo, lo que permite la cuantificación directa de los objetivos mediante el recuento de gotas positivas (Figura 4A). Por lo tanto, el número de gotas fluorescentes se escala con las moléculas objetivo, produciendo pocos positivos cuando el objetivo es raro (Figura 4B) y muchos cuando es abundante (Figura 4C). Al igual que con la encapsulación de otros componentes discretos, la encapsulación objetivo sigue una distribución de Poisson, lo que permite que la fracción de gota positiva se transforme en la concentración objetivo (Figura 4D), demostrando así la capacidad de realizar PCR digital con ^PTE11.

Figura 5. Demostración de PCR digital con gotas utilizando PAA disponible comercialmente. (A) Las imágenes fluorescentes de las gotas identifican gotas no fluorescentes negativas. (B) Identificación de bajas concentraciones de plantilla con GOTITAS DIGITALES PCR. (C) Identificación de altas concentraciones de plantilla con PCR digital de gotas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estos resultados son repetibles utilizando partículas de poliacrilamida disponibles comercialmente (Figura 5) y demuestran la capacidad de PTE para realizar PCR digital estándar con partículas de poliacrilamida disponibles comercialmente, logrando mediciones precisas en el mismo rango.

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Discussion

PTE utiliza partículas para encapsular muestras en gotas monodispersadas por vórtice. Además de su simplicidad y accesibilidad, PTE proporciona varios beneficios adicionales, incluido el permitir que se generen grandes volúmenes de gotas instantáneamente. Además, el proceso se puede llevar a cabo en un tubo aislado, evitando la necesidad de transferir muestras a dispositivos microfluídicos, agilizando el flujo de trabajo general y limitando las oportunidades de contaminación o pérdida de muestras. Las partículas de plantillas también proporcionan un medio para diseñar el contenido de las reacciones de gotas resultantes. Por ejemplo, el tamaño de partícula, la química y la humectabilidad se pueden diseñar para la captura de biomoléculas o células dirigidas, mientras que las partes funcionales como enzimas, activos o ácidos nucleicos, se pueden mostrar en partículas para facilitar las reacciones, como para la secuenciación de células individuales o la caracterización funcional. Si bien el enfoque es flexible, existen importantes limitaciones para su uso. Por ejemplo, actualmente no es posible realizar adiciones de gotas como a menudo se realizan con microfluídica, lo que requiere que todos los componentes de reacción se introduzcan antes de la encapsulación; esto requiere que los reactivos sean compatibles y estables hasta que se puedan generar las gotas y, en el caso de combinaciones problemáticas, a menudo se puede abordar mezclando y emulsionando rápidamente la muestra en hielo. Alternativamente, se pueden utilizar componentes reactivos que se pueden activar externamente con luz o ^calor13. Por lo tanto, PTE proporciona un método flexible y escalable para realizar ensayos de gotas accesibles para no expertos. Esto, junto con su simplicidad y flexibilidad innatas, hace que PTE sea ideal para la ejecución y el desarrollo de numerosas aplicaciones de gotas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro de jeringa de 0,22 mmm	Milipore Sigma	SLGP033RS
0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo-Fisher	15575020
punzón de biopsia de 0,75 mm	World Precision Instruments	504529
jeringas de 1 mL	BD	309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)	Sigma-Aldrich	370533
1M Tris-HCI, pH 8.0	Thermo-Fisher	15568025
agujas de calibre 27	BD	305109
obleas de silicio de 3", tipo P, grado de prueba virgen	University Wafers	447
soporte de jeringa centrífuga impreso en 3D	(personalizado	) (personalizado)
Solución de acrilamida, 40%, para electroforesis, filtrado estéril	Sigma-Aldrich	A4058-100ML
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Aquapel (tratamiento de superficies fluoradas)	Pittsburgh Glass Works	47100
Hexano	Sigma-Aldrich	139386
FC-40 aceite fluorado	Sigma-Aldrich	F9755
Isopropanol	Sigma-Aldrich	109827
N,N′-Metilenabis (acrilamida)	Sigma-Aldrich	146072-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Novec-7500 Fluido de ingeniería (aceite HFE)	3M	98-0212-2928-5
tubo de polietileno	Scientific Commodities	B31695-PE/2
fluorosurfactante	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactante
Desarrollador PGMEA	Sigma-Aldrich	484431
Photomasks	CadArt Servcies	(custom)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)	Applied Biosystems	4464263
Spin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Span 80 (monooleato de sorbitano)	Sigma-Aldrich	s6760
SU-8 3025 fotorresistente	Kayaku	17030192
Triton X-100 (etoxilato de octilfenol)	Sigma-Aldrich	t8787
Tween 20 (polisorbato 20)	Sigma-Aldrich	p2287
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)	Applied Biosystems	4464263
Yeast FWD	IDT	5′-GCAGACCAGAGAACAAA-3′
Levadura REV	IDT	5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3
Sonda de levadura	IDT	5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′
EVOS FL	AUTO Life Technologies
EVOS LED Cube, GFP	Life Technologies
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (base PDMS y reactivos de curado)	Dow Corning	DC4019862
TEMED	Thermo Fisher	17919
ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae	Milipore	69240-3
Limpiador de plasma expandido (aglutinante de plasma)	Harrick Plasma	PDC-002 (230V)