Artículo de método

Microgotas de dimetildioctadecilamonio con cáscara de cambio de fase como un prometedor sistema de administración de fármacos: resultados en esferoides 3D de células tumorales de mamíferos

DOI:

10.3791/62255

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14 de marzo de 2021

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1Department of Chemical Sciences and Technologies, University of Rome Tor Vergata, 2Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Las microgotas de decafluoropentano desarrolladas con una capa de bromuro de dimetildioctadecilamonio mostraron una estabilidad coloidal excepcional y una biointerfaz actractiva. Los DDAB-MD demostraron ser reservorios de fármacos eficientes caracterizados por una alta afinidad con las membranas plasmáticas junto con una mayor absorción y actividad antitumoral de la doxorrubicina contra el modelo 3D de cáncer de mama triple negativo humano (MDA-MB-231).

Resumen

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La mejora significativa de las microgotas (MD) de perfluorocarbono de cambio de fase en el vasto escenario teranóstico pasa por la optimización de la composición de las MD con respecto a la eficiencia de síntesis, la estabilidad y la capacidad de administración de fármacos. Para ello, se diseñaron MDs de decafluoropentano (DFP) estabilizados por una capa de surfactante catiónico de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB). Se obtuvo fácilmente una alta concentración de DDAB-MD en pocos segundos mediante insonación pulsada de alta potencia, lo que dio como resultado gotas de bajo tamaño polidisperso de 1 μm. El ζ potencial altamente positivo, junto con las largas cadenas de hidrocarburos saturadas de la carcasa del DDAB, son factores clave para estabilizar la gota y la carga de droga que contiene. La alta afinidad de la cubierta de DDAB con la membrana plasmática celular permite la administración de quimioterapia localizada al aumentar la concentración del fármaco en la interfaz de la célula tumoral y aumentar la absorción. Esto convertiría a los DDAB-MD en una herramienta relevante de administración de fármacos que exhibe una alta actividad antitumoral a dosis muy bajas de fármacos.

En este trabajo, se demuestra la eficacia de este enfoque para mejorar drásticamente el efecto de la doxorrubicina contra los esferoides 3D de células tumorales de mamíferos, MDA-MB-231. El uso de cultivos celulares tridimensionales (3D) desarrollados en forma de esferoides tumorales multicelulares (es decir, células densamente empaquetadas en forma esférica) tiene numerosas ventajas en comparación con los cultivos celulares 2D: además de tener el potencial de cerrar la brecha entre los estudios in vitro convencionales y las pruebas en animales, mejorará la capacidad de realizar pruebas in vitro más predictivas ensayos de cribado para el desarrollo preclínico de fármacos o evaluar el potencial de los fármacos no indicados en la etiqueta y las nuevas estrategias de co-targeting.

Introducción

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Los vectores de administración de fármacos capaces de garantizar una alta eficacia antitumoral y reducir los efectos secundarios son objetivos primarios, sin dejar de ser un grave desafío químico-farmacéutico 1,2. Hasta la fecha, su progreso está limitado en un primer momento por el contraste de una liberación insuficiente de fármacos in situ y un nivel crítico de toxicidad inespecífica 3,4,5. En los últimos años, se han implementado varios sistemas de administración de fármacos para mejorar la administración de agentes anticancerígenos, incluyendo liposomas, micelas poliméricas, polimerosomas 6,7,8,9,10. Estos sistemas muestran potencial para aumentar el tiempo de circulación y la selectividad de los fármacos, al tiempo que reducen la distribución y la acumulación en órganos y tejidos sanos. De todos modos, las formulaciones encapsuladas de los fármacos quimioterápicos antineoplásicos, como las antraciclinas, condujeron a una reducción significativa de la eficiencia de la internalización de los fármacos. Recientemente, los portadores micrométricos y submicrónicos que responden a estímulos, como las microburbujas11, las microgotas, las nanopartículas híbridas de oro12, los nanohidrogeles13, los andamios PLGA y las plataformas mesoporosas14, han ido ganando interés farmacológico por su gran versatilidad para dirigirse y ejercer efectos inhibidores tumorales utilizando doxorrubicina (Dox) y docetaxel. Los experimentos pioneros para convertir a estos portadores en soldados anticancerígenos eficientes para la tarea multimodal (es decir, enfoques quimioterapéuticos, fototérmicos y sinérgicos de genes) y la imagen molecular15 han allanado el camino para la nanomedicina teranóstica personalizada.

En este escenario, las microgotas de perfluorocarbono (MD) de cambio de fase se han evaluado a través de la oportunidad clave que ofrecen para conjugar la alta carga de fármacos, la versatilidad química de la cubierta de MD abordando las barreras biológicas, la estabilidad coloidal y la eficiencia de síntesis11,12. Como ventaja adicional, la ecogenicidad de los MD promovida por la vaporización acústica u óptica del núcleo de perfluorocarbono (PFC) permite obtener imágenes in situ y una eficacia terapéutica prometedora. Además, la vaporización del núcleo de MDs obtenida por la liberación de energía de haces de partículas ionizantes puede aprovecharse para el seguimiento del haz y la dosimetría de radiación.

El presente estudio tiene como objetivo desarrollar microgotas de decafluoropentano (DFP) estabilizadas por una capa multiutilizable de surfactante catiónico de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB). Los MD con cáscara DDAB cumplen con las expectativas fisicoquímicas y biológicas. Se ha demostrado que las microgotas basadas en DFP son valiosos agentes de contraste de cambio de fase para lograr MD16 de perfluorocarbono biocompatibles y estables. El gel cristalino DDAB satura las cadenas largas a temperatura fisiológica, penetrando profundamente en el núcleo hidrofóbico, estabilizando la gota y la carga del fármaco en ella. Además, el alto potencial positivo de ζ en la interfaz del agua mejora la estabilidad coloidal de los MD. El atractivo biológico de la superficie de la cáscara del DDAB radica en la capacidad de causar la muerte de bacterias y hongos, en concentraciones que apenas afectan a las células de mamíferos, y de unirse a las membranas plasmáticas, proteínas antigénicas cargadas negativamente, nucleótidos, ADN o nanopartículas. Las características antes mencionadas pueden ser explotadas para generar una notable acción inmunoadyuvante, de terapia génica y antitumoral dentro de las células de mamíferos17.

Los DDAB-MD cargados con dox (Dox@DDAB-MD) descritos en este documento promueven la liberación del fármaco contra las células de cáncer de mama triple negativo altamente agresivas, invasivas y poco diferenciadas. A continuación se describe un protocolo simple y rápido basado en la insonación de sondas de alta potencia para obtener DDAB-MDs estables y de alta densidad con una distribución de tamaño estrecha con una alta eficiencia de carga de Dox en una formulación de un solo paso. Tales características son competitivas incluso para otros métodos de preparación como los dispositivos microfluídicos y los homogeneizadores de alto cizallamiento16.

El otro gran problema limitante en el diseño de vectores eficientes de administración de fármacos es que la actividad de un fármaco es una función de varios parámetros (por ejemplo, absorción, distribución, concentraciones) que se pueden obtener en un objetivo biológico real, que no pueden ser considerados por modelos de células monocapa18. Por esta razón, la historia del desarrollo de nuevas formulaciones antitumorales está salpicada de estudios in vitro que, lamentablemente, han resultado ineficaces ya a nivel de modelos preclínicos en animales19.

En particular, la necesidad de pasar de los cultivos celulares a un sistema más complejo y fiable que los estudios in vivo y ex vivo está vinculada a las limitaciones inherentes a los estudios farmacológicos sobre cultivos 2D. En este contexto, se incluyen los sistemas 3D in vitro, como esferoides, organoides, organ-on-chip, que simulan la morfología, actividad y respuesta fisiológica de estructuras más complejas que las monocapas2D 20 20. En un punto de vista preclínico, los modelos celulares 3D que imitan el microambiente celular ofrecen la posibilidad de comprender mejor la biología compleja en un marco fisiológicamente más pertinente en el que los cultivos monocapa tradicionales no son efectivos21,22.

Tras demostrar que los DDAB-MDs pueden interactuar con la membrana celular de las células de cáncer de mama humano, favoreciendo la internalización de fármacos y la muerte celular a concentraciones muy bajas (nanomolares) de Dox, se ha probado la eficacia de dicha metodología frente a esferoides 3D de células tumorales de mamíferos, MDA-MB-231.

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Protocolo

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NOTA: Todos los reactivos e instrumentos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación y caracterización de microgotas

  1. Preparación de DDAB-MD cargados con Dox
    1. Disolver el polvo de DDAB en etanol para obtener una concentración final de 10 mM y un volumen final de 1 mL. Prepare 1 mL de solución madre de Dox disolviendo 2 mg de polvo de Dox en etanol.
      PRECAUCIÓN: Se sabe que Dox tiene toxicidad oral aguda, categoría 4 y carcinogenicidad, categoría 1B. Úselo solo debajo de una campana extractora con guantes y una mascarilla sanitaria.
    2. Agregue 250 μL de DFP a 300 μL de solución DDAB (fase oleosa) en un tubo de centrífuga graduado de plástico de 15 mL.
      NOTA: La pureza del DFP es del 60% (GC), densidad 1,6 g/mL (20 °C), el punto de ebullición es de 55 °C. La pureza de Dox es 98, 0-102, 0% (HPLC). La pureza de DDAB es ≥98% (TLC). La pureza del etanol es del 97%.
    3. Agregue suavemente 2,15 ml de agua desionizada sobre la fase oleosa, lo que da como resultado una mezcla bifásica de agua / aceite. Inyecte suavemente 10 μL de solución de Dox directamente en la fase oleosa inmediatamente antes de la insonación para evitar la partición de una cantidad significativa de Dox en la fase acuosa.
    4. Emulsionar la mezcla bifásica por insonación de sonda (con una micropunta cónica de titanio de 1/8 de pulgada) utilizando un equipo procesador de líquido ultrasónico de alta intensidad en modo de pulso (0,7 s encendido y 0,3 s apagado) a 20 kHz, 100 W durante 10 s. Diluya inmediatamente los MD recién preparados con agua desionizada ultrafiltrada (por ejemplo, MilliQ) por un factor de 1,8.
      NOTA: El factor de dilución es orientativo, elegido empíricamente. La solución de MDs se puede diluir más, siempre que se obtenga suficiente pellet de las centrifugaciones posteriores.
    5. Tome 1 mL de la suspensión obtenida y centrifugue 3 veces, resuspendiendo en agua ultrafiltrada y desionizada (por ejemplo, MilliQ) para eliminar el exceso de Dox y etanol. Realizar la primera centrifugación a 25 °C, 360 x g durante 3 min, y la segunda y tercera a 280 x g a la misma temperatura y tiempo.
    6. Después del último lavado, retirar el agua sobrenadante y extraer 5 μL de los pellets y dispersarlos en 2 mL del medio para el tratamiento celular, obteniendo una concentración equivalente de Dox de 10 nM. Los pasos del protocolo para la síntesis de Dox@DDAB-MDs se muestran en la Figura 1.
      NOTA: La concentración equivalente de Dox se define como la cantidad de Dox libre contenida en el mismo volumen de una suspensión de Dox@DDAB-MD.
  2. Caracterización de DDAB-MDs cargados con Dox
    1. Mida la distribución de tamaños utilizando un fotómetro de dispersión dinámica de luz (DLS) y analice los correlatos obtenidos con el algoritmo CONTIN para extrapolar los tiempos de decaimiento asociados. A continuación, utilice los tiempos de desintegración para determinar la distribución de los coeficientes de difusión de las partículas (D) y, conviértalos en una distribución de diámetros hidrodinámicos (2RH) utilizando la relación de Stokes-Einstein RH = kB T/ 6πηD, donde kBT es la energía térmica del sistema y η la viscosidad del solvente.
    2. Compruebe el tamaño y la distribución de tamaños también utilizando microscopía de campo claro con un software de análisis de imágenes (por ejemplo, Image J), midiendo el tamaño de al menos 100 gotas por fotograma (para 3 o 4 fotogramas), obteniendo un valor medio y una desviación estándar.
      NOTA: Para las mediciones de DLS, diluya la solución de MDs en agua ultrafiltrada y desionizada (por ejemplo, MilliQ), PBS y en medio de cultivo celular para evitar la retrodispersión a una concentración fija de 1,5 x 108 MDs /mL. Para el agua ultrafiltrada, desionizada y PBS en medio de cultivo celular, se obtuvieron valores de tamaño promedio de 1,1 ± 0,1 μm, 1,1 ± 0,25 μm y 1,2 ± 0,2 μm, respectivamente. Los MD recuperados de los pellets, después de la centrifugación, no muestran ningún cambio de tamaño dentro de los errores.
    3. Utilice un portaobjetos de la cámara de recuento de células para la microscopía y para evaluar la concentración de MD. La cámara está compuesta por dos áreas de conteo diferentes con un espesor de 0,10 mm. Coloque 10 μL de suspensión de MDs sobre la cámara. Cuente los MD dentro del cuadrado de 0,25 x 0,25 nm2 de la cámara utilizando un microscopio óptico con un objetivo de larga distancia de 40x y analícelo con un software gratuito de análisis de imágenes.
    4. Calcule la concentración de MDs, expresada como número de MDs/mL, de acuerdo con la ecuación:
      figure-protocol-1
    5. Compruebe las imágenes internalizadas de Dox por microscopio de barrido láser confocal (CLSM) aprovechando la autofluorescencia Dox a 590 nm. Mida el contenido de Dox utilizando un ensayo fluorimétrico, dispersando las partículas en agua ultrafiltrada, desionizada o PBS, centrifugarlas a 25 °C, 360 x g durante 3 min y luego determine la cantidad de fármaco libre evaluando la fluorescencia del sobrenadante a 590 nm con una curva de calibración (rango de linealidad para la concentración de Dox: 2-20 μmol/mL, R2 = 0,99).
      NOTA: Reste el valor obtenido de la concentración total de Dox para obtener la cantidad encapsulada de Dox. Realice el experimento por triplicado. La eficiencia de encapsulación de Dox da como resultado un 28% ± 2%, calculado dividiendo la cantidad de fármaco de Dox en los MD con el contenido total de Dox desplegado.
    6. Realizar experimentos de liberación de Dox a lo largo del tiempo, centrifugando y repitiendo el procedimiento según el paso 1.2.3 para obtener el porcentaje de Dox liberado en el sobrenadante sobre el número de encapsulados. Después de la primera determinación, repita el procedimiento disminuyendo la velocidad de centrifugación a 280 x g para evitar la rotura de los MD. Traza una curva de liberación a lo largo del tiempo. Comprobar que la concentración de Dox liberada en 24 h en el sobrenadante alcanza un máximo del 20%.
    7. Mida el potencial ζ a 37 °C utilizando un aparato específico (por ejemplo, NanoZetaSizer) y verifique que los valores obtenidos estén alrededor de 90-100 mV.

2. Fabricación de esferoides en sustratos no adhesivos micromoldeados

  1. Micromoldes de fundición
    1. Coloque pequeños moldes 3D y 1 g de polvo de agarosa pura en recipientes adecuados para la esterilización. Esterilizarlos en autoclave durante 30 min en un ciclo seco (121 °C).
    2. En un gabinete de bioseguridad, agregue 50 mL de solución salina (NaCl) al 0,9% al frasco de vidrio que contiene agarosa esterilizada y colóquelo en un horno de microondas para hervir y disolver el polvo. Deje enfriar la agarosa fundida a 60 °C y añada 500 μL a cada micromolde evitando la creación de burbujas durante el pipeteo.
      ADVERTENCIA: La agarosa fundida puede causar quemaduras graves en la piel. Se necesita equipo de protección personal adecuado.
    3. Retire la agarosa gelificada flexionando con cuidado el molde y retirando el sustrato recién formado. Coloque los sustratos en una placa de 12 pocillos y agregue 2 mL de medio de cultivo fresco por pocillo. Incube durante al menos 15 minutos para equilibrar cada sustrato.
      NOTA: Prepare el medio de cultivo con antelación y páselo por un filtro de 0,22 μm para eliminar posibles partículas o contaminantes.
  2. Siembra de las células
    1. Cultivo de células MDA-MB 231 con medio completo (DMEM suplementado con 1% de Pen/Strep, 10% FBS y 1% de L-Glu) en una incubadora de cultivo celular a 37 °C, 5% de CO2. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia en un matraz T75, deseche el medio, enjuague con 4 mL de DPBS y agregue 3 mL de tripsina/EDTA. Coloque el matraz en la incubadora y espere a que las células se desprendan. Inspeccione el desprendimiento bajo un microscopio invertido (a 20x) cada 5 min.
    2. Recoja las células separadas con 3 mL de DPBS con 10% de FBS en un tubo de 15 mL y centrifugue a 235 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante que contenga DPBS y tripsina/EDTA y vuelva a suspender el pellet de células en 3 mL de medio fresco. Pipetear 10 μL de suspensión celular con 10 μL de tripanoazul y contar las células con una cámara de Neubauer.
      NOTA: Al recolectar las células, neutralice la tripsina/EDTA con DPBS que contenga un 10% de FBS para evitar que la tripsina dañe las células durante el paso de centrifugación.
    3. Para obtener un diámetro nominal de esferoide de 50 μm (~15 células/esferoide), diluir la suspensión celular hasta una concentración final de 3.840 células/190 μL, lo que da como resultado 256 esferoides en el molde pequeño. Alternativamente, para un diámetro de esferoide de 200 μm (~1.000 células/esferoide) diluir hasta una concentración final de 81.000 células/190 μL, lo que da como resultado 81 esferoides en el molde grande, según las instrucciones del fabricante.
    4. Retire el medio de cultivo de la placa de 12 pocillos e incline los sustratos para eliminar con cuidado el medio de la cámara de siembra de células. Añadir 190 μL de suspensión celular a cada sustrato (gota a gota) y esperar a que las células se asienten durante 10 min en la incubadora de cultivo de tejidos.
    5. Agregue 2 mL del medio circundante por pocillo y vuelva a colocar el pocillo múltiple en la incubadora. Inspeccione la formación de esferoides cada 24 h. Reemplácelo con un medio nuevo cuando sea necesario.
  3. Recolección y procesamiento de esferoides
    1. Coloque una placa de Petri de 35 mm que contenga 2 ml de medio fresco en la incubadora para equilibrar durante 10-15 minutos.
    2. Retire el medio de cultivo celular que rodea el sustrato. Con una pinza estéril, retire el sustrato del pocillo e inviértalo en la placa de Petri. Golpee suavemente la parte inferior del sustrato para que los esferoides caigan por gravedad.
    3. Vuelva a colocar la placa de Petri que contiene los esferoides en la incubadora para su posterior procesamiento. Los pasos del protocolo para la fabricación de esferoides se muestran en la Figura 2.

3. Tratamiento con esferoides

  1. Retire el sobrenadante del molde y reemplácelo con 200 μL de dispersión de Dox@DDAB-MDs, preparado como se describe en el paso 1.1.6.
  2. Después de 5 minutos, agregue 2 mL/pocillo del medio circundante para equilibrar. Después del tiempo de tratamiento deseado, proceda según el paso 2.1.

4. Caracterización del tamaño y morfología de los esferoides

  1. Compruebe el tamaño del esferoide después del tiempo de incubación deseado con un objetivo 40x combinado con el software de procesamiento de imágenes del microscopio.
  2. Mida el tamaño de al menos 10 esferoides para recopilar suficientes datos para estadísticas adecuadas y analizar sus volúmenes, como se informa en el paso 7.

5. Ensayo de proliferación/viabilidad: microscopía de fluorescencia con tinción de células vivas

NOTA: Siga las instrucciones para la fabricación de esferoides hasta el paso 2.2.5.

  1. Retire el sobrenadante del molde y reemplácelo con 200 μL de 4 μM de calceína-AM en PBS e incube durante 3 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Durante los últimos 20 minutos de incubación, agregue 10 μg/mL de yoduro de propidio para teñir las células muertas.
  2. Coseche los esferoides invirtiendo el sustrato en la placa de Petri como se indica en el paso 2.3.2.
  3. Visualice los esferoides en una solución de tinción utilizando CLSM con objetivos de 40x/60x y un láser Ar+, ajustando la ganancia y el orificio de forma adecuada para obtener imágenes enfocadas.

6. Análisis y adquisición de imágenes

  1. Transmisión e imágenes confocales 2D
    1. Abra el software confocal (Archivo complementario A) y seleccione el objetivo (60x, 40x, etc.). En el panel derecho, haga clic en Trans para seleccionar el canal de transmisión.
    2. Haga clic en En vivo para visualizar la imagen y buscar el enfoque optimizado. Haga clic en Soltero para detener la adquisición.
    3. Para las imágenes confocales, haga clic en los canales láser rojo o verde según el tinte fluorescente utilizado. En la sección estenopeica, seleccione Apertura S en el menú desplegable y establezca la sección de ganancia en 6.00 B.
    4. Haga clic en Live y configure la apertura y la ganancia estenopeicas para optimizar el contraste. Haga clic en Soltero para detener la adquisición y guardar la imagen. Superponga la transmisión y la imagen confocal seleccionando el canal correcto en la barra de herramientas superior.
  2. Imágenes 3D confocales
    1. Haga clic en Z en el panel derecho (Archivo complementario B). Haga clic en el botón rojo para restablecer la configuración.
    2. Seleccione la sección Ref , haga clic en En vivo y busque el plano de la mediana dentro del objeto moviendo el foco. Seleccione la sección Superior y mueva el enfoque hacia arriba hasta que el objeto esté desenfocado y desaparezca.
    3. Repita el paso 6.2.2 para la sección inferior bajando el foco.
    4. Establezca el tamaño del paso en 0,75 μm. Haga clic en Pila Z y luego en Único para iniciar el escaneo. Guarde las imágenes en formato .ics.
  3. Imágenes ópticas y análisis
    1. Abra el software del microscopio óptico, capture la imagen con un enfoque largo de 40x o un objetivo de 20x presionando Reproducir en la barra de herramientas superior. Pulse Detener y guarde la imagen.
    2. En la barra de herramientas superior, haga clic en Ver, Control de análisis, Anotaciones y Mediciones , abriendo un panel con diferentes opciones (Archivo complementario C). En el panel Anotación y medidas , seleccione Semieje y haga clic en Elipse.
    3. En la búsqueda de imágenes, busque el eje que mejor se adapte a la forma del objeto y presione Enter en el teclado para transferir el valor obtenido en la tabla del panel derecho.
    4. Repita el paso 6.3.3 para al menos 10 objetos para obtener datos suficientes. Haga clic en Exportar a hoja de datos de Excel para exportar los datos y guardarlos.
  4. Visualización de imágenes 3D Z-Stack y cálculo numérico de volumen
    1. Abra la imagen 3D capturada con la microscopía confocal en el software del microscopio óptico (Archivo complementario D).
    2. Para ver la reconstrucción en 3D, haga clic en Mostrar vista de volumen en la barra de herramientas de la imagen; El objeto se puede girar en cualquier dirección haciendo clic con el botón izquierdo del ratón. Para seleccionar una parte del volumen, mantenga presionadas las teclas ctrl + botón izquierdo del mouse (Archivo complementario E).
    3. Presione el botón x en el teclado para tomar una instantánea de la imagen 3D y guardarla.
    4. Para calcular el volumen del objeto, haga clic en Medir, medidas de objetos 3D abriendo un panel (Archivo complementario, Imagen F). Haga clic en la barra de herramientas del panel Definir umbral 3D y establezca el umbral optimizado utilizando también los filtros suaves y limpios (Archivo complementario, Imagen G). Haga clic en Aceptar para obtener en el panel de medidas de objetos 3D diferentes parámetros, incluido el volumen.
    5. Haga clic en Exportar a Excel para exportar datos y guardarlos.

7. Análisis de datos de esferoides

  1. Para los cálculos de volumen de esferoides, se aproxima la estructura 3D con un elipsoide prolado, estimando el eje mayor y menor a través de la proyección 2D como se muestra en el inserto de la Figura 3.
  2. Valide la aproximación del elipsoide prolato a través de una comparación entre el volumen calculado numéricamente como se muestra en el paso 6.4 y la fórmula figure-protocol-2 del volumen del elipsoide prolato con b>a=c donde a, b y c son el eje del elipsoide).
  3. Calcule el volumen medio de al menos 10 esferoides y las respectivas desviaciones estándar. Si la distribución de volumen del esferoide es normal, aplique la prueba de Dixon para identificar y rechazar el valor atípico. A continuación, calcule la relación de volumen entre las muestras tratadas y las muestras junto con la propagación del error como se informa en la Figura 6A.

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Resultados

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Dox@DDAB-MD se desarrollaron de acuerdo con el protocolo (Sección 1) como se describe esquemáticamente en la Figura 1. Los MD obtenidos están hechos de una monocapa de DDAB que encapsula el núcleo DFP (Figura 1A). La carga catiónica del DDAB y el procedimiento de sonicación evitan la formación de capas multilaminares de DDAB apiladas en la interfaz DFP y agua23.

La micrografía CLSM (

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Discusión

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Para mejorar la eficacia de las antraciclinas como fármacos antitumorales, en este trabajo se presenta la formación de gotas de PFC con cáscara de DDAB que encapsulan el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina (Dox) y el efecto de dicha formulación interactuando con las células de cáncer de mama triple negativo de alta agresividad, MDA-MB-231.

Construcción de DOX@DDAB-MD
Los MD cargados con dox se han formulado por el método de insonación c...

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Divulgaciones

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Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Derechos humanos/animales: Este artículo no contiene ningún estudio con sujetos humanos o animales realizado por ninguno de los autores.

Agradecimientos

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Este trabajo ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención AMPHORA (766456).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
µ-Placa de PetriIbidi8115635mm de altura, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5,5-DecafluoropentanoSigma-Aldrich138495-42-8b.p. 55° C
Placa de cultivo de 12 pocillosCorning
tubo de centrífuga de 15 mlFalcon89039-664
Placas de Petri 3D 12:256Microtejidos (Sigma-Aldrich)Z764000-6EA
Placas de Petri 3D pequeñas 12:81Microtejidos (Sigma-Aldrich)Z764019-6EAIncubadora de cultivo grande
de 5%CO2, 37° CThermo ScienificHERAcell 150i
Tubo de centrífuga de 50 mlFalcon352070
Cabina de seguridad biológica, nivel
CalceinSigma-Aldrich
Calcein-AMSigma-Aldrich148504-34-1Solución madre de 4 mM en DMSO
cam sCMOS Andor Zyla 4.2Andor Instruments
Centrífuga Hettich Universal 320RHettich Lab. Tecnología
DAPI SIgma-Aldrich
Bromuro de dimetildioctadecilamonio en polvoSigma-Aldrich3700-67-2
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning15-013-CV
Clorhidrato de doxorrubicinaSigma-Aldrich25316-40-9
DPBS (PBS modificado de Dulbecco)Corning21-030-CVpH 7,4
Etanol 70%Sigma-Aldrich
EZ-C1 ecliplse digitalNikon InstrumentsSilver version 3.91
Suero fetal bovino (FBS)Corning35-079-CV
Goniómetro BI-200SMBrookhaven Instruments Corporations.
Láser Ar+ Spectra Physics
Láser He-NeMelles-Griot
L-GlutamminaCorning25-005-CI
Mcroscopio Nikon Eclipse TiNikon Instruments
MDA-MB 231 línea celularATCC
Microsoft ExcelLector
SparkTecan grupo
NanoZetaSizer ZSMalvern Instruments LTD
Cámara mejoradaNeubauer 718605
NIS Elements softwareNikon InstrumentsAR 4.30
Pen/StreptoCorning30-002-CI
Fotocorrelador BI-9000 ATBrookhaven Instruments Corporations62927-1
Fotómetro HC120Brookhaven Instruments CorporationsN° 1275
Pipettores y puntas, varios tamañosGilson
Yoduro de propidioSIgma-Aldrich
Pipetas serológicas, varios tamañosCorning
Láser de estado sólidoSuwtech LaserN° 22368
T25 FrascosSarstedt83.3910.002
Frascos T75Sarstedt83.3911.002
Tripsina/EDTA 0.05%EuroCloneECB3052D
Vibra-Cell VCX-400Sonics & Materiales, inc
Baño37° C
II de microplacas Microsoft de agua

Referencias

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