Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Resumen

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Resumen

La actina, el componente principal del citoesqueleto, desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la estructura y la función neuronales. Bajo estados fisiológicos, la actina se produce en equilibrio en sus dos formas: globular monomérica (G-actina) y filamentosa polimerizada (F-actina). En los terminales sinápticos, el citoesqueleto de actina forma la base para las funciones críticas pre y post-sinápticas. Además, los cambios dinámicos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre las formas globulares y filamentosas de actina) están estrechamente relacionados con las alteraciones relacionadas con la plasticidad en la estructura y función sináptica. Se presenta aquí una metodología basada en fluorescencia modificada para evaluar el estado de polimerización de la actina en condiciones ex vivo. El ensayo emplea faloidina marcada fluorescentemente, una fallotoxina que se une específicamente a los filamentos de actina (F-actina), proporcionando una medida directa de actina filamentosa polimerizada. Como prueba de principio, proporcionamos pruebas de la idoneidad del ensayo tanto en roedores como en homogeneados de tejido cerebral humano post mortem. Usando la latrunculina A (una droga que despolimeriza los filamentos de la actina), confirmamos la utilidad del análisis en alteraciones de la supervisión en niveles de la F-actina. Además, extendemos el ensayo a fracciones bioquímicas de terminales sinápticos aislados en los que confirmamos un aumento de la polimerización de actina tras la estimulación por despolarización con alto^K+extracelular.

Introducción

La actina de la proteína citoesquelérea está implicada en funciones celulares múltiples, incluyendo la ayuda estructural, el transporte celular, la movilidad y la división celulares. La actina se produce en equilibrio en dos formas: actina globular monomérica (G-actina) y actina filamentosa polimerizada (F-actina). Los cambios rápidos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre sus formas G y F) dan lugar a un rápido montaje y desmontaje de filamentos y subyacen a sus funciones reguladoras en la fisiología celular. La actina forma el componente principal de la estructura citoesquelética neuronal e influye en una amplia gama de funciones neuronal....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con las normas del Comité de Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Otago (Protocolo de Ética No. AUP95/18 y AUP80/17) y legislatura de Nueva Zelanda. Los tejidos cerebrales humanos se obtuvieron del Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco del Hospital Clínic-IDIBAPS de Barcelona, España. Todos los protocolos de recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Clínic de Barcelona y se obtuvo el consentimiento informado de las familias.

1. Preparación de tampones y reactivos

1. Prepare los siguient....

Resultados

Linealidad del ensayo para la evaluación de los niveles de F-actina
En primer lugar, se comprobó una curva estándar para el aumento lineal de la fluorescencia de Alexa Fluor 647 Phalloidin, que se repitió para cada conjunto de experimentos (Figura 1). Para investigar el rango lineal del ensayo, se procesaron diferentes cantidades de homogenados cerebrales de roedores(Figuras 2A y 2B)y sujetos humanos post mortem(Figur.......

Discusión

El ensayo aquí descrito, esencialmente adaptado de un estudio anterior³⁰ con modificaciones, emplea una fallotoxina, faloidina etiquetada con una etiqueta fluorescente. Los análogos fluorescentes de faloidina se consideran el estándar de oro para la tinción de filamentos de actina en tejidos fijos^47,48,49. De hecho, son las herramientas más antiguas para identificar específicamente los filamentos de actin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de policarbonato de pared gruesa abierto de 3,5 ml	Beckman Coulter	349622	para centrifugación en gradiente (preparación de sinaptosomas)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	Antígeno específico de F-actina
Anticuerpo contra   b-actina	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	Para la evaluación de los niveles totales de actina por inmunotransferencia
Anticuerpo contra GAPDH	Abcam	Ab181602	Para la evaluación de los niveles de GAPDH por inmunotransferencia
Bio-Rad Ensayo de proteínas Concentrado de reactivo de colorante Bio-Rad		5000006	Estimación de proteínas basada en Bradford
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Componente tampón Krebs
cOmplete, Mini, sin EDTA Cóctel de inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich 4693159001		Para la inhibición de la actividad endógena de la proteasa durante la preparación de muestras
Corning de 96 pocillos Poliestireno transparente de fondo plano	Corning	3596	Para mediciones de dispersión de luz
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	Componente tampón Krebs
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D5879	Disolvente para faloidina y latrunculina A
Escáner plano fluorescente (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences	Para la detección de señales inmunorreactivas
Solución de glutaraldehído (25% en agua) Grado II	Sigma-Aldrich	G6257	Fijador
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Ingrediente tampón para la preparación de muestras y componente tampón Krebs
Latrindulina A	Sigma-Aldrich	L5163	Despolimerizador de filamentos de actina
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2· 6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs componente tampón
Microplacas Filtro de
membrana Mitex 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparación de sinaptoneurosomas
Nunc F96 MicroWell Placa	Negra Thermo Fisher Scientific	237105	Para mediciones fluorométricas
Filtro de red de nylon 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparación de sinaptoneurosomas Cóctel de
inhibidores de fosfatasa IV	Abcam	ab201115	Para la inhibición de la actividad endógena de la fosfatasa durante la preparación de muestras
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs componente tampón y para la despolarización de terminales sinápticas
Fosfato de potasio monobásico ((KH2PO4 )	Sigma-Aldrich	P9791	Componente tampón Krebs
Borohidruro de sodio (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Componente del tampón de permeabilización
Cloruro de sodio (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944		Componente tampón Krebs
Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Componente tampón Krebs
SpectraMax i3x	Dispositivos		Para mediciones fluorométricas
Sacarosa	Fisher Chemical	S/8600/60	Ingrediente tampón para la preparación de muestras
Swimnex Portafiltros	Millipore	Sx0001300	Preparación de sinaptoneurosomas
Molinillo de tejidos 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	Para la homogeneización de tejidos
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Componente de tampón de permeabilización
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Ingrediente tampón para la preparación de muestras

en inmunoblots moleculares