Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

La actina de la proteína citoesquelérea está implicada en funciones celulares múltiples, incluyendo la ayuda estructural, el transporte celular, la movilidad y la división celulares. La actina se produce en equilibrio en dos formas: actina globular monomérica (G-actina) y actina filamentosa polimerizada (F-actina). Los cambios rápidos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre sus formas G y F) dan lugar a un rápido montaje y desmontaje de filamentos y subyacen a sus funciones reguladoras en la fisiología celular. La actina forma el componente principal de la estructura citoesquelética neuronal e influye en una amplia gama de funciones neuronales^1,2. Cabe destacar que el citoesqueleto de actina forma parte integral de la plataforma estructural de los terminales sinápticos. Como tal, es un determinante importante de la morfogénesis sináptica y la fisiología y juega un papel fundamental en el control del tamaño, número y morfología de las sinapsis^3,4,5. En particular, la polimerización-despolimerización dinámica de actina es un determinante clave de la remodelación sináptica asociada con la plasticidad sináptica subyacente a los procesos de memoria y aprendizaje. De hecho, tanto las funciones presinápticas (como la liberación de neurotransmisores^6,7,8,9,10)como las funciones postsinápticas (remodelación dinámica relacionada con la plasticidad^11,12,13,14)dependen críticamente de los cambios dinámicos en el estado de polimerización del citoesqueleto de actina.

En condiciones fisiológicas, los niveles de F-actina se regulan de forma dinámica y rigurosa a través de una vía multimodal que implica la modificación postraduccional^4,15,16, así como proteínas de unión a actina (ABP)^4,17. Los ABP pueden influir en la dinámica de la actina a múltiples niveles (como iniciar o inhibir la polimerización, inducir la ramificación de filamentos, cortar los filamentos a piezas más pequeñas, promover la despolimerización y proteger contra la despolimerización), y a su vez están bajo un estricto control modulador sensible a diversas señales extra e intracelulares^18,19,20. Tales controles regulatorios en múltiples niveles dictan una regulación estricta de la dinámica de la actina en el citoesqueleto sináptico, afinando los aspectos pre y postsinápticos de la fisiología neuronal tanto en los estados basales como inducidos por la actividad.

Dados los importantes papeles de la actina en la fisiología neuronal, no es sorprendente que varios estudios hayan proporcionado evidencia de alteraciones en la dinámica de la actina como eventos patógenos críticos relacionados con una amplia gama de trastornos neurológicos, incluyendo neurodegeneración, enfermedades psicológicas, así como dolencias del neurodesarrollo^{3,21,22,23, 24,25,26,27.} A pesar de la riqueza de datos de investigación que apuntan a los papeles clave de la actina en la fisiología neuronal y la fisiopatología, sin embargo, todavía quedan lagunas significativas en la comprensión de la dinámica de la actina, particularmente en el citoesqueleto sináptico. Se necesitan más estudios de investigación para tener una mejor comprensión de la actina neuronal y sus alteraciones en condiciones patológicas. Una de las principales áreas de interés en este contexto es la evaluación del estado de polimerización de la actina. Hay kits comerciales a base de western blotting (kit bioquímico de ensayo G-Actin/F-Actin in vivo; Citoesqueleto SKU BK037^28,29)y ensayos caseros para la evaluación de los niveles de F-actina^6. Sin embargo, debido a que estos requieren el aislamiento bioquímico de la F-actina y la G-actina y porque su cuantificación posterior se basa en protocolos de immunoblotting, pueden ser lentos. En este documento se presenta un ensayo basado en espectroscopia de fluorescencia adaptado de un estudio previo³⁰ con modificaciones que pueden ser utilizados para evaluar tanto los niveles basales de F-actina, así como los cambios dinámicos en su montaje-desmontaje. En particular, hemos modificado eficientemente el protocolo original que requiere muestras adecuadas para una cubeta de 1 mL al formato actual de placa de 96 pozos. Por lo tanto, el protocolo modificado ha reducido significativamente la cantidad de tejido/muestra necesaria para el ensayo. Además, proporcionamos evidencia de que el protocolo es adecuado no solo para homogeneados de tejido cerebral, sino también para fracciones subcelulares como terminales sinápticos aislados (sinaptosomas y sinaptoneurosomas). Por último, el ensayo se puede emplear para tejidos cerebrales de roedores recién disecados y muestras de cerebro humano post mortem almacenadas a largo plazo. Cabe destacar que, si bien el ensayo se presenta en un contexto neuronal, puede extenderse adecuadamente a otros tipos de células y procesos fisiológicos asociados con ellos.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con las normas del Comité de Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Otago (Protocolo de Ética No. AUP95/18 y AUP80/17) y legislatura de Nueva Zelanda. Los tejidos cerebrales humanos se obtuvieron del Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco del Hospital Clínic-IDIBAPS de Barcelona, España. Todos los protocolos de recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Clínic de Barcelona y se obtuvo el consentimiento informado de las familias.

1. Preparación de tampones y reactivos

1. Prepare los siguientes tampones para la homogeneización del tejido cerebral y la preparación de la fracción enriquecida de terminales sinápticos:
   Tampón de homogeneización: 5 mM HEPES, pH 7,4 suplementados con sacarosa de 0,32 M
   Tampón de resuspensión: 5 mM Tris, pH 7,4 suplementados con sacarosa de 0,32 M
   Tampón de lavado: 5 mM Tris, pH 8.1
   Sacarosa de 1,2 M
   sacarosa de 1,0 M
   sacarosa de 0,85 M
2. Agregue una mezcla casera o comercial de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.
   NOTA: Hemos utilizado la versión EDTA-libre de la mezcla completa del inhibidor de proteasa (1 tableta por el almacenador intermediario de 10 mL) y del cóctel iv del inhibidor de la fosfatasa (1:100; volumen: volumen).
3. Prepare los siguientes tampones y reactivos para la fijación, permeabilización y unión de faloidina:
   Tampón Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl_2,2 mM CaCl_2,0,1 mM KH₂PO_4,5 mM NaHCO_3,10 mM glucosa, 20 mM HEPES, pH 7,4
   KCl de 1 M
   25% glutaraldehído (solución común)
   Tampón Krebs que contiene 0,1 % Tritón X-100 y 1 mg/mL naBH₄
   400x Alexa Fluor 647 Faloidina en DMSO
   Tampón Krebs que contiene sacarosa de 0,32 M
   Latrunculina A de 50 μM en DMSO (solución común)
   1 M KCl (solución común)
   PRECAUCIÓN: La faloidina es tóxica (LD₅₀ = 2 mg/kg) y debe manipularse con cuidado. La inhalación de glutaraldehído es tóxica y debe manipularse en una campana extractora de humos.
4. Almacene los tampones a 4 °C y la faloidina y latrunculina A a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
   Nota : no se recomienda el almacenamiento a largo plazo de búferes. El protocolo se puede pausar aquí.

2. Homogeneización del tejido cerebral

1. Homogeneizar el tejido cerebral de rata criopreservado o recién diseccionado en 10 volúmenes de tampón de homogeneización en un tubo de vidrioPotter-Elvehjem y pestle en el hielo.
   NOTA: La homogeneización óptima se logra mediante 15-20 golpes del pestle a mano para los tejidos cerebrales. La homogeneización exitosa se puede confirmar por el flujo suave de la suspensión a través del tubo de vidrio. El protocolo se puede pausar aquí.
2. Determinar la concentración de proteínas en el homogeneato utilizando un ensayo de Bradford³¹.
   NOTA: También se pueden utilizar ensayos alternativos caseros o comerciales para la estimación de proteínas.
3. Diluir muestras de homogeneato en tampón Krebs a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL.
   NOTA: En algunos de nuestros experimentos, incubamos homogeneados con 2 μM de latrunculina A o DMSO (controles) a 37 °C durante 1 h. Para ello, los homogenados se resuspensan en 48 μL de tampón krebs, y se añaden 2 μL de latrunculina A de 50 μM o 2 μL de DMSO. Además para el inmunoblotting, se recoge una pequeña cantidad de muestra (10 μg) después de la incubación.
4. Fijar las muestras de homogeneato (sección 5).

3. Preparación de terminales nerviosas aisladas

1. Preparación de synaptosomes
   NOTA: También se pueden utilizar protocolos alternativos^32,33 para sinaptosomas.
   1. Centrífuga cerebro homogeneado a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C.
   2. Deseche el pellet, que es la fracción nuclear cruda.
   3. Centrífuga adicional el sobrenadante (S1) obtenido en el paso 3.1.1 a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   4. Retire el sobrenadante (S2), que es la fracción citosólica soluble.
   5. Resuspend el pellet (P2) obtenido en el paso 3.1.3, que es la fracción sinaptosomal cruda en tampón de resuspensión.
      NOTA: El volumen de tampón de resuspensión depende de la cantidad de tejido inicial y la cantidad de pellet obtenido. Por ejemplo, al comenzar con 150-300 mg de tejidos cerebrales, el pellet obtenido se puede resuspended en 200 μL de tampón de resuspensión.
   6. Cargue los sinaptosomas crudos resuspended sobre un gradiente discontinuo de sacarosa hecho de volúmenes iguales de 0.85-1.0-1.2 M sacarosa.
      NOTA: Normalmente usamos 1 mL cada una de la solución de sacarosa (para tejido de 150-300 mg). Esto se puede cambiar según cantidades más grandes del tejido. Los gradientes discontinuos se pueden hacer usando una jeringa 25G presionada contra la pared interna del tubo ultracentrífuga y capas suaves de las capas de sacarosa.
   7. Centrífuga a 85.000 x g durante 2 h a 4 °C.
      NOTA: Debido a la alta velocidad de centrifugación, se requiere una ultracentrífuga capaz de crear un vacío para reducir el calentamiento.
   8. Recoger la fracción sinaptosomal en la interfaz entre 1,0 y 1,2 M de sacarosa utilizando una punta de pipeta de 200 μL.
   9. Lave la fracción sinaptosomal con tampón de lavado helado por centrifugación a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
      NOTA: Para el lavado, la fracción sinaptosomal obtenida en la interfase de sacarosa de 1,0 y 1,2 M se recoge en un tubo fresco de 1,5 mL, y se añade un volumen igual de tampón de lavado, asegurando la eliminación de la sacarosa alta del medio.
   10. Lavar de nuevo el pellet sinaptosomal con tampón de homogeneización helada a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
   11. Resuspend los sinaptosomas en tampón de homogeneización sobre hielo.
       Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.
   12. Determine la concentración de proteínas mediante un ensayo de Bradford.
   13. Resuspend los sinaptosomas en el tampón de Krebs a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL (47,5 μL si los sinaptosomas deben ser despolarizados por KCl; ver sección 4).
       NOTA: Para la resuspensión, la fracción sinaptosomal se gira primero a 12.000 x g durante 5 min a 4 °C y se elimina el sobrenadante (tampón). El pellet sinaptosomal se resuspende en el tampón Krebs mediante un pipeteo suave utilizando una punta de pipeta de 200 μL.
   14. Proceder con la despolarización (sección 4).
2. Preparación de synaptoneurosomes
   NOTA: También se pueden utilizar protocolos alternativos^34,35 para sinaptoneurosomas.
   1. Pase el homogeneato cerebral a través de un filtro neto pre-humedeado de tamaño de poro de 100 μm en un portafiltros usando una jeringa de 1 mL.
      NOTA: La pre-humectación de todos los filtros es importante para evitar la pérdida de la muestra y debe hacerse utilizando un tampón de homogeneización. Para esto, el tampón de homogeneización se pasa a través de los filtros en el portafiltros utilizando una jeringa de 1 ml hasta que el tampón fluya hacia fuera.
   2. Recoja el filtrado (F1) en un tubo de 1,5 mL pre-refrigerado sobre hielo.
   3. Repetir el proceso (pasos 3.2.1 y 3.2.2) para la fracción F1 para obtener el segundo filtrado (F2).
   4. Pase el filtrado F2 a través de un filtro neto de 5 μm de tamaño de poro.
   5. Recoger el filtrado (F3) en un tubo pre-refrigerado de 1,5 mL sobre hielo.
   6. Filtrado de centrífuga F3 a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.
   7. Resuspend el pellet (sinaptoneurosomas) en tampón krebs sobre hielo a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL (47,5 μL si los sinaptosomas van a ser despolarizados por KCl; ver sección 4).
      Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.
   8. Estime la concentración de proteínas utilizando un ensayo de Bradford.
   9. Proceder con la despolarización (sección 4).

4. Despolarización mediada por KCl de terminales sinápticos aislados

1. Equilibrar sinaptosomas/sinaptoneurosomas a 37 °C durante 5-10 min.
2. Estimular los sinaptosomas/sinaptoneurosomas añadiendo KCl para aumentar^K+ extracelular a 50 mM durante 30 s a 37 °C y añadir el mismo volumen de tampón Krebs al respectivo conjunto de control no estimulado.
   NOTA: Por ejemplo, añadir 2,5 μL de 1 M KCl a los sinaptosomas resuspended en 47,5 μL de tampón Krebs; y añadir 2,5 μL de tampón Krebs al respectivo sinastosoma de control no estimulado. Para experimentos en los que un gran número de muestras están involucradas, proceda con no más de 2 muestras a la vez para que el tiempo de despolarización no exceda de 30 s.
3. Termine la estimulación agregando glutaraldehído (sección 5).

5. Fijación y tinción de faloidina de muestras

1. Añadir glutaraldehído a muestras homogenadas/sinaptosomales/sinaptoneurosomales a una concentración final de 2,5% durante 2-3 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Añadimos 6 μL de solución de glutaraldehído al 25% para que la concentración final de glutaraldehído en las muestras de 50 μL (homogenados/sinaptosomas/sinaptoneurosomas) fuera de aprox. 2,5%. La fijación es crítica y debe ser rápida y por lo tanto inmediatamente después de agregar glutaraldehído, la muestra debe ser vigorosamente vórtice.
2. Sedimentar las muestras a 20.000 x g durante 5 min.
3. Retire el sobrenadante.
   NOTA: Deseche el sobrenadante en una campana extractora de humos ya que el glutaraldehído es tóxico.
4. Permeabilizar el pellet por resuspensión en 100 μL de tampón Krebs que contiene 0,1% Tritón X-100 y 1 mg/mL de NaHB₄ durante 2-3 min a temperatura ambiente.
5. Sedimentar las muestras a 20.000 x g durante 5 min.
6. Retire el tampón de permeabilización.
7. Lavar el pellet con 200 μL de tampón Krebs por centrifugación a 20.000 x g durante 5 min.
8. Resuspend y manche el pellet con 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (correspondiente a 500 μU) en 100 μL de tampón Krebs durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
   NOTA: Otras variedades de análogos fluorescentes de faloidina están disponibles comercialmente y se pueden reemplazar para el ensayo. La concentración de faloidina y el volumen total de la muestra de incubación pueden tener que modificarse de acuerdo con la cantidad y el tipo de tejido/muestra que se está probando y las condiciones óptimas deben estandarizarse en consecuencia.
9. Centrifugar las muestras teñidas a 20.000 x g durante 5 min.
10. Retire la faloidina sin enlazar (sobrenadante).
11. Lavar la muestra con 200 μL de tampón Krebs por centrifugación a 20.000 x g durante 5 min.
12. Resuspend en 200 μL de tampón Krebs que contiene sacarosa de 0,32 M.
    Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.

6. Análisis fluorométrico y dispersión de luz

1. Dispense las muestras teñidas de faloidina Alexa Fluor 647 en una placa negra de 96 pozos.
2. Mida la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 645 nm y una longitud de onda de emisión de 670 nm en un lector de placas a temperatura ambiente.
3. Transfiera las muestras de la placa negra de 96 pozos a la placa transparente de 96 pozos utilizando puntas de pipeta de 200 μL.
4. Mida la dispersión de luz a 540 nm para corregir cualquier pérdida que pueda haber ocurrido durante los pasos anteriores de fijación, permeabilización y tinción.
   NOTA: Las variaciones en el material biológico retenido en las muestras teñidas podrían ser más prominentes para cantidades más pequeñas de material de partida (ver Discusión).
5. Incluya un conjunto de Alexa Fluor 647 Phalloidin en el tampón Krebs a diferentes concentraciones (0.05x, 0.1x, 0.25x, 0.35x, 0.75x, 0.5x y 1x correspondientes a 25, 50, 125, 175, 250, 375 y 500 μU) para cada lote del ensayo como una curva estándar.
   NOTA: Este es un paso opcional y no afecta a los resultados del ensayo, especialmente cuando los niveles de F-actina se expresan de manera relativa (Sección 7). El protocolo se puede pausar aquí.

7. Análisis de datos

1. La cantidad de F-actina en las muestras es directamente proporcional a la intensidad de fluorescencia de la faloidina unida. Expresar en términos absolutos de unidades de enlace de faloidina calculadas a partir de la curva lineal del estándar de faloidina marcado.
   NOTA: Como ejemplo, véanse las figuras 2A-B, 3A, 4A-B y la figura complementaria 2.
2. Exprese los niveles de F-actina como una fracción de las muestras de control.
   NOTA: Como ejemplo, consulte las figuras 5A-B.

Linealidad del ensayo para la evaluación de los niveles de F-actina
En primer lugar, se comprobó una curva estándar para el aumento lineal de la fluorescencia de Alexa Fluor 647 Phalloidin, que se repitió para cada conjunto de experimentos (Figura 1). Para investigar el rango lineal del ensayo, se procesaron diferentes cantidades de homogenados cerebrales de roedores(Figuras 2A y 2B)y sujetos humanos post mortem(Figuras 3A y 3B). Se encontró que el ensayo era lineal en el rango de 50-200 μg de proteína según lo evaluado por las cantidades de faloidina etiquetada retenidas. Se utilizó la dispersión de luz a 540 nm para confirmar las diferentes cantidades de muestras (Figura 2C y Figura 3C).

La latrunculina, un agente despolimerizante de actina reduce la unión de la faloidina etiquetada
La latrunculina A es conocida por despolimerizar los filamentos de actina y reducir los niveles de F-actina36,37,38,39. Los homogenados de roedores o tejidos cerebrales humanos se incubaron con latrunculina A de 2 μM durante 1 hora a 37 °C para despolimerizar los filamentos de actina. Los respectivos conjuntos de control no tratados se incubaron con DMSO durante la misma duración de 1 hora a 37 °C. El ensayo midió robustamente la pérdida de los niveles de F-actina de 95,7 ± 6,6 (media ± SEM) en muestras de control a 72,0 ± 3,2 (media ± SEM) μU de faloidina unida en muestras tratadas con latrunculina A en homogenados cerebrales de roedores(Figura 4A). También se observó una disminución similar (de 83,7 ± 3,9 a 66,9 ± 4,2 μU) en la retención de faloidina etiquetada cuando los homogeneados de los tejidos cerebrales humanos fueron sometidos al tratamiento con latrunculina A(Figura 4B). Cabe destacar que los niveles totales de actina, según lo evaluado por inmunoblotting, no se alteraron tras el tratamiento con latrunculina A tanto en ratas(Figura Suplementaria 1A-B)como en humanos(Figura Suplementaria 1C-D)homogeneados cerebrales.

La despolarización de terminales sinápticos aisladosestimula la polimerización de actina y la formación de filamentos
La despolarización ex vivo de terminales sinápticos aislados se ha mostrado para dar lugar al estímulo rápido de la polimerización6,30,40,y este fenómeno fue utilizado como otra confirmación del análisis divulgado adjunto. Las fracciones bioquímicas enriquecidas en terminales sinápticos fueron preparadas de dos diversas maneras; un método de ultracentrifugación basado en gradiente para obtener "sinaptosomas"41,42,43,44 y un protocolo secuencial basado en filtración para obtener "sinaptoneurosomas"43,45,46. Debido a que el rendimiento de este último es mayor, lo utilizamos para los tejidos cerebrales post mortem humanos en los que las cantidades de tejido a menudo son limitantes. Por otro lado, preferimos utilizar sinaptosomas con un mayor grado de enriquecimiento de fragmentos sinápticos41 para nuestros experimentos de tejido cerebral de rata.

La despolarización de synaptosomes o synaptoneurosomes y el estímulo de la polimerización de la actinia fueron alcanzados por una explosión corta (30 segundos) del aumento en K extracelular+ a 50 milímetros. La exposición al KCl dio lugar a un aumento de la unión a faloidina en casi un 40% en los sinaptosomas cerebrales de roedores en comparación con los respectivos controles simulados estimulados(Figura 5A;véase también la Figura suplementaria 2A). Un menor (alrededor del 20%) pero también se observó un aumento constante en los sinaptoneurosomas humanos tratados con KCl(Figura 5B;véase también la Figura Suplementaria 2A). Estos experimentos validan la robustez de nuestro ensayo en la determinación de alteraciones en los niveles de F-actina en muestras de tejido cerebral, incluyendo terminales sinápticos aislados.

Figura 1. Curva estándar para fluorescencia de Alexa Fluor 647 Phalloidin.  La linealidad de la emisión de fluorescencia de diferentes cantidades (25-500 μU) de faloidina etiquetada fue confirmada por espectroscopia de fluorescencia a una excitación de 645 nm y emisión de 670 nm(R2 = 0,9942). Los datos se representan como media ± SEM (n=3). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2. Linearidad del phalloidin que atasca a los homogenados de la entero-célula del tejido cerebral de la rata.  (A)Se evaluó la unión de faloidina a diferentes cantidades de homogenados (proteína de 50-300 μg). (B)La unión fue lineal en el rango de 50-200 μg de proteína(R2 = 0,9602). (C)Se utilizó la dispersión a 540 nm para confirmar diferentes cantidades de las muestras(R2 = 0,8319). Los datos se representan como media ± SEM (n=4). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3. Phalloidin que atasca a los homogenados de la entero-célula del tejido cerebral humano post mortem.  (A)Se evaluó la retención de faloidina en un rango de cantidades de homogenados (proteína de 50-300 μg). (B)Se encontró que la unión a faloidina era lineal en el rango de 50-200 μg de proteína(R2 = 0,8832). (C) La dispersión a 540 nm confirmó las cantidades variables de las muestras (R2 = 0,9730). Los datos se representan como media ± SEM (n=4). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4. Efectos de la latrunculina A sobre los niveles de F-actina.  El tratamiento de los homogenados cerebrales con el agente despolimerizante de actina Latrunculina A (2 μM, 1 h a 37°C) dio lugar a una disminución significativa de las cantidades de filamentos de actina en comparación con las respectivas muestras de control tratadas con simulación, evaluadas por la retención de faloidina etiquetada tanto en roedores (p = 0,0034; prueba tde Student de dos colas emparejada)(A)como en tejidos humanos post mortem (p = 0,0011; prueba tde Student de dos colas emparejada)(B). Los datos se representan como media ± SEM (n=6 pares). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5. Efectos de la despolarización KCl-mediada sobre cantidades de la F-actina en terminales sinápticos aislados.  (A)La incubación de sinaptosomas del cerebro de rata con 50 mM de KCl durante 30 s a 37 °C estimuló la polimerización de actina que, en consecuencia, dio lugar a un aumento en la unión a faloidina (p = 0,0014; prueba tde Student de dos colas emparejada). (B)También se observó un aumento menor en la fracción sinaptoneurosómica de los tejidos cerebrales humanos post mortem (p = 0,014; prueba tde Student de dos colas emparejada). Los datos se representan como media ± SEM (n=6 pares). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura suplementaria 1. Efectos de la latrunculina A sobre los niveles totales de actina.  Los homogenados cerebrales se incubaron con latrunculina A (2 μM, 1 h a 37°C) o volumen igual de DMSO (1 h a 37°C). Se recogieron 10 μg de proteína por muestra (controles tratados con latrunculina A y dmso simulados tratados) antes de la fijación. Los niveles totales de la actina fueron evaluados immunoblotting. Las manchas rubias representativas se muestran para los homogenados cerebrales de rata(A)y humanos(C). La latrunculina A no alteró los niveles totales de la actinia en rata(B;p = 0,40; t-prueba de estudiante de dos colas apareada) y humano(D;p = 0,42; homogenados apareados del cerebro de tde Student de dos colas). Los datos se representan como media ± SEM (n=3 pares). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2. Efectos de la despolarización KCl-mediada sobre niveles de la F-actina en synaptosomes de la rata y synaptoneurosomes humanos.  (A)La incubación de sinaptosomas del cerebro de rata con 50 mM de KCl (30 s a 37 °C) estimuló la polimerización de actina y un consiguiente aumento en la unión a faloidina (p = 0,0019; prueba tde Student de dos colas emparejada). (B)El aumento en la retención del phalloidin también fue observado en la fracción synaptoneurosomal humana despolarizada por KCl comparado a los controles sin estimular respectivos (p = 0,015; apareadode dos colas t de Student - prueba). Los datos se representan como media ± SEM (n=6 pares). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.