Aquí, presentamos un nuevo protocolo para estudiar y trazar la deposición apuntada de portadores de la droga a las células endoteliales en modelos humanos fabricados, de tamaño real, tridimensionales de la arteria bajo flujo fisiológico. El actual método puede servir como nueva plataforma para apuntar a portadores de la droga dentro del sistema vascular.
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Artículo de método
In Vitro 3D Cultivos Celulares Modelos Arteriales Para El Estudio De La Droga Vascular Dirigida Bajo Flujo
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Resumen
Resumen
El uso de modelos tridimensionales (3D) de arterias humanas, que están diseñados con las dimensiones y la anatomía correctas, permite el modelado adecuado de varios procesos importantes en el sistema cardiovascular. Recientemente, aunque varios estudios biológicos se han realizado usando tales modelos 3D de arterias humanas, no se han aplicado para estudiar la blanco vascular. Este papel presenta un nuevo método para fabricar los modelos arteriales humanos reales,reconstruidos usando una técnica de impresión 3D, para alinearlos con las células endoteliales humanas (ECs), y para estudiar la partícula que apunta bajo flujo fisiológico. Estos modelos tienen la ventaja de replicar el tamaño fisiológico y las condiciones de los vasos sanguíneos en el cuerpo humano utilizando componentes de bajo costo. Esta técnica puede servir como una nueva plataforma para estudiar y comprender la focalización de fármacos en el sistema cardiovascular y puede mejorar el diseño de nuevas nanomedicinas inyectables. Por otra parte, el actual acercamiento puede proporcionar las herramientas significativas para el estudio de la entrega apuntada de diversos agentes para las enfermedades cardiovasculares bajo flujo paciente-específico y condiciones fisiológicas.
Introducción
Recientemente se han aplicado varios enfoques utilizando modelos 3D de arterias humanas1,2,3,4,5. Estos modelos replican in vitrola anatomía fisiológica y el entorno de diferentes arterias del cuerpo humano. Sin embargo, se han utilizado principalmente en estudios de biología celular. Los estudios actuales sobre la focalización vascular de partículas al endotelio incluyen simulaciones computacionales in silico 6,7,8,modelos microfluídicos in vitro 9,10,11,y modelos animales in vivo 12. A pesar de los conocimientos que han proporcionado, estos modelos experimentales no han podido simular con precisión el proceso de focalización que se produce en las arterias humanas, en el que el flujo sanguíneo y la hemodinámica constituyen factores dominantes. Por ejemplo, el estudio de la focalización de partículas a regiones ateroscleróticas en la bifurcación de la arteria carótida, que son conocidas por su complejo patrón de flujo de recirculación y gradiente de tensión de cizalladura de la pared, puede afectar el viaje realizado por las partículas antes de que lleguen al endotelio13,14,15,16. Por lo tanto, estos estudios deben realizarse en condiciones que repliquen el entorno fisiológico, es decir,el tamaño, la dimensión, la anatomía y el perfil de flujo.
Recientemente, este grupo de investigación fabricó modelos arteriales humanos reconstruidos en 3D para estudiar la deposición y focalización de partículas a la vasculatura17. Los modelos se basaron en réplicas geométricas en 3D de los vasos sanguíneos humanos, que luego se cultivaron con CE humanas que posteriormente alinearon sus paredes internas. Además, cuando se someten a un sistema de perfusión que produce flujo fisiológico, los modelos replican con precisión las condiciones fisiológicas. El sistema de perfusión fue diseñado para perfundir fluidos a un caudal constante, utilizando una bomba peristáltica tanto en configuraciones de circuito cerrado como abierto (Figura 1). El sistema se puede utilizar como un circuito cerrado para mapear la deposición de partículas y la focalización a las células sembradas dentro del modelo carotídeo. Además, se puede utilizar como un circuito abierto para lavar las partículas no adherentes al final de los experimentos y para limpiar y mantener el sistema. Este papel presenta los protocolos para la fabricación de los modelos 3D de la bifurcación carótida humana, el diseño del sistema de la perfusión, y el trazado de la deposición de partículas apuntadas dentro de los modelos.
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Protocolo
NOTA: Este protocolo describe la fabricación de un modelo 3D de la arteria carótida y se puede aplicar para generar cualquier otra arteria de interés simplemente modificando los parámetros geométricos.
1. Diseño y fabricación de una bifurcación 3D del modelo de arteria carótida humana
- Elija imágenes de pacientes o geometrías previamente estudiadas de la bifurcación de la arteria carótida humana, y cree un modelo de diseño asistido por computadora del molde que necesita ser impreso.
NOTA: La bifurcación de la arteria carótida tiene una entrada y dos salidas. Es importante diseñar un marco de molde 3D alrededor de la arteria y soportes de impresión temporales entre el marco y el molde de la arteria (Figura 2A-C). - Imprima las geometrías con una impresora 3D. Corte los soportes de impresión temporales y use papel de lija para pulir y alisar los moldes, especialmente en las áreas donde se cortaron los soportes. Enjuague el modelo lijado con alcohol isopropílico para eliminar el polvo de plástico, y deje secar completamente en una campana química durante 2-3 h.
NOTA: Aquí, los moldes impresos fueron hechos de resina transparente v4 (Figura 2D, E). - Para disolver fácilmente el plástico, rocíe los moldes con laca transparente dentro de una campana química y deje secar al aire durante 1 h. Repita este 3x.
NOTA: Aquí, se utilizó 2X Ultra Cover Clear Spray, pero cualquier otro tipo debe ser adecuado siempre y cuando no sea laca de madera. Confirme que no queda plástico expuesto porque el plástico puede reaccionar con la silicona e impedir que se solidifique adecuadamente. La calidad de la superficie pulverizada determinará la calidad de la superficie del modelo final de silicona. - Corte las diapositivas /tiras rectangulares transparentes de plástico liso de las mismas dimensiones que el marco del molde, y péguelas usando la laca al marco en todos los lados y desde un lado del marco, de modo que se selle en la parte inferior y se abra en la parte superior. Aplique la laca utilizando un pincel dentro de una campana química, y deje que los portaobjetos se sequen completamente durante al menos 24 h (Figura 2F).
- Para preparar la mezcla de caucho de silicona, agregue silicona líquida con su agente de curado (relación de masa 1:10) en una placa de plástico y revuelva bien para garantizar una mezcla completa. Para el modelo carotídeo, añadir 54 g de la silicona y 6 g de su agente de curado.
- Enfriar la mezcla durante 15 min a 4 °C, luego desgasificarla en un desecador al vacío hasta que se hayan eliminado todas las burbujas de aire. Coloque el molde en el desecador (con el lado abierto hacia arriba), vierta lentamente la mezcla de silicona en el molde y vuelva a eliminar las burbujas de aire hasta que la mezcla esté clara.
- Deje reposar el molde con la silicona durante la noche a temperatura ambiente (si es posible, déjelo en el desecador sin vacío). Si la mezcla no se ha secado completamente, incubarlo a 60 °C durante unas horas más.
- Una vez que la mezcla esté completamente seca, retire los portaobjetos transparentes y sumerja el modelo en acetona absoluta durante 48 h en una campana química hasta que el plástico se disuelva por completo. Retire las sobras de plástico con un palo de madera. Para evaporar la acetona atrapada dentro del modelo, incubarla a 60 °C durante al menos 4 días antes de la siembra celular.
2. Cultivo celular y siembra en modelos
- Prepare tres conectores para el modelo carotídeo: uno para la entrada y dos para las salidas (consulte la Tabla de materiales). Esterilizar el modelo y los conectores por irradiación ultravioleta en una campana biológica durante 20 min.
- Cubra los modelos con 4 ml de fibronectina de 100 μg/mL (en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS)) durante 2 h a 37 °C o durante la noche a 4 °C. Inyecte la solución de fibronectina en el modelo a través de la entrada usando una jeringa de plástico de 5 o 10 ml. Retire la fibronectina a través de la salida y lave el modelo con medio EC.
- Suspender 2,5 × 106 células/ml de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs, paso < 6), y llenar el modelo con 4 mL de la suspensión celular utilizando una jeringa de plástico de 5 o 10 mL (Figura 3A). Coloque el modelo en un rotador dentro de una incubadora (37 °C) a una velocidad de 1 rpm durante 48 h para asegurar una siembra homogénea. Asegúrese de que el modelo esté bien conectado al rotador (Figura 3B). Cambie el medio después de 24 h dentro de una campana biológica, y vuelva al rotador dentro de la incubadora durante otras 24 h.
NOTA: Después de 24 h, las células se siembran y se pueden tomar imágenes con un microscopio. - Retire el modelo del rotador y lave con 1x PBS con una jeringa de plástico de 10 ml. Para fijar las células, incubar las células con 4 mL de paraformadehído al 4% (PFA) al modelo durante 15 min dentro de una campana química, y luego enjuague 3x con PBS. Añadir 4 mL de PBS, y almacenar a 4 °C hasta el experimento (Figura 3C). Manteje las células dentro del modelo utilizando protocolos de tinción estándar(por ejemplo, tinción nuclear con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Figura 3D).
3. Diseño del sistema de perfusión
- El sistema de perfusión tiene dos entradas y dos tubos de salida. Combine las dos entradas en un solo tubo id de 4 mm y de nuevo en dos tubos id de 6 mm, que se conectan a la bomba peristáltica. Combine los dos tubos ID de 6 mm que salen de la bomba peristáltica en un solo tubo de 4 mm y conéctelo a un amortiguador de oscilación para eliminar cualquier oscilación de la bomba. Use una botella de boca estrecha de 250 ml con una tapa de tres orificios como amortiguador.
- Conecte un orificio a la entrada de la bomba, cierre el segundo con un corcho que se utiliza para la ventilación a presión en emergencias y extienda el tercer orificio (que es la salida) hasta el fondo de la botella.
- Conecte el amortiguador a la entrada del modelo carotídeo cultivado utilizando el tubo de salida. Combine las dos salidas del modelo a una tubería, que será la salida del sistema (todas las tuberías son de 4 mm id).
- Divida el tubo de salida en dos tubos de salida (uno para el circuito cerrado y el otro para el contenedor de residuos en el circuito abierto). Coloque una abrazadera de plástico a cada tubo.
NOTA: La combinación de abrazaderas abiertas/cerradas determinará si el sistema está en una configuración de circuito cerrado o abierto. Como se muestra en la Figura 1,si las abrazaderas a y d están cerradas mientras que b y c están abiertas, el sistema es un circuito cerrado; el reverso lleva el sistema a la configuración de circuito abierto. - Preparar tres recipientes: uno que pueda contener 300 mL de fluido (para circuito cerrado) y otros dos de 1 L cada uno: uno para lavado y otro para residuos (para circuito abierto).
4. Configuración de circuito cerrado: experimento de perfusión e imágenes
- Agregue 300 mL de PBS al contenedor de circuito cerrado, lo que es suficiente para llenar todo el sistema, incluidos el tubo y el modelo. Coloque un tubo de entrada y un tubo de salida (abrazaderas abiertas b y c) dentro del contenedor.
- Llene el recipiente de lavado de 1 L con agua destilada (para lavar al final del experimento) y deje vacío el otro recipiente de residuos de 1 L. Coloque los demás tubos de entrada y salida (abrazaderas cerradas a y d) en los contenedores de lavado y residuos, respectivamente.
- Tome el modelo carótida cultivada celular fija de almacenamiento de 4 °C y vacíe el PBS. Conecte la entrada y las salidas de la carótida como se describe en los pasos 3.3-3.4. No deje el modelo seco durante mucho tiempo. Una vez que el modelo está conectado, active la bomba para perfundir el fluido.
- Coloque el modelo carotídeo bajo el microscopio. Abra el tubo antes de la entrada y después de la salida del modelo carotídeo. Configure la bomba peristáltica a 10 rpm y enciémosla. Aumentar la velocidad en incrementos de 5 rpm, cada 4-5 min. Asegúrese de que no haya fugas.
- A 100 rpm, que equivale a la velocidad de flujo máxima de la forma de onda fisiológica de la arteria carótida humana (~ 400 mL / min), agregue partículas fluorescentes de poliestireno carboxilado (PS) (2 μm, a una concentración de 1,6 μg / mL) a los 300 mL de PBS en el contenedor de circuito cerrado. Imagen de la región de interés cada 10 s durante 1,5 h (imágenes individuales fijas o vídeo según sea necesario).
5. Configuración de circuito abierto: el paso de lavado
- Abra las abrazaderas de los tubos de lavado y desecho en los contenedores de 1 L (abrazaderas a y d), y cierre inmediatamente las abrazaderas de los tubos de entrada y salida en el contenedor de 300 mL (abrazaderas b y c) para cambiar el sistema de una configuración de circuito cerrado a abierto.
- Deje que la mayor parte del agua fluya desde el contenedor de lavado hasta el contenedor de residuos a 100 rpm. Antes de que se transfiera por completo, presione la parada en la bomba peristáltica y cierre las abrazaderas del tubo antes de la entrada y después de la salida del modelo carotídeo.
- Utilizando los filtros apropiados, capture imágenes del modelo en la región de interés para mostrar la deposición y adhesión de partículas a las celdas. Desconecte el modelo carotídeo. Agregue cuidadosa y lentamente 4 ml de PBS con una jeringa de 10 ml a través de la entrada del modelo.
- Conecte un "modelo ficticio", (que también es un modelo carotídeo 3D de caucho de silicona utilizado solo para el lavado, sin células cultivadas) en lugar del modelo carotídeo, y enjuague el sistema. Agregue otra 1 L de agua y lave el sistema de nuevo hasta que toda el agua se transfiera del recipiente de lavado a los residuos. Apague la bomba peristáltica.
6. Adquisición y análisis de datos
- Adquirir una película digital de deposición de partículas en la región de interés con las imágenes tomadas durante el experimento, utilizando un código de software personalizado (ver la Tabla de Materiales).
- Para el mapeo de la deposición de las partículas a lo largo del modelo, mosaico múltiples imágenes para cubrir la región de interés examinada (Figura 4A, B).
NOTA: Se puede escribir un código de software personalizado para cuantificar el número de partículas adheridas en un sitio de interés (se ha proporcionado un archivo de muestra como información complementaria)17.
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Resultados
Este papel presenta un nuevo protocolo para trazar la deposición de partículas dentro de los modelos humanos de tamaño real de la arteria humana, que pueden proporcionar una nueva plataforma para la investigación de la entrega de la droga. Utilizando una técnica de impresión 3D, se fabricó un modelo de la arteria de bifurcación carótida humana (Figura 2). El modelo estaba hecho de caucho de silicona y sembrado con CE humanas(Figura 3). Es importante destacar que...
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Discusión
Los enfoques actuales para estudiar la focalización vascular de las partículas se quedan cortos en la replicación de las condiciones fisiológicas presentes en el cuerpo humano. Aquí se presenta un protocolo para fabricar modelos reconstruidos en 3D de arterias humanas para estudiar la orientación de partículas a los CE que recubren la arteria bajo flujo fisiológico aplicado utilizando un sistema de perfusión personalizado. Al elegir el material para la impresión 3D, lo mejor es utilizar un plástico transparente para evit...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Israel Science Foundation (subvención ISF # 902/18). La beca de Maria Khoury fue apoyada por el Programa de Doctorado de Mujeres baronesa Ariane de Rothschild.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Impresora 3D | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetona, absoluta (grado AR) | |||
| Conectores | Nordson Medical | FTLL013-1 | Hembra Luer |
| FTLL230-1 | Luer | ||
| FTLL360-1 | Luer | ||
| LP4-1 | Macho Luer Cerradura Integral | ||
| Amortiguador | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Policarbonato, Validación Tapa |
| amortiguador | de botella Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Tapones de llenado/ventilación |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | El reticulante |
| Medios | de células endotelialesScienCell | 1001 | |
| Fibrontecttina | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Alcohol isopropílico, grado AR 99.5% | Eliminar el polvo de plástico del modelo lijado | ||
| Laca | Rust-Oleum | 2X-Ultra cubierta Brillo Transparente | |
| Matlab | Mathworks | ||
| Microscopio | https://www.mathworks.com/products/matlab.html Nikon | SMZ25 | |
| Cámara Microscópica | Nikon | DS-Qi2 | |
| Bomba peristáltica | Watson Marlow | 530U IP31 | Con 2 cabezales de bomba: 313D |
| Abrazadera de tubo de plástico | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs Partículas de | |
| poliestireno | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diámetro = 2 µ m |
| Resina para impresora | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systè mes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubo | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubo para la bomba: 6,4 mm ID |
| Todos los demás tubos: Tubo de silicona: 4 mm ID |
Referencias
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