Aquí presentamos un sistema de transformación eficiente y estable para el análisis funcional del gen CcCIPK14 como ejemplo, proporcionando una base técnica para estudiar el metabolismo de plantas no modelo.
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Artículo de método
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Aquí presentamos un sistema de transformación eficiente y estable para el análisis funcional del gen CcCIPK14 como ejemplo, proporcionando una base técnica para estudiar el metabolismo de plantas no modelo.
Un sistema de transformación eficiente y estable es fundamental para el estudio de la función génica y la mejora molecular de las plantas. Aquí, describimos el uso de un sistema de transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes en gandul. El tallo está infectado con A. rhizogenes portador de un vector binario, que induce callo a los 7 días y raíces adventicias a los 14 días. La raíz pilosa transgénica generada se identificó mediante análisis morfológico y un gen reportero de GFP. Para ilustrar aún más el rango de aplicación de este sistema, CcCIPK14 (proteínas quinasas que interactúan con proteínas similares a la calcineurina B) se transformó en gandul utilizando este método de transformación. Las plantas transgénicas fueron tratadas con ácido jasmónico (JA) y ácido abscísico (ABA), respectivamente, con el fin de probar si CcCIPK14 responde a esas hormonas. Los resultados demostraron que (1) las hormonas exógenas podrían aumentar significativamente el nivelde expresión de CcCIPK14, especialmente en plantas con sobreexpresión (OE) de CcCIPK14 ; (2) el contenido de genisteína en las líneas CcCIPK14-OE fue significativamente mayor que el control; (3) el nivel de expresión de dos genes de flavonoide sintasa clave aguas abajo, CcHIDH1 y CcHIDH2, se reguló al alza en las líneas CcCIPK14-OE; y (4) el sistema transgénico de la raíz pilosa se puede utilizar para estudiar genes metabólicamente funcionales en plantas no modelo.
La transformación es una herramienta básica para evaluar la expresión de genes exógenos 1,2. Muchos aspectos biológicos de las plantas de recursos son comunes a todas las plantas; por lo tanto, se pueden realizar estudios funcionales de ciertos genes en plantas modelo (como Arabidopsis)3. Sin embargo, muchos genes de las plantas son únicos en sus patrones de función y expresión, lo que requiere estudios en especies propias o estrechamente relacionadas, especialmente en el caso de las plantas de recursos 3,4
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NOTA: El gandul es un cultivo de leguminosas diploide que pertenece a la familia Fabaceae. Las semillas de gandul utilizadas en este experimento son de la Universidad Forestal del Noreste de China y están codificadas como 87119. Los pasos principales de este protocolo se ilustran en la Figura 1A. La incubación de las plántulas se realizó en un ambiente de alta humedad a 25 °C bajo luces fluorescentes a 50 μmol de fotones por m-2 s-1 en un fotoperiodo de 16 h. Las cepas de A. rhizogenes K599 (NCPPB2659) se conservaron en el laboratorio. Se almacenaron en medio manito....
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Transformación de la raíz pilosa mediada por A. rhizogenes en el gandul
Este estudio describió los protocolos paso a paso para la transformación genética de raíces pilosas mediadas por A. rhizogenes, que tiene importancia en el campo de las moléculas vegetales. Se necesitaron unas 5 semanas para obtener raíces pilosas de las raíces de un gandul infectado por A. rhizogenes. La Figura 1A muestra una visión genera.......
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La caracterización rápida de la función génica es el objetivo común en el estudio de la mayoría de las especies, y es particularmente importante para el desarrollo de las plantas de recursos. La transformación mediada por A. rizogenes ha sido ampliamente utilizada en el cultivo de raíces pilosas. El cultivo de raíces pilosas (HRC), como fuente única de producción de metabolitos, desempeña un papel fundamental en la ingeniería metabólica18,28
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contrapuestas que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.
Los autores agradecen el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31800509, 31922058), el Fondo de Jóvenes Talentos Sobresalientes de la Universidad Forestal de Beijing (2019JQ03009), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (2021ZY16), la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (6212023) y el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) y el Centro de Innovación Avanzada de Beijing para el Mejoramiento de Árboles por Diseño Molecular. Deseo agradecer a Zhengyang Hou por su orientación en la redacción del a....
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de 8 tiras qPCR de 0,1 mL (con tapas ópticas) | KIRGEN, Shanghái, China | KJ2541 | |
| ABA | Solarbio Life Science, Pekín, China | A8060 | |
| Polvo de agar | Solarbio Life Science, Pekín, China | Centrífuga A8190 | |
| Osterode am Harz, Alemania | d37520 | ||
| CFX Connect TW Módulo óptico | Bio-rad, EE. UU. | 1855200 | |
| incubadora de temperatura constante | Shanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai, China | BPX-82 | |
| Placa de Petri desechable | Corning, EE. UU. | ||
| Baño seco | Gingko Bioscience Company/Coyote bioscience, China | H2H3-100C | |
| Eastep Total RNA Kit de Extracción 50 | Promega, Pekín, China | LS1030 | |
| Balanza electrónica | Tianjin, China | TD50020 | |
| Filtro pape | Hangzhou wohua Papel de filtro Co., Ltd, China | ||
| FiveEasy Plus | Mettler Toledo, Shanghai, China | 30254105 | |
| Maceta 9 * 9 | China | ||
| JA | Solarbio Ciencias de la vida, Pekín, China | J8070 | |
| Kan | Solarbio Ciencias de la vida, Pekín, China | K8020 | |
| MagicSYBR Mezcla | CWBIO, Pekín, China | ||
| Mini Microcentrífuga | Scilogex, Pekín, China | S1010E | |
| NaCl | Solarbio Ciencias de la Vida, Pekín, China | S8210 | |
| NanPhotometer N50 Touch | IMPLEN GMBH, Alemania | T51082 | |
| Purelab untra | |||
| Rifampicin | Solarbio Ciencias de la Vida, Pekín, China | R8010 | |
| Caja de plántulas 30 * 200 | China | ||
| Thermal Ciclador PCR | Bio-rad, EE. UU. | T100 | |
| Oscilador termostático | Beijing donglian Har lnstrument Manufacture Co., Ltd, China | DLHE-Q200 | |
| Tomy Autoclave | Tomy, Japón | SX-500 | |
| Triptona | Solarbio Ciencias de la Vida, Pekín, China | LP0042 | |
| UEIris II Sistema RT-PCR para la síntesis de ADNc de primera cadena (con dsDNasa) | EE. UU. Everbright INC, Jiangsu, China | R2028 | |
| Extracto de levadura en polvo | Solarbio Life Science, Pekín, China | LP0021 |
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