Este manuscrito describe un protocolo detallado para producir matrices de microtejidos 3D del músculo esquelético humano y ensayos de función in situ mínimamente invasivos aguas abajo, incluidos análisis de fuerza contráctil y manejo de calcio.
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Artículo de método
Evaluación de las métricas funcionales de la salud del músculo esquelético en microtejidos del músculo esquelético humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos tridimensionales (3D) in vitro del músculo esquelético son un avance valioso en la investigación biomédica, ya que brindan la oportunidad de estudiar la reforma y la función del músculo esquelético en un formato escalable que es susceptible de manipulaciones experimentales. Los sistemas de cultivo muscular 3D son deseables, ya que permiten a los científicos estudiar el músculo esquelético ex vivo en el contexto de las células humanas. Los modelos 3D in vitro imitan de cerca aspectos de la estructura del tejido nativo del músculo esquelético adulto. Sin embargo, su aplicación universal está limitada por la disponibilidad de plataformas que son fáciles de fabricar, costosas y fáciles de usar, y producen cantidades relativamente altas de tejidos musculares esqueléticos humanos. Además, dado que el músculo esquelético desempeña un papel funcional importante que se ve afectado con el tiempo en muchos estados de enfermedad, una plataforma experimental para estudios de microtejidos es más práctica cuando las mediciones mínimamente invasivas de la fuerza transitoria y contráctil del calcio se pueden realizar directamente dentro de la propia plataforma. En este protocolo, se describe la fabricación de una plataforma de 96 pocillos conocida como 'MyoTACTIC', y la producción en masa de microtisones musculares esqueléticos humanos (hMMTs) en 3D. Además, se informan los métodos para una aplicación mínimamente invasiva de estimulación eléctrica que permite mediciones repetidas de la fuerza del músculo esquelético y el manejo del calcio de cada microtejido a lo largo del tiempo.
Introducción
El músculo esquelético es uno de los tejidos más abundantes en el cuerpo humano y apoya funciones clave del cuerpo como la locomoción, la homeostasis por calor y el metabolismo1. Históricamente, los modelos animales y los sistemas de cultivo celular bidimensional (2D) se han utilizado para estudiar procesos biológicos y patogénesis de enfermedades, así como para probar compuestos farmacológicos en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético2,3. Si bien los modelos animales han mejorado en gran medida nuestro conocimiento del músculo esquelético en la salud y en la enfermedad,....
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Protocolo
1. Fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS
NOTA: La fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS requiere un molde negativo de PU, que se puede fabricar como se describió anteriormente30. El archivo solidWorks de diseño asistido por ordenador (CAD) para el diseño de placas MyoTACTIC se ha puesto a disposición en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Prepare ~ 110 g de solución de polímero PDMS en un vaso de plástico desechable en una proporción de 1:15 de monómero a agente de curado utilizando los componentes del kit de elastómero de silicona. Revuelva la solución de polímero dur....
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Resultados
Aquí se describen métodos para fundir una plataforma de cultivo MyoTACTIC basada en PDMS de 96 pocillos desde un molde de PU, fabricar matrices de tejidos de réplica de hMMT y analizar dos aspectos de la función de hMMT dentro de la generación de fuerza del dispositivo de cultivo y el manejo de calcio. La Figura 1 ofrece una visión general esquemática de la preparación de los pocillos de cultivo MyoTACTIC antes de la siembra de hMMT. PDMS es un polímero a base de silicona ampliamente utiliza.......
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Discusión
Este manuscrito describe métodos para fabricar y analizar un modelo de cultivo 3D hMMT que se puede aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La plataforma MyoTACTIC es rentable, fácil de fabricar y requiere un número relativamente pequeño de células para producir microtejidos musculares esqueléticos. Los hMMT formados dentro de la plataforma de cultivo MyoTACTIC están compuestos por miotubos alineados, multinucleados y estriados, y responden a los es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli y Sadegh Davoudi por contribuir a la invención de la plataforma de cultivo MyoTACTIC y establecer los métodos de fabricación y análisis descritos en este documento. HL recibió fondos de un Programa de Capacitación del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) en Una Beca de Ingeniería y Emprendimiento Organ-on-a-Chip y una beca de posgrado Wildcat de la Universidad de Toronto. PMG es la Cátedra de Investigación de Canadá en Reparación Endógena y recibió apoyo para este estudio del Instituto de Medicina Regenerativa de Ontario, la Red de Células Madre y de Medicine....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina al 0,9%, estéril | de la marca | de la casa 1010 | 10 mL alícuotas de la solución se fabrican y almacenan a 4 grados; C |
| 25G Needle | BD, Medstore, Universidad de Toronto | 2548-CABD305127 | |
| Ácido 6-Aminocaproico, ≥ 99% (valoración), Polvo | Sigma - Aldrich | A2504-100G | Se genera una solución madre de 50 mg / mL disolviendo 5 mg de polvo de ácido 6-aminocaproico en 100 mL de agua destilada esterilizada en autoclave. La solución se filtra al vacío y se almacenan alícuotas de 10 mL a 4° C |
| 6,35 mm Tubo de diámetro interior | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Línea celular de mioblastos | Institut de Myologie (París, Francia) | ||
| Generador de forma de onda arbitraria | Rigol | DG1022Z | |
| Extracto de membrana basal (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Almacenado como alícuotas de 50 µ L o 100 y micro; L a -80 grados; |
| C Cámara de vacío de sobremesa | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC a cable de clip | Aligator pedido a Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Incluye placas de cultivo, pipetas serológicas, etc | |
| Dimetilsulfóxido Sigma | - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Polvo, Sin Calcio, Sin Magnesio | Thermo Fisher Scientific | ||
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | Este es un DMEM con alto contenido de glucosa con L-glutamina y piruvato de sodio |
| Suero fetal bovino | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinógeno de Plasma Bovino Sigma | - Aldrich | F8630-5G | Se fabrican alícuotas que van desde 7 a 10 mg de polvo de fibrinógeno y se almacenan a -20 grados; C |
| Filtropur Filtro de jeringa, 0.22um Tamaño de poro | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Suero de caballo | Gibco | 16050-122 | |
| Insulina Recombinante Humana | Sigma - Aldrich | 91077C | La solución madre es 100X y se elabora disolviendo 1 mg de insulina recombinante humana en 1 mL de DMEM y 1 µ L de NaOH 10N. La solución se filtra y se almacena como alícuotas de 1 mL a 4° |
| C Software de adquisición de imágenes | Olympus | cellSens Dimension | |
| Software de procesamiento de imágenes | Institutos Nacionales de Salud | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Microscopio Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscopio Olympus | IX83 | ||
| - Montaje de cámara | Labcam | Labcam para iPhone | Pedido en Amazon |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Jeringas Desechables de Plástico, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Jeringas Desechables de Plástico, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Polvo, BioReactivo | Sigma - Aldrich | P2443-250G | Una solución madre al 5% de ácido plurónico se elabora disolviendo 5 g de ácido plurónico en polvo en 100 ml de agua destilada enfriada y esterilizada en autoclave. La solución se filtra al vacío y se almacenan alícuotas de 10 mL a 4° C |
| Polidimetilsiloxano (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Los | de 4019862 | también están disponibles en Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Molde negativo de poliuretano | Agente | ||
| Mann Release Technologies | 200 | ||
| Bomba de vacío de paletas rotativas | Edwards | ||
| Bisturí | Almedic, Medstore, Universidad de Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Hoja de afeitar de un solo filo | VWR | 55411-050 | |
| Célula muscular esquelética basal Se | Promocell | C-23260 | de 30 mL y se almacenan a 4°C. |
| Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas (listo para usar) | Promocell | C-23060 | Las alícuotas de 42 mL se generan y almacenan a 4 °C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Bolsa de esterilización | Alliance | 211-SCM2 | |
| Dedal | Igege | Pedido a | |
| Amazon Trombina de plasma humano | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | Se disuelven 100 unidades de trombina en 1 ml de una solución de BSA al 0,1%. 10 y micro; Las alícuotas L se preparan y almacenan a - 20°C. |
| Alambre de cobre recubierto de estaño | Arco | B8871K48 | pedido a Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0,4 % | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0,25 % | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referencias
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular....
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Reimpresiones y permisos
