Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Samantha Ing-Esteves; Julie L. Lefebvre

doi:10.3791/62308

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Artículo de método

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

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DOI:

10.3791/62308

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19 de marzo de 2021

Samantha Ing-Esteves¹^,² , Julie L. Lefebvre¹^,²

¹Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, ²Department of Molecular Genetics, University of Toronto

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Resumen

Descubrir los mecanismos que modelan los cenadores dendríticos requiere métodos para visualizar, visualizar y analizar las dendritas durante el desarrollo. La retina de ratón es un potente sistema modelo para la investigación de mecanismos específicos del tipo celular de morfogénesis neuronal y conectividad. La organización y composición de los subtipos de retina están bien definidas, y las herramientas genéticas están disponibles para acceder a tipos específicos durante el desarrollo. Muchos tipos de células de la retina también restringen sus dendritas y / o axones a capas estrechas, lo que facilita las imágenes de lapso de tiempo. Los cultivos de explantes de retina de ratón son adecuados para la obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal o multifotónica, pero faltan métodos optimizados para la dinámica de las dendritas de imágenes con resolución temporal y estructural. Aquí se presenta un método para etiquetar e visualizar escasamente el desarrollo de poblaciones específicas de retina marcadas por el sistema Cre-Lox. Los virus adenoasociados (AVA) disponibles comercialmente utilizados aquí expresaron proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre. La administración intraocular de AAV en ratones neonatales produce un marcado fluorescente de tipos de células objetivo a los 4-5 días después de la inyección (dpi). Las señales fluorescentes de membrana son detectables por imágenes confocales y resuelven estructuras y dinámicas de ramas finas. Los videos de alta calidad que abarcan de 2 a 4 h se adquieren a partir de imágenes de montajes planos de retina perfundidos con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (aCSF). También se proporciona una tubería de postprocesamiento de imágenes para la deconvolución y la corrección de deriva tridimensional (3D). Este protocolo se puede utilizar para capturar varios comportamientos celulares en la retina intacta y para identificar nuevos factores que controlan la morfogénesis de la neurita. Muchas estrategias de desarrollo aprendidas en la retina serán relevantes para comprender la formación de circuitos neuronales en otras partes del sistema nervioso central.

Introducción

Las dendritas de las neuronas de la retina forman patrones intrincados, pero específicos, que influyen en su función dentro de los circuitos neuronales. En la retina de los vertebrados, diversos tipos de células ganglionares retinianas (RGC) e interneuronas de células amacrinas tienen morfologías dendríticas únicas que difieren en tamaño del cenador, ubicación, longitud de la rama y ^densidad1. Durante el desarrollo postnatal, las RGC y las células amacrinas extienden procesos dendríticos exuberantes en un neuropil llamado capa plexiforme interna (IPL), donde reciben entradas de células bipolares que transmiten señales fotorreceptoras2.