Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

Resumen

Las células madre del glioma (GSC) son una pequeña fracción de las células cancerosas que desempeñan un papel esencial en la iniciación del tumor, la angiogénesis y la resistencia a los medicamentos en el glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más prevalente y devastador. La presencia de GSC hace que el GBM sea muy refractario a la mayoría de los agentes dirigidos individuales, por lo que se requieren métodos de detección de alto rendimiento para identificar posibles terapias combinadas efectivas. El protocolo describe un flujo de trabajo simple para permitir la detección rápida de posibles terapias combinadas con interacción sinérgica. Los pasos generales de este flujo de trabajo consisten en establecer GSC marcadas con luciferasa, preparar placas recubiertas de matrigel, detección de medicamentos combinados, analizar y validar los resultados.

Resumen

Las células madre del glioma (GSC) son una pequeña fracción de las células cancerosas que desempeñan un papel esencial en la iniciación del tumor, la angiogénesis y la resistencia a los medicamentos en el glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más prevalente y devastador. La presencia de GSC hace que el GBM sea muy refractario a la mayoría de los agentes dirigidos individuales, por lo que se requieren métodos de detección de alto rendimiento para identificar posibles terapias combinadas efectivas. El protocolo describe un flujo de trabajo simple para permitir la detección rápida de posibles terapias combinadas con interacción sinérgica. Los pasos generales de este flujo de trabajo consisten en establecer GSC marcadas con luciferasa, preparar placas recubiertas de matrigel, detección de medicamentos combinados, analizar y validar los resultados.

Introducción

El glioblastoma (GBM) es el tipo más común y agresivo de tumor cerebral primario. Actualmente, la supervivencia general de los pacientes con GBM que recibieron tratamiento máximo (una combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia) sigue siendo inferior a 15 meses; por lo que se necesitan urgentemente terapias novedosas y efectivas para la GBM.

La presencia de células madre de glioma (GSC) en GBM constituye un desafío considerable para el tratamiento convencional, ya que estas células madre desempeñan un papel de pivote en el mantenimiento del microambiente tumoral, la resistencia a los medicamentos y la recurrencia tumoral¹. Por lo tanto, dirigirse a las GSC podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento de GBM². Sin embargo, un inconveniente importante para la eficacia del fármaco en GBM es su naturaleza heterogénea, que incluye, entre otros, la diferencia en mutaciones genéticas, subtipos mixtos, regulación epigenética y microambiente tumoral que los hace muy refractarios para el tratamiento. Después de muchos ensayos clínicos fallidos, los científicos e investigadores clínicos se dieron cuenta de que la terapia dirigida a un solo agente es probablemente incapaz de controlar completamente la progresión de cánceres altamente heterogéneos como el GBM. Considerando que, las combinaciones de medicamentos cuidadosamente seleccionadas han sido aprobadas por su efectividad al mejorar sinérgicamente el efecto de cada uno, proporcionando así una solución prometedora para el tratamiento de GBM.

Aunque hay muchas maneras de evaluar las interacciones fármaco-fármaco de una combinación de fármacos, como el CI (Índice de Combinación), HSA (Agente Único Más Alto) y los valores de Bliss, etc.^3,4, estos métodos de cálculo generalmente se basan en combinaciones de concentración múltiple. De hecho, estos métodos pueden proporcionar una evaluación afirmativa de la interacción fármaco-fármaco, pero pueden ser muy laboriosos si se aplican en el cribado de alto rendimiento. Para simplificar el proceso, se desarrolló un flujo de trabajo de detección para identificar rápidamente las posibles combinaciones de medicamentos que inhiben el crecimiento de GSC originadas a partir de biopsias quirúrgicas de GBM del paciente. Se introdujo en este método un índice de sensibilidad (SI) que refleja la diferencia entre el efecto combinado esperado y el efecto combinado observado para cuantificar el efecto sinérgico de cada fármaco, de modo que los candidatos potenciales puedan identificarse fácilmente mediante la clasificación SI. Mientras tanto, este protocolo demuestra un ejemplo de pantalla para identificar el candidato (s) potencial (s) que puede sinergizar el efecto anti-glioma con temozolomida, la quimioterapia de primera línea para el tratamiento de GBM, entre 20 pequeños inhibidores moleculares.

Protocolo

La muestra de GBM se adquirió de un paciente durante una operación de rutina después de obtener el consentimiento plenamente informado del comité de ética de investigación humana del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing.

1. Aislamiento y cultivo de GSC derivadas de pacientes

1. Coloque el tejido fresco de glioblastoma resecodo quirúrgicamente en un tubo centrífugo de 15 ml lleno de PBS estéril y almacene el tejido en hielo hasta la operación adicional.
2. Picar el tejido GBM en piezas de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diámetro usando tijeras de disección y lavar las muestras de tejido con medio basal neuronal para eliminar los desechos celulares en un gabinete de bioseguridad.
3. Digerir los fragmentos de tejido con 1 mg/ml de colagenasa A a 37 °C durante 30 min y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
4. Retire el sobrenadante y suspenda el gránulo con medio basal neuronal en blanco y disociar el gránulo mecánicamente mediante pipeteo repetitivo sobre hielo.
5. Culta la mezcla en placas de cultivo de 6 pozos de fijación ultrabaja rellenas con medio de cultivo GSC (ver Tabla 1 para la receta) en una incubadora de células estériles con 5% de CO₂ y 90% de humedad a 37 °C hasta la formación de la neuroesfera.
6. En una formación suficiente de neuroesferas, recójalos usando una pipeta en un microtubo de 1,5 ml y centrífuga a 800 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Vuelva a colocar el pellet y divídalo en varios matraces llenos del medio de cultivo anterior para mantener las GSC primarias.
   NOTA: Las GSC derivadas de pacientes utilizadas en el ejemplo se derivaron de biopsias quirúrgicas de un paciente masculino de 34 años con GBM recurrente de grado IV de la OMS. Los GSC fueron nombrados como XG387 para los futuros experimentos. Se realizaron pruebas de micoplasma basadas en PCR para las GSC anteriores para confirmar que no hay contaminación por micoplasma. Todos los experimentos con GSC utilizados en este protocolo se llevaron a cabo <15 pasajes.

2. Preparación de GSC marcadas con luciferasa

1. Recoger las GSC del medio de cultivo y centrifugarlas a 70 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
2. Retire el sobrenadante, digiera las células con accutase durante 4 min a 37 °C. Use una punta y una pipeta de 200 μL repetidamente para disociar y resuspend la bolita celular.
3. Diluya las células a 2 x 10⁵ células por pozo en una placa de cultivo de 12 pozos y culta las células durante la noche.
4. Añadir 30 μL de sobrenadante del virus luciferasa-EGFP (título >10⁸ TU/mL) en cada pozo de la placa y luego centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 h a 25 °C. Culta las células durante la noche.
5. Refresque el medio al día siguiente y culta las células durante otras 48 h.
6. Observe las células bajo un microscopio fluorescente para confirmar la aparición de las células GFP positivas.
7. Utilice un clasificador de células de flujo para clasificar y seleccionar las GSC con alta fluorescencia GFP para cultivar aún más las células.

3. Medición basada en bioluminiscencia de la viabilidad celular

1. Placas de recubrimiento con la mezcla de matriz extracelular (ECM) (por ejemplo, Matrigel): Agregue 40 μL de mezcla de ECM de 0.15 mg / ml a cada pozo e incube la placa durante 1 h a 37 ° C. Retire el exceso de mezcla de ECM y enjuague suavemente una vez con PBS.
2. Agregue un medio de cultivo de 100 μL que contenga 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,000 y 500 células XG387-Luc junto con un medio en blanco de 100 μL como control en cada pozo para 6 réplicas en una placa inferior óptica de 96 pozos y culta las células durante la noche a 37 ° C.
3. Retire el sobrenadante, agregue un medio de cultivo de 50 μL que contenga 150 ng/ μL de D-luciferina en cada pozo e incube las células durante 5 min a 37 °C.
4. Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes del espectro IVIS. Utilice el software incorporado para crear múltiples áreas circulares de la región de interés (ROI) y cuantificar la bioluminiscencia celular.

4. Tratamiento con temozolomida y cribado combinado

1. Precoat cuatro placas de 96 pozos como se describió anteriormente, antes del tratamiento.
2. Seed XG387-Luc cells a una densidad de 1.000 células en medio de cultivo de 100 μL en cada pozo de una placa inferior óptica de 96 pozos y cultiva las células durante la noche.
3. Prepare temozolomida y los agentes específicos de la solución de stock con anticipación. Preparar una serie de concentraciones compuesta por 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM y 50 μM temozolomida en medio de cultivo para el tratamiento con un solo agente. Diluir la temozolomida y los agentes dirigidos en solución stock en el medio de cultivo, respectivamente, para obtener concentraciones finales de 200 μM y 2 μM para el cribado combinado de fármacos (Tabla 2).
4. Retire el medio de cultivo cuando la mayoría de las GSC se adhieran a la parte inferior de las placas; agregue el medio preparado anteriormente que contiene temozolomida en cada pozo durante tres réplicas técnicas por tratamiento.
5. Para tratar la temozolomida y examinar las combinaciones de fármacos, retire el medio en blanco y agregue el medio preparado anteriormente que contenga temozolomida de 200 μM o un agente dirigido a 2 μM, o una combinación de ambos en cada pozo durante tres réplicas técnicas por tratamiento.
6. Incubar todas las placas a 37 °C, 5% co2 durante 3 días.
7. Retire el medio que contiene el fármaco, agregue 50 μL de medio en blanco que contenga 150 ng/μL de D-luciferina en cada pozo e incube las células durante 5 min a 37 °C.
8. Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes del espectro IVIS. Utilice el software incorporado para crear múltiples ROI circulares y cuantificar la bioluminiscencia celular.

5. Tratamiento combinado de temozolomida y UMI-77 en líneas celulares XG387-Luc y XG328-Luc

1. Precoat tres placas de 96 pozos como se describió anteriormente, antes del tratamiento.
2. Sembrar células XG387-Luc y XG328-Luc a una densidad de 1.000 células respectivamente en 100 μL de medio de cultivo en cada pozo de una placa inferior óptica de 96 pozos y cultivar las células durante la noche.
3. Preparar una serie de concentraciones compuesta por 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM y 0 μM temozolomida y una serie de concentraciones compuesta por 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM y 0 μM UMI-77 en el medio de cultivo para tratamientos con matriz de titulación de seis por seis dosis.
4. Retire el medio en blanco cuando la mayoría de las GSC se adhieran a la parte inferior de la placa; agregue el medio preparado anteriormente en cada pozo para obtener tres réplicas técnicas por tratamiento.
5. Incubar estas placas durante 3 días a 37 °C, 5% CO₂.
6. Retire el medio que contiene el medicamento; añadir 50 μL de medio en blanco que contenga 150 ng/μL de D-luciferina en cada pozo e incubar las células durante 5 min a 37 °C para la medición de la bioluminiscencia.

6. Análisis de datos

1. Calcule la puntuación del índice de sensibilidad (SI) de la temozolomida y el agente dirigido de acuerdo con la fórmula de la Figura 2A.
   NOTA: La puntuación SI es para cuantificar la influencia de la adición de otro fármaco. Varió de -1 a +1, con valores positivos que indican efectos sinérgicos de temozolomida.
2. Calcule los valores del índice de combinación (IC) entre temozolomida y UMI-77 utilizando el software CompuSyn para analizar sus interacciones combinadas. El valor de IC <1 indica sinergia; El valor de IC >1 indica antagonismo.
3. Calcule los altos valores de agente único (HSA) entre temozolomida y UMI-77 utilizando el software Combenefit. El valor de HSA indica el efecto inhibidor combinado. El valor de HSA >0 indica sinergia y el valor de HSA <0 indica antagonismo.

Resultados

Las células XG387 formaron neuroesferas en el medio de cultivo descrito en la Tabla 1 en una placa de cultivo de 6 pozos de unión ultra baja o una placa no recubierta⁵ (Figura 1A). En primer lugar, se realizó una prueba para comprobar si la intensidad de bioluminiscencia de las células XG387-Luc era proporcional al número de células. Como se muestra en la Figura 1B,la intensidad de la bioluminiscencia aumentó proporcional...

Discusión

En el presente estudio, se describió un protocolo que se puede aplicar para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando GSC derivadas del paciente. A diferencia del modelo métrico estándar de sinergia / adición, como los métodos Loewe, BLISS o HSA, se utilizó un flujo de trabajo simple y rápido que no requiere que un par de medicamentos se combine a múltiples concentraciones de manera factorial completa como los métodos tradicionales. En este flujo de trabajo, se introdujo el SI (índice de sensibilidad)...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicilina-Estreptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unidades/ml        S:  10.000 ug/ml
Piruvato de sodio	Gibco	2088876	100 mM
Tabla 1. El  formulación  de GSC  medio de cultivo completo.
ABT-737	MCE		Selectivo y BH3 mimético  Bcl-2,  Bcl-xL  y  Bcl-w  inhibidor
de adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1  inhibidor
Axitinib	MCE		Inhibidor de la tirosina cinasa multidirigida
AZD5991	MCE		Mcl-1  inhibidor
A 83-01	MCE		Potente inhibidor de TGF-β receptor tipo I  Quinasa ALK5
CGP57380	Selleck		Potent  MNK1  inhibidor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitivo  PI3K  y  mTOR  inhibidor
de Dasatinib	MCE		Dual  Familia Bcr-Abl y Src tirosina quinasa  inhibidor
Erlotinib	MCE		EGFR  inhibidor de la tirosina cinasa
, Gefitinib,	MCE,		EGFR, TIROSINA QUINASA  inhibidor
Linifanib	MCE		Inhibidor multidiana de  VEGFR  y  PDGFR  familia
Masitinib	MCE		de  c-Kit
ML141	Selleck		Inhibidor no competitivo de  Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Inhibidor multidiana de Kit, KDR y CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selectivo  CDK4  y  CDK6  inhibidor
SB 202190	MCE		Selectivo  p38 MAPA quinasa  inhibidor
de bromuro de sepantronio (YM-155)	MCE		Survivin  inhibidor
TCS 359	Selleck		Potente inhibidor de FLT3
UMI-77	MCE		Selectivo  Mcl-1  inhibidor
de 4-hidroxitamoxifeno (afimoxifeno)	Selleck		selectivo  receptor de estrógeno (RE)  modulador
Tabla 2. La información de 20 agentes específicos utilizados en la pantalla de prueba. Todos estos son inhibidores selectivos de moléculas pequeñas diana. El proveedor, el nombre y los destinos se proporcionaron en la tabla.