Identificación de las proteínas de unión de pequeños ligandos con la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos (DRaCALA)

Resumen

El ensayo Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) se puede utilizar para identificar pequeñas proteínas de unión a ligandos de un organismo mediante el uso de una biblioteca ORFeome.

Resumen

La última década ha visto un tremendo progreso en la comprensión de pequeñas moléculas de señalización en la fisiología bacteriana. En particular, las proteínas diana de varios mensajeros secundarios derivados de nucleótidos (NSM) se han identificado y estudiado sistemáticamente en organismos modelo. Estos logros se deben principalmente al desarrollo de varias técnicas nuevas, incluida la técnica de compuestos de captura y la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando (DRaCALA), que se utilizaron para identificar sistemáticamente las proteínas diana de estas pequeñas moléculas. Este artículo describe el uso de los NSM, penta- y tetrafosfatos de guanosina (p)ppGpp, como ejemplo y demostración en video de la técnica DRaCALA. Usando DRaCALA, se identificaron 9 de las 20 proteínas diana conocidas y 12 nuevas de (p)ppGpp en el organismo modelo, Escherichia coli K-12, lo que demuestra el poder de este ensayo. En principio, DRaCALA podría usarse para estudiar pequeños ligandos que pueden ser etiquetados por isótopos radiactivos o colorantes fluorescentes. Los pasos críticos, los pros y los contras de DRaCALA se discuten aquí para una mayor aplicación de esta técnica.

Introducción

Las bacterias utilizan varias moléculas de señalización pequeñas para adaptarse a entornos en constante cambio^1,2. Por ejemplo, los autoinductores, las lactonas de N-acilhomoserina y sus oligopéptidos modificados, median la comunicación intercelular entre las bacterias para coordinar el comportamiento de la población, un fenómeno conocido como detección de quórum^2. Otro grupo de moléculas de señalización pequeñas son los NSM, incluidos el ampliamente estudiado monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), el di-AMP cíclico, el monofosfato de di-guanosina cíclico (di-GMP cíclico) y ....

Protocolo

1. Preparación de lisatos de células enteras

1. Inocular las cepas de recolección de E. coli K-12 ASKA ORFeome¹⁵ en caldo de lisogenia (LB) de 1,5 ml que contiene 25 μg / ml de cloranfenicol en placas de pozos profundos de 96 pozos. Cultivar durante la noche (O/N) durante 18 h a 30 °C con agitación a 160 rpm. Al día siguiente, añadir isopropilo β-d-1-tiogalactopyranoside (IPTG) (0,5 mM final) a los cultivos de O/N para inducir la expresión de proteínas a 30 °C durante 6 h.
2. Células de pellet a 500 x g durante 10 min. Congelar los pellets a -80 °C hasta su uso. Para lisar las células, agregue 150 μL de tampón de....

Resultados

Seguir el protocolo descrito anteriormente normalmente producirá dos tipos de resultados(Figura 3).

La Figura 3A muestra una placa con señales de unión de fondo relativamente bajas (fracciones de unión < 0.025) de la mayoría de los pozos. La señal de unión positiva del pozo H3 da una fracción de unión de ~0.35 que es mucho más alta que la observada para los otros pozos. Incluso sin cuantificación, el pozo H3 es notable, lo que sugi.......

Discusión

Uno de los pasos críticos para realizar el cribado de DRaCALA es obtener buenos lisados de células enteras. Primero, las proteínas probadas deben producirse en grandes cantidades y en formas solubles. En segundo lugar, la lisis de las células debe ser completa, y la viscosidad del lisato debe ser mínima. La inclusión de lisozima y el uso de tres ciclos de congelación-descongelación son a menudo suficientes para lisar las células por completo. Sin embargo, el ADN cromosómico liberado hace que el lisato sea viscoso y gener.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x herramienta de clavija	V& P Scientific	VP 404	96 Replicador de pernos, en centros de 9 mm, 4,2 mm de diámetro del perno, 24 mm de largo
Placa de microtitulación con fondo en V de 96 pocillos	Sterilin	MIC9004	Microplaca Sterilin V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar n.º 1
Colección ASKA cepa	NBRP, SHIGEN, JAPÓN		Ref: DNA Research, volumen 12, número 5, 2005, páginas 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	endonucleasa modificada genéticamente de Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006	Reagent Concentrate
DMSO	SIGMA	D8418	≥ 99,9%
DNasa 1	SIGMA	DN25-1G
filtración en gel10x300 columna	GE Healthcare	28990944	contiene un 20% de etanol como conservante
Glicerol	PanReac AppliChem	122329.1214	Glicerol 87% para análisis
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazol	SIGMA	56750	puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC)
Pantalla de fósforo de almacenamiento IP	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	SIGMA	I6758	Isopropilo β-D-tiogalactósido
Caldo de lisogén (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Base
de caldo Lysozyme	SIGMA	L4949	de clara de huevo de gallina; BioUltra, polvo liofilizado, ≥ 98%
MgCl2 (Cloruro de magnesio)	SIGMA	208337
MilliQ water			agua ultrapura
	Thermo Scientific	4661110	F1 - Punta de clip; 1-10 ul, 8 x canales
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarosa	Qiagen	30230
Membrana de transferencia de nitrocelulosa	Amersham Protran	10600003	Premium 0,45 mmm 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco A), Comprimidos
PEG3350 (Polietilenglicol 3350)	SIGMA	202444
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)	SIGMA	93482	Solución de fluoruro de fenilmetanosulfonilo - 0,1 M en etanol (T)
Generador de imágenes de fósforo	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Generador de imágenes de fósforo
Puntas de pipeta, filtradas	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12,5 μ l no estéril
Columna de cromatografía Poly-Prep	Bio-Rad	7311550	columna de cromatografía de polipropileno
Inhibidor de la proteasa Mini	Pierce	A32955	Comprimidos, sin EDTA
tubo con tapón de rosca	Thermo Scientific	3488	Microcentifuge Tubes, 2,0 ml con tapón de rosca, no estéril
SLS de 96 grados de profundidad Placas de pocillos	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom,
Columna de centrifugación	natural Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0,5 ml Filtros centrífugos
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
Placa TLC (placas de PEI-celulosa F TLC)	Merck Millipore	105579	DC PEI-celulosa F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Tris Base para Biología Molecular
Tween 20	SIGMA	P1379	detergente viscoso no iónico
β-mercaptoetanol	SIGMA	M3148	99% (GC/valoración)

pipeta multicanal para