Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Tanto los ratones como los humanos tienen dos tipos de tejidos adiposos: tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT)¹. WAT almacena energía en forma de triglicéridos en los adipocitos blancos, y los adipocitos marrones (BA) de BAT disipan la energía química en forma de calor². Según su origen en el desarrollo, los BA se clasifican en BA clásicos (cBA) que se formaron durante el desarrollo embrionario y BA derivados de adipocitos blancos (células beige / brite, convertidas de adipocitos blancos en condiciones de estrés)³. Los BA son multiloculares y expresan la proteína termogénica de desacoplamiento 1 (UCP1)⁴. El depósito interescapular de BAT (iBAT) es uno de los principales depósitos de cBA en pequeños mamíferos⁵, mientras que las células beige se dispersan dentro de WAT⁶.

Debido a su naturaleza de disipación de energía, los BA han recibido mucha atención como una diana terapéutica para reducir la obesidad⁷. Para explotar los BA con el propósito de tratar la obesidad, es esencial comprender los mecanismos moleculares que controlan la función, la supervivencia y el reclutamiento de los BA. Los tejidos adiposos, incluidos BAT y WAT, son heterogéneos. A excepción de los adipocitos, los tejidos adiposos contienen muchos otros tipos de células, como las células endoteliales, las células madre mesenquimales y los macrófagos⁸. Aunque existen herramientas genéticas para agotar específicamente los genes candidatos en ratones BA, como UCP1::Cre línea⁹, las técnicas para purificar BAT o WAT son limitadas, lo que dificulta el estudio de BA a nivel de tipo unicelular. Además, sin obtener BA puros, la relación entre BA y no BA no estará claramente delineada. Por ejemplo, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) se ha utilizado como marcador para células mesenquimales indiferenciadas, y se expresa en las células endoteliales e intersticiales de BAT. En las MTD estresadas por frío, las células progenitoras PDGFRα positivas dan lugar a nuevas BAs¹⁰. PDGFRα es activado por su ligando PDGF, un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales¹¹; sin embargo, no está claro si las BA influyen en el comportamiento de las células progenitoras PDGFRα positivas mediante la secreción de PDGF.

Recientemente, se ha publicado un protocolo de aislamiento de BAs, que se basa en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)¹². En este protocolo, se utilizó una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% para separar los BA de los no BA, y los BA enriquecidos se purificaron aún más mediante FACS. La aplicación de este protocolo está limitada por el requisito del proceso FACS, que se basa tanto en el equipo como en las experiencias de operación del FACS. En este estudio, se desarrolló un nuevo protocolo para aislar los BAT de las MTD. Los BA aislados por este protocolo se pueden utilizar directamente para estudios de expresión génica y proteica. Además, los datos de este estudio sugieren que los BA son un recurso importante de PDGF.

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Investigación Médica Masónica (IACUC). UCP1::Cre⁹ y Rosa 26^tdTomato ratones líneas¹³ fueron reportados previamente. Todos los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.

1. Preparación de las soluciones y el tejido adiposo marrón (MTD)

1. Prepare la solución de digestión y la solución de separación en tubos centrífugos de 15 ml.
2. 10 ml de solución de digestión BAT: Para 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS), agregue 3,5 mg/ml de dispasa II, 1 mg/ml de colagenasa II y 10 mM de CaCl₂ para hacer una solución de digestión BAT.
3. 10 ml de solución de iodixanol al 12% (solución de separación): Mezclar 1 mL de 10x PBS, 2 mL de iodixanol al 60%, 0.01 mL de 1 M MgCl 2, 0.025 mL de 1 M KCl, 0.1 mL de ácido etilendiaminotetraacético_0.2 M (EDTA) y 6.865 mL de ddH2O para obtener₁₂% de iodixanol.
4. Eutanasia a un ratón adulto con sobredosis de_CO2 . Brevemente, llene la jaula del ratón con 100% de_CO2 a una tasa de desplazamiento del 10-30% de volumen de la jaula por minuto. 5 minutos más tarde, confirme la muerte verificando la ausencia de respiración visible.
5. Diseccionar al animal y recoger las MTD interescapulares. Retire WAT y las capas musculares bajo un microscopio estéreo.
6. Para tener suficiente digestión, cortar cada lóbulo BAT en ~ 3 mm³ partes y colocarlos en un matraz limpio de 50 ml con una barra de agitación de metal y una solución de digestión de 5 ml. Antes de comenzar la digestión, deje reposar sobre hielo el matraz que contiene MTD y tampón de digestión.
   NOTA: En los siguientes pasos, se utilizaron alrededor de 80 mg de BAT para el aislamiento de adipocitos marrones.

2. Procedimiento de aislamiento de BA

1. Coloque el matraz en un agitador magnético que esté encerrado en una incubadora. Ajuste la velocidad de agitación a 60 rpm y la temperatura de la incubadora a 35 °C, respectivamente. La digestión durará alrededor de 30 minutos. Si las rodajas BAT forman grupos alrededor de la barra de agitación durante la digestión, use una punta de pipeta de 1 ml para interrumpir los tejidos agregados.
2. Coloque un filtro filtrador de 70 μm encima de un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Pipetear alrededor de 4 ml de suspensión celular a través del filtro. Lave el colador con 4 ml de solución de iodixanol al 12%. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células y la solución de iodixanol. Transfiera la mezcla celular a dos tubos de ensayo de poliestireno transparente de 5 ml.
   NOTA: Al final de la digestión, la solución de digestión debe estar turbia, lo que indica suficiente digestión. Use una solución de digestión fresca cada vez. Una vez preparada, la solución de digestión debe usarse dentro de las 2 h.
3. Repita los pasos 2.2 y 2.3 una vez más si la digestión no es suficiente.
4. Dejar los tubos de poliestireno transparente que contienen la solución de separación y los BA en hielo durante 1 h. Los BA formarán una capa en la parte superior.
5. Saque 20 μL de los BA aislados para examinarlos con microscopio.

3. Aislamiento de ARN y proteínas de BA

1. Pipetear la capa de BA en dos tubos de microcentrífuga de 1,7 ml para el aislamiento de ARN y proteínas. Retire con cuidado la solución excesiva de iodixanol sin interrumpir la capa de BAs.
2. Agregue 1 ml de Trizol para aislar simultáneamente el ARN, el ADN y la proteína en la solución celular. Mezclar lo suficiente para lisar las células.
3. Añadir 200 μL de cloroformo para separar las fases.
4. Centrifugar el tubo durante 9.981 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Después de la centrifugación, use la fase acuosa para el aislamiento de ARN. En este estudio, se utilizó ARN total para la transcripción inversa y se realizó RT-PCR cuantitativa con PCR en tiempo real. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla de materiales.
6. Transfiera 300 μL de la fase orgánica a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
7. A la fase orgánica, agregue 2.5 volumen 100% etanol y vórtice durante 10 s.
8. Añadir 200 μL de 1-Bromo-3-cloropropano y vórtice durante 10 s.
9. Añadir 600 μL de agua destilada doble y vórtice durante 10 s.
10. Deje reposar la solución mezclada durante 10 minutos a temperatura ambiente.
11. Centrifugar a 9.981 x g durante 10 min a 4 °C. En este paso, las fases se separarán. La fase proteica se localiza en la capa media.
12. Retire la solución acuosa superior. Agregue 1 ml de etanol 100% en la solución restante.
13. Centrífuga durante 10 min, 9,981 x g, 4 °C. Después de la centrifugación, se formará el pellet de proteína. Deseche el sobrenadante.
14. Lave el pellet con 1 mL 100% etanol.
15. Centrífuga durante 10 min, 9981 x g, 4 °C. Guarde el pellet y deseche el sobrenadante.
16. Secar al aire el pellet durante 10 min a temperatura ambiente.
17. Mida el peso del pellet húmedo. Añadir una solución de SDS al 1% en una proporción de 20 μL/mg de pellet.
18. Disuelva el pellet colocando el tubo en una coctelera caliente. Ajuste la temperatura a 55 °C y la velocidad a 11 x g. Por lo general, se tarda de 5 a 10 minutos en disolver completamente el pellet de proteína.
    NOTA: La concentración de la proteína disuelta puede medirse mediante el ensayo BCA¹⁴.

Preparación de MTD interacapular para el aislamiento de adipocitos marrones
El proceso de aislamiento de los adipocitos marrones (BA) se muestra en la Figura 1A. Todo el proceso, desde la preparación de las MTD y las soluciones de digestión/separación hasta la obtención de BA aislados, tomará alrededor de 4 h.

En ratones adultos, existe abundante BAT en la región interescapular. Este BAT interescapular (iBAT) está cubierto por capas musculares y WAT (Figura 1B). Antes de comenzar el procedimiento de digestión, las capas musculares y WAT deben eliminarse para producir iBAT limpio (Figura 1C). En un protocolo de aislamiento de Bs publicado, se utilizó MTD picada para el aislamiento de BAs12. En este estudio, la digestión de BAT de tamaño3 mm 3 (Figura 1D) produjo más BA que BAT picado.

Separación de BA de no BA con solución BSA al 3%
Después de la digestión iBAT, los BA disociados se mezclaron con no BA en el producto de digestión. Debido a que los BA contienen gotas de lípidos, su densidad es menor que la de los no BA; sin embargo, la densidad de BA no es lo suficientemente baja como para permitirles flotar eficientemente a la parte superior de una solución PBS regular. PBS que contiene 3% de albúmina sérica bovina (BSA) se ha utilizado para separar BA de no BA12, lo que se repitió con éxito en este estudio (Figura 2A).

Rosa 26 tdTomato es una línea de ratón reportero, que expresa una fuerte proteína de fluorescenciatdTomato (tdTom ) después de la recombinación mediada por Cre13. Ucp1::Cre ratones transgénicos expresan Cre recombinasa en los BAs9. La línea de ratón Ucp1::Cre se cruzó con ratones Rosa 26tdTomato para etiquetar genéticamente los BA con tdTom (Figura 2B). Para validar el procedimiento de aislamiento de BAs, se disoció iBAT de ratones Ucp1::Cre;tdTom/+. La mayoría de las células enriquecidas en la capa superior de la solución de BSA tenían forma de frambuesa y contenían gotas de lípidos multiloculares. Además, la mayoría de estas células en forma de frambuesa eran tdTom positivas (Figura 2C), lo que confirma que eran adipocitos marrones.

Separación de BA de no BA con solución de iodixanol al 6%
BA enriquecidos con solución de separación BSA al 3%. No estaba claro si estos BA aislados podrían usarse para el análisis de expresión génica y proteica. El ARN y la proteína se extrajeron de los BA enriquecidos. La extracción de ARN se realizó con éxito de acuerdo con el procedimiento estándar de aislamiento de ARN. Sin embargo, el protocolo estándar de aislamiento de proteínas Trizol, también conocido como método de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio (método GTPC), no funcionó bien, lo cual fue tedioso y tuvo un rendimiento proteico muy bajo. Por lo tanto, se adoptó un método mejorado de aislamiento de proteínas para extraer proteínas de BA lisadas con Trizol.

En este protocolo GTPC mejorado, se utilizó etanol, bromo-cloropropano y agua para extraer proteínas de la fase orgánica15. Después de agregar etanol, bromo-cloropropano y agua en la fase orgánica, y después de la centrifugación, se formó un pellet de proteína entre la fase acuosa y la fase orgánica (Figura 3A). El pellet de proteína se lavó con etanol al 100% y se disolvió en SDS al 1%. Este método GTPC mejorado se utilizó para extraer proteínas de BAT y BA enriquecidas con solución de BSA. Aunque el pellet de proteína BAT se disolvió fácilmente en SDS al 1%, la mayor parte del pellet de proteína BAs aislado no fue soluble. Luego se examinó la proteína disuelta con gel SDS-PAGE. Como se muestra en un gel SDS-PAGE teñido de azul Coomassie (Figura 3B), una banda de proteína masiva de alrededor de 60 kDa estaba presente en los BA aislados, pero no en las muestras de BAT. Debido a que el peso molecular de BSA es de 66 kDa, y existe abundante BSA en la solución de separación de BAs, esta banda de proteína dominante debe ser BSA. Estos datos sugieren que la BSA de la solución de separación de BA interfiere con la extracción de proteínas.

El iodixanol es un medio de gradiente no iónico e isoosmótico16 que ha sido ampliamente utilizado para la purificación de células17 y virus adenoasociados (AAV)18. Para evitar la interferencia de BSA de los estudios de expresión de proteínas, se utilizó iodixanol para reemplazar BSA en una nueva solución de separación de BAs. La solución de BSA al 3% tiene una densidad de 1.03, que es similar con el 6% de iodixanol. En una solución de iodixanol al 6%, los BA flotaron hasta la parte superior en 30-60 min (Figura 3C). Los BA aislados con esta solución mostraron una forma típica de frambuesa y contenían gotas lipídicas multiloculares (Figura 3D). Las proteínas extraídas de estos BA aislados se separaron muy bien en gel SDS-PAGE (Figura 3E).

Para verificar si la solución de iodixanol al 6% separaba eficientemente los BA de los no BA, etiquetamos genéticamente los BA con tdTom y examinamos las células que residen en la solución clara de iodixanol al 6%. Después de separar los BA de los no BA (paso 2.4), la solución de iodixanol al 6% debajo de la capa de BA se diluyó 6 veces con PBS y luego se centrifugó a 600 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, se formó un pequeño gránulo de glóbulos rojos en la parte inferior, que podría ser células de fracción vascular del estroma. Como se muestra en la Figura 3, las células de la capa BA eran células tdTom positivas (Figura 3F); sin embargo, las células recuperadas del pellet fueron tdTom negativas (Figura 3G). Además, no se observaron gotas de lípidos obvias en las células tdTom negativas. Estos datos sugieren que nuestro nuevo protocolo puede separar eficientemente los BA de las células no grasas.

En conjunto, estos datos demuestran que aislar BA con una solución de BSA al 3% interfiere con los estudios bioquímicos de seguimiento y sugieren que la solución de iodixanol al 6% es mejor que la solución de BSA al 3% para aislar BA.

Análisis de expresión génica y proteica con BAs aislados.
Para validar este nuevo procedimiento de aislamiento de BAs a nivel molecular, se comparó la expresión de tres genes entre BAT y BA aisladas: Ucp1, Pdgfa y Pdgfra. En las MTD, Pdgfra se expresa en células endoteliales y células intersticiales, y las células PDGFRα positivas son células progenitoras putativas10. Los niveles de ARNm de Ucp1 y Pdgfa fueron significativamente más altos en los BA aislados que en las MTD (Figura 4A, B). Por el contrario, el ARNm de Pdgfra sólo se detectó en las MTD (Figura 4B).

PPARγ es un factor transcripcional que controla el desarrollo del tejido adiposo, UCP1 es una proteína mitocondrial y PDGFRα es una proteína receptora de membrana. Estas tres proteínas representan proteínas distribuidas en diferentes compartimentos celulares. Se realizaron Western blots para probar si la proteína extraída de BA lisados con Trizol y BAT era adecuada para el análisis de expresión de proteínas. Se detectaron UCP1 y PPARγ tanto en BA como en BAT (Figura 4C, D), lo que confirma que la proteína total aislada de los BA lisados con Trizol o BAT es adecuada para Western blot. Además, de acuerdo con los resultados de qRT-PCR, la proteína UCP1 se enriqueció en BA (Figura 4C); mientras que PDGFRα solo se detectó en MTD pero no en BA puras (Figura 4D). En resumen, estos datos demuestran que nuestro nuevo método de aislamiento de BA es eficiente y sugieren que los BA enriquecidos por este método pueden usarse directamente para estudios de expresión génica y proteica.

Figura 1: Preparación de iBAT para el aislamiento de adipocitos marrones. (A) Flujo de trabajo del procedimiento de aislamiento de adipocitos marrones. (B) Vista ventral del tejido interescapular que contiene BAT, WAT y capas musculares. c) MTD interescapular (iBAT). Se eliminaron las capas musculares y WAT adyacentes a iBAT. (D) Una imagen representativa de piezas de iBAT utilizadas para el aislamiento de adipocitos marrones. B-D, barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Separación de los adipocitos marrones de la solución digestiva. (A) Imágenes de adipocitos marrones disociados antes y después de la separación. Se utilizó una solución de BSA al 3% para separar los adipocitos marrones de los adipocitos no marrones. Barra de escala = 1 cm. (B) Vista esquemática del marcado genético de adipocitos marrones con proteína de fluorescencia tdTomato. (C) Imágenes de adipocitos marrones aislados. DIC: contraste de interferencia diferencial. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Extracción de proteína total de adipocitos marrones lisados . (A) Separación de la fase proteica de la fase orgánica. (B) Tinción Coomassie del gel SDS-PAGE. La proteína total se extrajo de BAT o solución de BSA al 3% de adipocitos marrones purificados. La banda de proteína BSA se indicó con una flecha. (C) Capa de adipocitos marrones formada sobre una solución de iodixanol al 6%. Barra de escala = 1 cm. (D) Adipocitos marrones aislados con solución de iodixanol al 6%. Los adipocitos marrones fueron indicados por flechas amarillas. Barra de escala = 50 μm. (E) Tinción de Coomassie del gel SDS-PAGE. La proteína total se extrajo de BAT o BA enriquecida con solución de iodixanol al 6%. (F) Imágenes de adipocitos marrones marcados con tdTom. (G) Imágenes de células recuperadas de la solución de iodixanol debajo de la capa de BAs. F y G, barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de expresión génica y proteica de adipocitos marrones aislados. Los adipocitos marrones aislados con el método iodixanol se utilizaron en estos estudios de expresión génica y proteica. (A,B) qRT-PCR medición de la expresión génica. Los niveles de ARNm se normalizaron a 36B4. N=3. Prueba t de Student, *, P<0,01; **, P<0.01. (C) Western blot de PPARγ y UCP1. (D) Western blot de PDGFRα. C y D, se utilizó la membrana teñida con S de Ponceau como control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ninguno