Presentamos un protocolo para la caracterización de la motilidad y el comportamiento de una población de células de cien micras a milímetros utilizando microscopía de campo brillante y seguimiento celular. Este ensayo revela que Stentor coeruleus pasa por cuatro fases conductualmente distintas al regenerar un aparato oral perdido.
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Artículo de método
Análisis de los patrones de motilidad del estentor durante y después de la regeneración del aparato oral mediante el seguimiento celular
En este artículo
Resumen
Resumen
Stentor coeruleus es un organismo modelo bien conocido para el estudio de la regeneración unicelular. El análisis transcriptómico de células individuales reveló cientos de genes, muchos no asociados con el aparato oral (OA), que están regulados diferencialmente en fases a lo largo del proceso de regeneración. Se planteó la hipótesis de que esta reorganización sistémica y movilización de recursos celulares hacia el crecimiento de una nueva OA conducirá a cambios observables en el movimiento y el comportamiento correspondientes en el tiempo a las fases de expresión génica diferencial. Sin embargo, la complejidad morfológica de S. coeruleus requirió el desarrollo de un ensayo para capturar las estadísticas y la escala de tiempo. Se utilizó un script personalizado para rastrear celdas en videos cortos, y se compilaron estadísticas sobre una gran población (N ~ 100). Tras la pérdida de la OA, S. coeruleus inicialmente pierde la capacidad de movimiento dirigido; luego, a partir de ~ 4 h, exhibe una caída significativa en la velocidad hasta ~ 8 h. Este ensayo proporciona una herramienta útil para el cribado de fenotipos de motilidad y puede ser adaptado para la investigación de otros organismos.
Introducción
Stentor coeruleus (Stentor) es un organismo modelo bien conocido que se ha utilizado para estudiar la regeneración unicelular debido a su gran tamaño, capacidad para soportar varias técnicas microquirúrgicas y facilidad de cultivo en un entorno de laboratorio 1,2,3. Los primeros estudios de regeneración se centraron en la característica más grande y morfológicamente distinta de Stentor, la OA, que se elimina por completo tras el choque químico 4,5,6. El....
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Protocolo
NOTA: Se cultivó una población de aproximadamente cien células de S. coeruleus de acuerdo con un protocolo JoVE8 publicado anteriormente.
1. Preparación de la muestra
- Corte un trozo de lámina espaciadora de silicona de 250 μm de espesor (Tabla de materiales) ligeramente más pequeña en altura y anchura que un portaobjetos de microscopio. Usando un taladro de 5/16", cree pozos circulares. Tenga en cuenta dejar suficiente espacio entre los pozos vecinos para garantizar un buen sellado.
NOTA: Se encontró que un espacio de 3 mm entre los pozos vecinos era suficiente. Con la práctica,....
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Resultados
El objetivo de este ensayo es cuantificar el cambio gradual de los patrones de movimiento y el aumento gradual de la velocidad de movimiento de las células dentro de una gran población de stentores regeneradores (N ~ 100). Para facilitar la interpretación de los resultados, el código personalizado incluido en este protocolo genera dos tipos de gráficos: una superposición de todos los rastros de movimiento celular en un conjunto de datos de video (Figura 1C-F.......
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Discusión
Actualmente existen muchos algoritmos de seguimiento de partículas y células, algunos completamente gratuitos. El costo y la facilidad de uso a menudo son compensaciones que requieren compromiso. Además, muchos de los programas de seguimiento celular existentes están diseñados para rastrear el movimiento lento de rastreo de las células de cultivo de tejidos, en lugar del movimiento de natación rápida de Stentor, que gira mientras nada y puede sufrir cambios repentinos de dirección. Después de probar muchas de es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Laboratorio de Biología Marina Whitman Early Career Fellowship (JYS). Reconocemos a Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo y Skylar Widman por ayudar con algunos de los análisis preliminares y las pruebas de código. Agradecemos a Mark Slabodnick por la discusión y las sugerencias. WFM reconoce el apoyo de la subvención R35 GM130327 de los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lámina de silicona de 0,25 mm de espesor | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, cubreobjetos #1.5 | Fisher Scientific | NC1034527 | Como se señaló en la discusión, se puede usar un cubreobjetos más pequeño si se colocan menos pocillos de muestra en un portaobjetos. |
| Cámara | Utilizamos Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT cepa | Chlamydomonas Centro de recursos | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | necesario para TrackCells.m y CleanTraces.m |
Referencias
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate....
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Reimpresiones y permisos
