Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo tridimensional de piel simplificado e indiferenciado utilizando una plataforma microfluídica micromecanizado. Un enfoque de flujo paralelo permite la deposición in situ de un compartimento dérmico para la siembra de células epiteliales en la parte superior, todo controlado por bombas de jeringa.

Abstract

Este trabajo presenta una plataforma microfluídica nueva, rentable y confiable con el potencial de generar tejidos complejos de múltiples capas. Como prueba de concepto, se ha modelado una piel humana simplificada e indiferenciada que contiene un compartimento dérmico (estromal) y epidérmico (epitelial). Para ello, se ha desarrollado un dispositivo versátil y robusto, a base de vinilo dividido en dos cámaras, superando algunos de los inconvenientes presentes en los dispositivos microfluídicos basados en polidimetilsiloxano (PDMS) para aplicaciones biomédicas, como el uso de equipos costosos y especializados o la absorción de moléculas y proteínas pequeñas e hidrofóbicas. Además, se desarrolló un nuevo método basado en el flujo paralelo, que permite la deposición in situ de los compartimentos dérmico y epidérmico. La construcción de la piel consiste en una matriz de fibrina que contiene fibroblastos primarios humanos y una monocapa de queratinocitos inmortalizados sembrados en la parte superior, que posteriormente se mantiene en condiciones de cultivo dinámico. Esta nueva plataforma microfluídica abre la posibilidad de modelar enfermedades de la piel humana y extrapolar el método para generar otros tejidos complejos.

Introduction

Recientemente, se han realizado avances hacia el desarrollo y producción de modelos de piel humana in vitro para el análisis de la toxicidad de productos cosméticos y farmacéuticos¹. Los investigadores de las industrias farmacéutica y de cuidado de la piel han estado utilizando animales, siendo los ratones los más comunes, para probar sus productos^2,3,4,5. Sin embargo, la prueba de productos en animales no siempre es predictiva de la respuesta en humanos, lo que con frecuencia conduce a la falla del medicamen....

Protocol

1. Diseño de chips y parámetros de micromecanizado

1. Diseñe las capas de chips microfluídicos con el software de diseño de código abierto FreeCAD; consulte la Tabla 1 para conocer las dimensiones de los canales. Incluya cuatro orificios de 2,54 mm de diámetro en el diseño para usar un alineador personalizado para una superposición de capa correcta.

	Longitud (μm)	Ancho (μm)
Cámara baja	28,400	800
Cámara alta	31,000

Results

El chip diseñado está compuesto por dos cámaras fluídicas separadas por una membrana PC de tamaño de poro de 5 μm que permite el crecimiento de la célula al permitir el paso de moléculas promotoras del crecimiento desde la cámara inferior. La cámara superior sostiene la construcción tisular, en este caso, de una monocapa de hKCs sobre un hidrogel de fibrina que contiene hFBs.

La altura de los canales está determinada por el número de láminas adhesivas añadidas a cada canal. La cámara inferior .......

Discussion

La motivación para desarrollar este método fue el deseo de modelar las enfermedades de la piel y estudiar los efectos de las terapias nuevas e innovadoras en una plataforma de alto rendimiento. Hasta la fecha, este laboratorio produce estos equivalentes dermo-epidérmicos mediante la fundición, ya sea manualmente o con la ayuda de la tecnología de bioimpresión 3D, el gel de fibrina con fibroblastos en una placa de inserción de cultivo celular y la siembra de los queratinocitos sobre ella. Una vez que los queratinocitos al.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrina	Rottafarm		Ácido tranexámico
Antibiótico/antimicótico	Thermo Scientific HyClone
Cloruro de calcio	Sigma Aldrich
Placas de cultivo	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Cinta de doble cara Vynil	ATP Sistemas adhesivos		GM 107CC, 12 y micro; m de espesor
Plotter	de bordes Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Extraído de plasma humano
Portaobjetos de vidrio	Thermo Scientific
GFP-Fibroblastos dérmicos humanos-Primario			. Obsequio de la Dra. Marta Garcí una
línea celular H2B-GFP-HaCaT	ATCC		Queratinocitos inmortalizados. Obsequio de la Dra. Marta Garcí un
kit Vivo/Muerto	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Membrana de policarbonato	Merk TM		5 y micro; m tamaño de poro
Polidimetilsiloxano	Dow Corning		Sylgard 184
Cloruro de sodio	Sigma Aldrich
Jeringas	Terumo		5 mL
Trombina	Sigma Aldrich		10 NIH/vial
Vinilo adhesivo transparente	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 &;
Tubo de tripsina/EDTA	Sigma Aldrich
de m de	Teflón IDEX		, 1/16" OD, 0.020" Identificación