μTongue: Una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica para la lengua in vivo

Resumen

El artículo presenta el dispositivo μTongue (microfluídica en una lengua) para imágenes funcionales de células gustativas in vivo mediante la integración de microfluídica en una ventana de imágenes intravitales en la lengua.

Resumen

La microscopía de fluorescencia intravital es una herramienta ampliamente utilizada para estudiar la dinámica multicelular en un animal vivo. Sin embargo, no se ha utilizado con éxito en el órgano sensorial del gusto. Al integrar la microfluídica en la ventana de imágenes de la lengua intravital, la μTongue proporciona imágenes funcionales confiables de las células gustativas in vivo bajo exposición controlada a múltiples saborantes. En este documento, se presenta un procedimiento detallado paso a paso para utilizar el sistema μTongue. Hay cinco subsecciones: preparación de soluciones de sabor, configuración de un módulo microfluídico, montaje de muestras, adquisición de datos de imágenes funcionales y análisis de datos. También se presentan algunos consejos y técnicas para resolver los problemas prácticos que pueden surgir al usar la μTongue.

Introducción

El microscopio de fluorescencia intravital se utiliza ampliamente para estudiar la dinámica espaciotemporal en los tejidos vivos. Los investigadores están desarrollando rápidamente sensores codificados genéticamente que proporcionan transformaciones específicas y sensibles de los procesos biológicos en señales de fluorescencia, que se pueden registrar fácilmente utilizando microscopios de fluorescencia que están ampliamente disponibles^1,2. Aunque la mayoría de los órganos internos en roedores se han investigado utilizando el microscopio, su aplicación exitosa a la lengua aún no ha tenido éxito³.

Estudios previos sobre la imagen de calcio de las células gustativas se realizaron ex vivo mediante la sección delgada de un tejido de la lengua para obtener papilas gustativas circunvaladas^4,5,6 o^mediante la descamación del epitelio gustativo para obtener papilas gustativas fungiformes^7,8. La preparación de estas muestras fue inevitablemente invasiva, por lo que los microambientes naturales, como la inervación nerviosa, las barreras de permeabilidad y la circulación sanguínea, se perturbaron en gran medida. La primera ventana de imágenes de la lengua intravital fue reportada en 2015 por Choi et al., pero no se pudo lograr un registro funcional confiable debido al movimiento y los artefactos ópticos causados por los estímulos de sabor fluídico⁹.

Recientemente, se introdujo la microfluídica en una lengua (μTongue)¹⁰. Este dispositivo integra un sistema microfluídico con una ventana de imágenes en la lengua del ratón. Al lograr un flujo de estado cuasi-estacionario de estímulos saborantes a lo largo del período de imagen, los artefactos del movimiento fluídico podrían minimizarse(Figura 1). El puerto de entrada es alimentado por una serie de controladores de presión multicanal, mientras que el puerto de salida está conectado a una bomba de jeringa, que mantiene 0,3 ml / min. Además, los artefactos ópticos causados por la diferencia en los índices de refracción de las soluciones de sabor se minimizaron mediante el análisis ratiométrico introduciendo un indicador insensible al calcio (tdTomato), así como el indicador de calcio (GCaMP6)¹¹. Este diseño proporcionó estabilidad microscópica de las células gustales in vivo incluso con un cambio abrupto entre canales fluídicos. En consecuencia, la μTongue implementa un cribado funcional fiable de múltiples saborantes a las papilas gustativas del ratón in vivo.

En este protocolo, los procedimientos experimentales se explican en detalle para la obtención de imágenes de calcio de las papilas gustativas fungiformes del ratón in vivo utilizando μTongue. En primer lugar, se describe la preparación de saliva artificial y soluciones sabrosas. En segundo lugar, se introduce la configuración del sistema microfluídico para lograr el flujo de estado cuasi estacionario. En tercer lugar, se delinean los procedimientos utilizados para montar la lengua del ratón en la lengua μ para permitir la adquisición de imágenes. Por último, se especifica cada paso para el análisis de imágenes, incluida la corrección de artefactos de movimiento lateral y la ratiometría. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a cualquier laboratorio de investigación con una instalación de ratón y un microscopio de dos fotones o equipo equivalente.

Protocolo

Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan y la Universidad Nacional de Seúl.

1. Preparación de soluciones: saliva artificial y saborizantes

1. Preparar saliva artificial disolviendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO₃, 3 mM KHCO₃, 0.25 mM CaCl₂, 0.25 mM MgCl₂, 0.12 mM K₂HPO₄, 0.12 mM KH₂PO₄y 1.8 mM HCl en agua destilada (>1 L), y ajustar el pH de la solución a 7 (ver Tabla de Materiales)¹².
2. Prepare saborantes, como ácidos: 10 mM de ácido cítrico; salado: 400 mM NaCl, opcionalmente con amilorida de 50 μM; dulce: 40 mM acesulfamo K; amargo: una mezcla de 5 mM de quinina, 5 mM de denatonio y 20 μM de cicloheximida, disolviendo el producto químico de sabor en la saliva artificial preparada en la etapa 1.1.

2. Preparación del sistema microfluídico

NOTA: Los tastantes se administraron a la lengua del ratón utilizando un sistema de administración fluídica multicanal presurizado (consulte la Figura 1 y la Tabla de Materiales).

1. Llene los depósitos del sistema de perfusión de flujo presurizado con saliva artificial y saborizantes.
2. Conecte la línea de aire comprimido a la entrada del regulador y ajuste la presión de aire entre 30 y 50 psi en el sistema de suministro fluídico.
3. Ajuste la presión de salida del regulador a 0,4 psi y compruebe si sale líquido del tubo bajo esta presión.
4. Conecte el colector desde los depósitos al puerto de entrada de μTongue.
5. Conecte el puerto de salida de μTongue a una bomba de jeringa y retire el líquido con ~300 μL∙min^-1 para establecer la condición de estado estacionario. Observe el volumen constante de una gota colgante debajo de la μTongue. Ajuste el valor del parámetro de ajuste en función de la altura de la muestra.
6. Desconecte la línea de aire comprimido y detenga la bomba de la jeringa hasta que se complete el paso 3 del protocolo.

3. Preparación del ratón para imágenes in vivo (Figura 2).

NOTA: Todas las preparaciones de animales se llevaron a cabo durante el día en condiciones asépticas en un banco de trabajo de laboratorio.

1. Anestesia de ratón
   1. Prepare un ratón de 7 semanas de edad o más de cualquier sexo. Use una línea de ratón modificada genéticamente que exprese proteínas de fluorescencia sensibles al calcio en las células gustales.
   2. El ratón está sujeto para la anestesia. Se inyecta una mezcla de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina por vía intraperitoneal en el^{ratón 13}.
2. TRITC-dextrano (500 kDa) en solución salina tampón de fosfato al 2,5% W/V se administra por vía intravenosa en el ratón a través de una ruta retroorbital para observar la circulación sanguínea durante una sesión de imágenes.
3. Coloque un fijador de cabeza en el cráneo del ratón para minimizar los artefactos de movimiento.
   1. La cabeza del ratón se rocía con un 70% de ETOH mientras que el ratón se coloca en posición supina. Levante la piel de la cabeza ligeramente con fórceps y recorte aproximadamente 7 mm² con tijeras.
   2. Limpie el cabello alrededor del cuero cabelludo, retire el periostio debajo de la piel, aplique un adhesivo instantáneo al cráneo y coloque un fijador de cabeza personalizado.
   3. Después de endurecer el adhesivo instantáneo, aplique pegamento dental alrededor del fijador de cabeza e ilumine con una luz azul para solidificar el pegamento dental.
4. Coloque la lengua del ratón en la unidad inferior de μTongue.
   1. Fije el labio inferior del ratón a la unidad inferior de μTongue con un adhesivo instantáneo.
   2. Coloque el ratón en la placa (tablero de preparación del ratón en la Figura 1B)y coloque la unidad inferior de la μTongue en los postes (μTongue hold post en la Figura 1B). Asegúrese de que los orificios en el borde de la unidad inferior estén alineados con el poste.
   3. Apriete el fijador de cabeza del ratón al soporte del fijador de cabeza en la placa. Luego, ajuste la distancia entre la cabeza del mouse y el dispositivo. Gire la cabeza del ratón suavemente aproximadamente 45° con el soporte fijador de cabeza. Este proceso evita el contacto físico de la nariz del ratón con el objetivo del microscopio.
   4. Dibuje la lengua del ratón suavemente con pinzas de plástico y fije el lado ventral de la lengua a la parte superior de la unidad inferior de la μTongue. Luego, limpie la superficie de la lengua del ratón con un hisopo de algodón húmedo.
   5. Remoje un pedazo de papel en la saliva artificial y colóquelo en la superficie expuesta de la lengua del ratón para mantener una condición húmeda.
   6. Coloque las arandelas curvas en los postes que sujetan ambos extremos de la parte inferior de μTongue.
5. Coloque la preparación del ratón en el escenario del microscopio. Coloque la lengua de ratón expuesta debajo del centro aproximado del área objetivo del microscopio. Asegúrese de no desviarse del rango dinámico del escenario. Luego, apriete la placa del mouse en el escenario con tornillos.
6. Coloque la almohadilla térmica debajo del cuerpo del ratón y mantenga la temperatura a 36.5 °C-37.5 °C. Controle la temperatura corporal del ratón con un sensor de temperatura y controle la temperatura de la almohadilla térmica utilizando una señal de retroalimentación del sensor de temperatura.
7. Gire un trozo delgado de papel y colóquelo en la boca del ratón para evitar que el líquido entre en la tráquea del ratón.
8. Retire el tejido húmedo de la lengua del ratón y coloque la μTongue preparada sobre la lengua del ratón. Coloque un canal microfluídico en la lengua y ajuste su posición para observar la superficie de la lengua a través de la ventana de imágenes.
9. Asegure la μTongue atornillando suavemente en ambos extremos con una presión de compresión mínima.

4. Adquisición de imágenes

1. Encienda el láser de dos fotones de 920 nm y el microscopio antes de su uso.
2. Monte el objetivo de inmersión en agua (16x, NA 0.80 o 25x, NA 1.1) en el microscopio. Deje caer el agua destilada en la ventana de imagen de la μTongue y sumerja el objetivo.
3. En el modo de cámara, encienda la luz con la lámpara de mercurio e ilumine la superficie de la lengua.
4. Al ajustar el eje Z, busque la señal autofluorescente de las papilas filiformes para encontrar el plano focal aproximado. Luego, usando la perilla de ajuste X e Y, ubique una papila gustativa.
5. Cambie al modo multifotón. Establezca las condiciones de adquisición de la imagen de la siguiente manera: longitud de onda de excitación: 920 nm; conjunto de filtros de emisión: 447/60 nm, 525/50 nm y 607/70 nm; modo de escaneo ráster bidireccional, tamaño de fotograma: 512 x 512.
6. Ajuste las posiciones X e Y para colocar la papilas gustativas en el centro de la ventana de la imagen.
7. Busque los vasos sanguíneos que rodean la papilas gustativas a aproximadamente dos tercios de altura de la papilas gustativas. Visualice la circulación sanguínea mediante la inyección de TRITC-dextrano (500 kDa) a partir del paso 3.2 del protocolo. Si el flujo sanguíneo se obstruye, afloje ligeramente los tornillos de fijación para permitir el flujo sanguíneo.
8. Ajuste el eje Z y encuentre el plano Z de la papila gustativa que contenga un número adecuado de células gustativas.
9. Proceda con imágenes de calcio con 2-6 Hz durante 80 s. Proporcione una solución de sabor de 20 s encendiendo el depósito del sistema fluídico después de que comiencen las imágenes. Después de 20 s de estimulación del gusto, cambie el reservorio de nuevo a saliva artificial.
10. Una vez finalizada la toma de imágenes secuenciales, espere unos 3-4 minutos antes de la siguiente sesión de imágenes. Mantenga la saliva artificial fluyendo a la lengua del ratón para eliminar el remanente sabroso de la sesión de imágenes anterior. Dependiendo del diseño del experimento, repita la sesión según sea necesario.
11. Cuando se completen las imágenes de calcio in vivo, eutanasiar al ratón de acuerdo con el procedimiento IACUC. El ratón bajo anestesia se sacrifica en la cámara de CO_2.
    NOTA: Compruebe la profundidad de la anestesia utilizando un reflejo de pellizco del dedo del dedo del dedo del tudo. Durante una sesión de imágenes, la saliva artificial de los reservorios debe proporcionarse de manera consistente. Si aparecen burbujas en la ventana de imagen de la μTongue, retire las burbujas empujándolas a través de la entrada o la salida de la μTongue utilizando una fuerte presión de líquido.

5. Análisis de imágenes (Figura 3)

1. Conversión de imágenes
   1. Abra los archivos de imagen sin procesar utilizando Fiji¹⁴ o un software de análisis de imágenes similar.
   2. Convierta el archivo de imagen en un archivo de pila RGB para utilizar el código NPL Bud Analyzer.
      1. Imagen > color > canales divididos
      2. Imagen > Color > Combinar canales y seleccione la imagen en el paso 5.2.1.
      3. Imagen > color > pila a RGB
2. Registro de imágenes
   Nota : utilice el código escrito personalizado para el análisis de datos. Consulte https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. Ejecute el código denominado Taste_GUI.m; aparecerá una ventana de GUI llamada NPL Bud Analyzer. Haga clic en el botón Nuevo análisis en la esquina superior derecha y, a continuación, cargue la imagen convertida del paso 5.1. Establezca la velocidad de fotogramas por encima de la imagen cargada.
   2. Dibuje la región de interés (ROI) sobre la imagen cargada para el registro. Haga doble clic en el ROI seleccionado y se iniciará un registro calculado automáticamente.
3. Obtener los cambios relativos de intensidadde fluorescencia (ΔF/F)
   1. Vuelva a la ventana NPL Bud Analyzer para mostrar automáticamente la imagen registrada del paso 5.2. Si el usuario ya tiene un archivo reg, haga clic en el botón Cargar datos y seleccione el archivo _reg.tif.
   2. Haga clic en el botón CIRCLE o POLYGON y coloque el ROI de la célula gustativa sobre la imagen de la papilas gustativas.
   3. Esto presenta la intensidad de fluorescencia en bruto y el rastro de calcio (ΔF/F)de la célula gustativa seleccionada automáticamente debajo de la imagen de la papilas gustativas.
   4. Haga clic en Guardar rastro para presentar el rastro de calcio (ΔF/F)en el lado derecho de la GUI, mientras que el ROI se muestra sobre la imagen de la papila gustativa. Repita los pasos 5.3.2-5.3.4 hasta que finalice la selección del ROI.
      NOTA: Haga clic en el botón Eliminar seguimiento si el ROI está mal seleccionado para eliminar el último ROI y el seguimiento de calcio seleccionados.
   5. Una vez finalizada la selección del ROI, escriba el nombre del archivo en la esquina inferior derecha y haga clic en el botón Finalizar para exportar el rastro de calcio ΔF/F como un formato .xls, y la imagen tase bud con ROI en un formato .bmp.
4. Análisis del rastro de calcio
   1. Analizar el rastro de calcio obtenido del paso 5.3. Considere que las células gustales han reaccionado al sabor cuando la intensidad de fluorescencia aumenta más de dos desviaciones estándar de la línea de base después de que se entrega el^{saborante 4}, y los valores de pson inferiores a 0.01, utilizando pruebas t pareadas o no emparejadas¹⁰.
   2. Considere la célula gusta gustante como una célula respondedora, si responde a un determinado sabor más de dos veces de tres ensayos (~ 60%)¹⁵.
   3. Obtenga los rastros de calcio representativos promediando los rastros de calcio individuales adquiridos a partir del paso 5.4.1.

Resultados

El ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato se utilizó para obtener una imagen de papilas gustativas. La superficie de la lengua del ratón estaba cubierta con papilas filiformes autofluorescentes. Las papilas gustativas se extienden escasamente sobre la superficie de la lengua(Figura 4A). Las imágenes de la papilas gustativas y su estructura se adquirieron utilizando tres detectores de filtro diferentes. Utilizando el conjunto de filtros de 607/70 nm, se obtuvo la señal tdTomato de las células gustales p...

Discusión

Aquí se describe un protocolo detallado para aplicar μTongue a la investigación de las actividades funcionales de las células gustativas in vivo. En este protocolo, se realiza la imagen funcional en las células gustales utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente. Además del uso de ratones transgénicos, la carga electroforética de colorantes de calcio (o colorantes sensibles al voltaje) en las células gustativas puede ser una opción alternativa.

En este experimento se u...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
acesulfamo K	Sigma Aldrich	04054-25G	Saliva artificial / solución
de cloruro de calcio	Sigma Aldrich	21115-100ML	Saliva artificial / ácido
cítrico	Sigma Aldrich	C0759-100G	Saliva artificial /
cicloheximida	Sigma Aldrich	01810-5G	Saliva artificial / tastant
denatonio	Sigma Aldrich	D5765-5G	Saliva artificial / Tastant
Pegamento dental	Denkist	P0000CJT-A2	Preparación animal
Image J	NIH	ImageJ	Análisis de datos
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Saliva artificial / saborizante
Adhesivo instantáneo	Loctite Loctite	4161, Henkel	Preparación animal
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Saliva artificial / tasant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Saliva artificial / tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Preparación animal
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Saliva artificial / tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Artificial saliva / tastant
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Análisis de datos
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Saliva artificial / tastant
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Saliva artificial / tastant
Microscopio Mutiphoton	Thorlab	Microscopio Bérgamo II
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Saliva artificial / tastant
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Saliva artificial / tastant
Objetivo	Nikon	Microscopio	N16XLWD-PF
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Control de fluidos
PC	LG	Lg15N54	control de fluidos
	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Saliva artificial / tasante
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma Aldrich	806562	Saliva artificial / Quinina Tastant
	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Saliva artificial / Bomba
jeringa	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Control de fluidos
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Preparación animal
Láser de fibra ultrarrápido	Toptica	FFultra920 01042	Microscopio
Xilacina	Bayer Corea	Rompun	Preparación animal