El artículo presenta el dispositivo μTongue (microfluídica en una lengua) para imágenes funcionales de células gustativas in vivo mediante la integración de microfluídica en una ventana de imágenes intravitales en la lengua.
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Artículo de método
μTongue: Una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica para la lengua in vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía de fluorescencia intravital es una herramienta ampliamente utilizada para estudiar la dinámica multicelular en un animal vivo. Sin embargo, no se ha utilizado con éxito en el órgano sensorial del gusto. Al integrar la microfluídica en la ventana de imágenes de la lengua intravital, la μTongue proporciona imágenes funcionales confiables de las células gustativas in vivo bajo exposición controlada a múltiples saborantes. En este documento, se presenta un procedimiento detallado paso a paso para utilizar el sistema μTongue. Hay cinco subsecciones: preparación de soluciones de sabor, configuración de un módulo microfluídico, montaje de muestras, adquisición de datos de imágenes funcionales y análisis de datos. También se presentan algunos consejos y técnicas para resolver los problemas prácticos que pueden surgir al usar la μTongue.
Introducción
El microscopio de fluorescencia intravital se utiliza ampliamente para estudiar la dinámica espaciotemporal en los tejidos vivos. Los investigadores están desarrollando rápidamente sensores codificados genéticamente que proporcionan transformaciones específicas y sensibles de los procesos biológicos en señales de fluorescencia, que se pueden registrar fácilmente utilizando microscopios de fluorescencia que están ampliamente disponibles1,2. Aunque la mayoría de los órganos internos en roedores se han investigado utilizando el microscopio, su aplicación exitosa a la lengua aún no ha tenido éxito
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Protocolo
Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan y la Universidad Nacional de Seúl.
1. Preparación de soluciones: saliva artificial y saborizantes
- Preparar saliva artificial disolviendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 mM CaCl2, 0.25 mM MgCl2, 0.12 mM K2HPO4, 0.12 mM KH2PO4y 1.8 mM HCl en agua destilada (>1 L), y ajustar el pH de la solución a 7 (ver Tabla de Materiales)12.
- ....
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Resultados
El ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato se utilizó para obtener una imagen de papilas gustativas. La superficie de la lengua del ratón estaba cubierta con papilas filiformes autofluorescentes. Las papilas gustativas se extienden escasamente sobre la superficie de la lengua(Figura 4A). Las imágenes de la papilas gustativas y su estructura se adquirieron utilizando tres detectores de filtro diferentes. Utilizando el conjunto de filtros de 607/70 nm, se obtuvo la señal tdTomato de las células gustales p.......
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Discusión
Aquí se describe un protocolo detallado para aplicar μTongue a la investigación de las actividades funcionales de las células gustativas in vivo. En este protocolo, se realiza la imagen funcional en las células gustales utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente. Además del uso de ratones transgénicos, la carga electroforética de colorantes de calcio (o colorantes sensibles al voltaje) en las células gustativas puede ser una opción alternativa.
En este experimento se u.......
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Divulgaciones
Los autores declaran intereses financieros contrapuestos: J. Han y M. Choi son inventores de la tecnología patentada μTongue descrita en este artículo, y el sistema μTongue está disponible comercialmente a través de SciTech Korea.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R015-D1), la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019M3A9E2061789) y por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019M3E5D2A01058329). Agradecemos a Eunsoo Kim y Eugene Lee su asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| acesulfamo K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Saliva artificial / solución |
| de cloruro de calcio | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Saliva artificial / ácido |
| cítrico | Sigma Aldrich | C0759-100G | Saliva artificial / |
| cicloheximida | Sigma Aldrich | 01810-5G | Saliva artificial / tastant |
| denatonio | Sigma Aldrich | D5765-5G | Saliva artificial / Tastant |
| Pegamento dental | Denkist | P0000CJT-A2 | Preparación animal |
| Image J | NIH | ImageJ | Análisis de datos |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Saliva artificial / saborizante |
| Adhesivo instantáneo | Loctite Loctite | 4161, Henkel | Preparación animal |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Saliva artificial / tasant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Saliva artificial / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Preparación animal |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Saliva artificial / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Análisis de datos |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Saliva artificial / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Saliva artificial / tastant |
| Microscopio Mutiphoton | Thorlab | Microscopio Bérgamo II | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Saliva artificial / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Saliva artificial / tastant |
| Objetivo | Nikon | Microscopio | N16XLWD-PF |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Control de fluidos |
| PC | LG | Lg15N54 | control de fluidos |
| Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Saliva artificial / tasante | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Sigma Aldrich | 806562 | Saliva artificial / Quinina Tastant |
| Sigma Aldrich | Q1125-5G | Saliva artificial / Bomba | |
| jeringa | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Control de fluidos |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Preparación animal |
| Láser de fibra ultrarrápido | Toptica | FFultra920 01042 | Microscopio |
| Xilacina | Bayer Corea | Rompun | Preparación animal |
Referencias
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
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Reimpresiones y permisos
