Montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota

Summary

Este protocolo detalla el uso de un sistema de calentamiento de temperatura controlada de retroalimentación para promover el ensamblaje de monocapas lipídicas y la formación de bicapas de interfaz de gotitas para lípidos con temperaturas de fusión elevadas, y mediciones de capacitancia para caracterizar los cambios impulsados por la temperatura en la membrana.

Abstract

El método de la bicapa de interfaz de gotitas (DIB) para ensamblar bicapas lipídicas (es decir, DIB) entre gotitas acuosas recubiertas de lípidos en aceite ofrece beneficios clave en comparación con otros métodos: los DIB son estables y a menudo duraderos, el área de la bicapa se puede ajustar reversiblemente, la asimetría de las valvas se controla fácilmente a través de composiciones de gotitas, y las redes de bicapas similares a tejidos se pueden obtener al contiguas muchas gotitas. La formación de DIBs requiere el ensamblaje espontáneo de lípidos en monocapas lipídicas de alta densidad en las superficies de las gotitas. Mientras que esto ocurre fácilmente a temperatura ambiente para los lípidos sintéticos comunes, una monocapa suficiente o bicapa estable no puede formarse en condiciones similares para los lípidos con puntos de fusión por encima de la temperatura ambiente, incluyendo algunos extractos celulares del lípido. Este comportamiento probablemente ha limitado las composiciones y quizás la relevancia biológica de los DIB en los estudios de membranas modelo. Para abordar este problema, se presenta un protocolo experimental para calentar cuidadosamente el depósito de aceite que alberga gotas dib y caracterizar los efectos de la temperatura sobre la membrana lipídica. Específicamente, este protocolo muestra cómo utilizar un accesorio de aluminio térmicamente conductor y elementos de calentamiento resistivos controlados por un bucle de retroalimentación para prescribir temperaturas elevadas, lo que mejora el ensamblaje de monocapas y la formación de bicapas para un conjunto más amplio de tipos de lípidos. Las características estructurales de la membrana, así como las transiciones de fase termotrópicas de los lípidos que componen la bicapa, se cuantifican midiendo los cambios en la capacitancia eléctrica del DIB. En conjunto, este procedimiento puede ayudar en la evaluación de fenómenos biofísicos en membranas modelo a lo largo de varias temperaturas, incluida la determinación de una temperatura de fusión efectiva(T_M)para mezclas de lípidos multicomponente. Por lo tanto, esta capacidad permitirá una replicación más cercana de las transiciones de fase naturales en las membranas modelo y fomentará la formación y el uso de membranas modelo de una franja más amplia de componentes de la membrana, incluidos aquellos que capturan mejor la heterogeneidad de sus contrapartes celulares.

Introduction

Las membranas celulares son barreras selectivamente permeables compuestas por miles de lípidos tipo^1,proteínas, carbohidratos y esteroles que encapsulan y subdividen todas las células vivas. Comprender cómo sus composiciones afectan sus funciones y revelar cómo las moléculas naturales y sintéticas interactúan, se adhieren, interrumpen y translocan las membranas celulares son, por lo tanto, áreas importantes de investigación con implicaciones de amplio alcance en biología, medicina, química, física e ingeniería de materiales.

Estos objetivos para el descubrimiento se benefician directamente de las técnicas probadas pa....

Protocol

1. Preparación del accesorio calentado

1. Reúna 2 piezas de caucho aislante de 1 mm de espesor recortadas a 25 mm x 40 mm de ancho y largo, respectivamente, 2 piezas de una goma de 6 mm de espesor que también son de 25 mm x 40 mm, un conjunto de accesorio de base de aluminio preparado y un depósito de aceite acrílico que cabe en la ventana de visualización del accesorio de base de aluminio (consulte las figuras S1, S2 y S3 para obtener detalles sobre la fabricación y una vista explotada del ensamblaje). Prepare primero el accesorio de aluminio uniendo a la parte inferior del accesorio una ventana de visualización de cubiertas de vidrio con adhe....

Results

La Figura 1 muestra cómo el accesorio de aluminio y el depósito de aceite acrílico se preparan en la etapa de microscopio para la formación de DIB. Los pasos de montaje 1.2-1.4 sirven para aislar térmicamente el accesorio del escenario para una calefacción más eficiente. Los pasos 1.5-1.7 muestran cómo conectar correctamente el termopar al accesorio y colocar el depósito de aceite, y los pasos 1.8-1.9 muestran las ubicaciones recomendadas para dispensar aceite en estos pedazos.

Discussion

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones para ensamblar y operar un sistema experimental para controlar la temperatura del aceite y las gotas utilizadas para formar DIBs. Es especialmente beneficioso para permitir la formación de DIB utilizando lípidos que tienen temperaturas de fusión por encima de RT. Por otra parte, variando con precisión la temperatura del depósito de aceite, la temperatura de la bicapa puede ser manipulada para estudiar los efectos de las temperaturas elevadas sobre diversas propiedades .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm caucho aislante (x2)	Cualquiera		Aísla la parte inferior del accesorio de aluminio de la platina del microscopio
25 mm x 40 mm x 6 mm caucho aislante (x2)	Cualquiera		Protege los elementos calefactores de daños causados por los clips de la platina del microscopio y aísla la parte superior de los elementos calefactores.
Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico	Sigma Aldrich	M3183	Agente amortiguador para solución lipídica
Sustrato acrílico	Fabricado internamente		HTD_STG_2~1000 uL pozo acrílico con un perfil exterior poka-yoke para fijar la orientación
Accesorio de aluminio	Fabricado en casa	HTD_STG_1	Accesorio base con un pozo de aceite que sostiene el accesorio acílico e incluye dos almohadillas planas adyacentes al pozo de petróleo para los elementos calefactores
Extracto de lípidos totales para el cerebro	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL extracto de lípidos porcinos
Chasis DAQ compacto (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chasis para alojar múltiples tipos de sensores, medición o módulos de salida
Sistema de Adquisición de Datos (DAQ)	Dispositivos Moleculares	Digidata 1440A	Convertidor de analógico a digital de alta resolución
Amplificador/fuente de alimentación de ganancia fija	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifica la salida de voltaje de CC desde el módulo de salida de voltaje
Cubierta de vidrio Deslizamiento	Corning	CLS284525	Sella la parte inferior de la base de aluminio y permite la caracterización óptica de la bicapa
Elemento calefactor (x2)	Omega	KHLV-101/5	Elemento calefactor kapton de película de poliamida de 25 mm x 25 mm con un límite de potencia de 5 vatios.
Tornillo de acero inoxidable M3	McMaster Carr	90116A150	Asegura el termopar al accesorio de aluminio
Amplificador de abrazadera de parche	Dispositivos moleculares	AxoPatch 200B	Mide la corriente y emite el voltaje a la cabecera
Computadora personal	Cualquier		computadora con múltiples puertos usb de alta velocidad y un mínimo de 6 Gb de RAM
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P3911	Solución electrolítica de iones disociados Módulo de
entrada de temperatura	National Instruments	NI 9211	Permite mediciones de termopar de unión abierta y fría para el chasis cDAQ
Termopar	Omega	JMTSS-020U-6	Termopar tipo U con un diámetro de 0,02 pulgadas y 6 pulgadas de largo
Adhesivo curable UV	Loctite	19739	Asegura el cubreobjetos de vidrio al accesorio de base de aluminio
Módulo de salida de voltaje	National Instruments	NI 9263	Módulo de salida de voltaje analógico para usar con el generador de forma de onda del chasis cDAQ
	Agilent	33210A	Se utiliza para emitir una forma de onda sinusoidal de 10 mV 10 Hz