Artículo de método

Imágenes tridimensionales de organoides para estudiar la ciliogénesis primaria durante la organogénesis ex vivo

DOI:

10.3791/62365

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14 de mayo de 2021

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1Univ Rennes, CNRS, IGDR (Institut de Génétique et Développement de Rennes), 2CRBM, CNRS, University Montpellier, 3CRCINA, INSERM, CNRS, Université d’Angers, Université de Nantes

En este artículo

Resumen

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Los organoides derivados de células madre facilitan el análisis de los procesos moleculares y celulares que regulan la autorrenovación y diferenciación de las células madre durante la organogénesis en los tejidos de mamíferos. Aquí presentamos un protocolo para el análisis de la biología del cilio primario en organoides mamarios de ratón.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides son estructuras tridimensionales derivadas de células madre que reproducen ex vivo la compleja arquitectura y fisiología de los órganos. Por lo tanto, los organoides representan modelos útiles para estudiar los mecanismos que controlan la autorrenovación y diferenciación de las células madre en los mamíferos, incluida la ciliogénesis primaria y la señalización ciliar. La ciliogénesis primaria es el proceso dinámico de ensamblar el cilio primario, un centro de señalización celular clave que controla la autorrenovación y/o diferenciación de las células madre en varios tejidos. Aquí presentamos un protocolo completo para la tinción de inmunofluorescencia de linaje celular y marcadores primarios de cilios, en organoides mamarios de ratón de montaje completo, para microscopía de lámina de luz. Describimos el método de imagen por microscopía y una técnica de procesamiento de imágenes para el análisis cuantitativo del ensamblaje y la longitud del cilio primario en organoides. Este protocolo permite un análisis preciso de los cilios primarios en estructuras tridimensionales complejas a nivel de una sola célula. Este método es aplicable para la tinción de inmunofluorescencia y la obtención de imágenes de cilios primarios y señalización ciliar en organoides mamarios derivados de células madre normales y modificadas genéticamente, de tejidos sanos y patológicos, para estudiar la biología del cilio primario en la salud y la enfermedad.

Introducción

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El desarrollo de los organismos pluricelulares y el mantenimiento de la homeostasis en sus tejidos adultos residen en una regulación afinada entre la autorrenovación y la diferenciación de las células madre, que orquestan en el tiempo y en el espacio el desarrollo y laregeneración normal de los tejidos. La subversión de esta regulación causa anomalías en el desarrollo y cánceres2. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares y celulares que orquestan la autorrenovación y diferenciación de las células madre es de interés clave en la biología del desarrollo y del cáncer.

El reciente desarrollo de métodos de organogénesis ex vivo, en los que las células madre de los tejidos generan organoides tridimensionales, ha transformado nuestras capacidades para estudiar la dinámica de las células madre durante la organogénesis de los mamíferos y el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos enuna placa. Los organoides representan una buena alternativa a los engorrosos modelos animales modificados genéticamente para estudiar estos procesos. En la actualidad se han desarrollado protocolos para el desarrollo de organoides a partir de células madre de tejido de muchos órganos3, incluyendo el intestino delgado y el colon, el estómago, el hígado, el páncreas, la próstata y la glándula mamaria3. Además, el desarrollo de técnicas de edición del genoma somático en células madre formadoras de organoides permite ahora interrogar rápidamente los mecanismos moleculares y celulares que controlan su biología 4,5.

El cilio primario es una estructura basada en microtúbulos que se ensambla en la superficie de las células madre y/o diferenciadas de varios tejidos6. Generalmente es inmóvil y se ensambla como una sola estructura por celda7. La ciliogénesis primaria es el proceso dinámico de ensamblaje del cilioprimario 7. En la superficie de la célula, el cilio actúa como una plataforma de señalización celular8. Por lo tanto, se cree que el cilio primario actúa como un regulador clave de la autorrenovación y/o diferenciación de las células madre en muchos tejidos, incluido el cerebro 9,10, la glándula mamaria 4,11, el tejido adiposo12 y el epitelio olfativo13, entre otros. La ciliogénesis primaria y/o la señalización ciliar están reguladas dinámicamente en distintos linajes celulares y en diferentes etapas de desarrollo 4,13,14, pero los mecanismos subyacentes aún no se han determinado en gran medida.

La organogénesis ex vivo es prometedora para el desarrollo de conocimientos básicos sobre los mecanismos moleculares y celulares que controlan la biología de las células madre, incluida la ciliogénesis primaria y la señalización ciliar. Sin embargo, se basa en la capacidad de obtener imágenes adecuadas de organoides de montaje completo a nivel de una sola célula y a escala subcelular. Recientemente utilizamos un modelo de organoide derivado de células madre mamarias de ratón para demostrar que los cilios primarios controlan positivamente la capacidad de formación de organoides de células madre mamarias de ratón4. Aquí presentamos un protocolo completo para la tinción con inmunofluorescencia de organoides mamarios de ratón de montaje completo (Figura 1A, B), que permite el análisis de cilios primarios a través de microscopía de lámina de luz durante la organogénesis ex vivo en tres dimensiones. Recientemente se han publicado métodos alternativos para la tinción con inmunofluorescencia y la obtención de imágenes de organoides mediante microscopía confocal15,16. En cambio, este protocolo se centra en la preparación y obtención de imágenes de organoides a través de la microscopía de lámina de luz.

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Protocolo

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NOTA: Se recomienda el siguiente protocolo para la tinción de organoides que se cultivaron en 5 pocillos de una placa de 96 pocillos y se agruparon (> 100 organoides). Los organoides se derivaron de células madre mamarias de ratón. Los ratones donantes fueron alojados y manipulados de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Rennes (Francia).

1. Reactivos

  1. Para preparar la solución fijadora, diluya 125 μL de solución comercial acuosa de paraformaldehído (PFA) al 16% en 375 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para generar una solución de PFA al 4%.
    PRECAUCIÓN: Manipule el PFA que es una sustancia tóxica debajo de una cubierta química.
  2. Para preparar el tampón de permeabilidad, diluya 1,5 μL de Triton X100 en 500 μL de PBS, para producir una solución de Triton X100 al 0,3%.
  3. Para preparar el tampón de bloqueo, diluya 1,5 μL de Tween-20 y 75 μL de suero de cabra normal en PBS, para generar una solución de suero de cabra al 5% y Tween 20 al 0,1%.
  4. Para preparar el medio de montaje de la lámina ligera, disuelva 1 g de agarosa ultrapura de bajo punto de fusión en 100 mL de dH20 o PBS a 65 °C. Prepare alícuotas de 1 mL y almacene a temperatura ambiente.

2. Recuperación de organoides

  1. Transfiera los organoides de los pocillos de cultivo a un tubo de polímero de baja unión de 1,7 mL, después de pipetearlos hacia arriba y hacia abajo 3 veces en los pocillos, con una punta recubierta de FBS para la cual se cortó el extremo (diámetro mínimo de la extremidad 1,5 mm).
    NOTA: El recubrimiento evita que los organoides se peguen a la punta. El material polimérico de baja unión permite reducir la adhesión de los organoides al lateral del tubo durante todo el procedimiento de tinción.
  2. Llene el tubo con PBS y gírelo a 350 x g durante 3 minutos. Retire el sobrenadante.

3. Fijación, permeabilización y bloqueo

  1. Vuelva a suspender los organoides en 500 μL de PFA al 4%. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Girar a 350 x g durante 30 s. Retire el sobrenadante.
    NOTA: A partir de este paso, vuelva a suspender los organoides en los diferentes tampones simplemente agregando los tampones en el pellet de organoides sin tocarlos. Realice todos los pasos de lavado a temperatura ambiente.
  2. Lavar los organoides con 1 mL de PBS durante 3 min. Girar a 350 x g durante 30 s. Retire el sobrenadante.
    PAUSA: Los organoides fijos pueden mantenerse en PBS a 4 °C durante al menos una semana.
  3. Permeabilizar los organoides resuspendiéndolos en 500 μL de PBS-Triton X100 0,3% e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Centrifugar los organoides a 350 g durante 30 s.
  4. Lavar los organoides resuspendiéndolos con 1 mL de PBS e incubar durante 3 min. Girar a 350 x g durante 30 s. Retire el sobrenadante. Repita una vez.
  5. Opcional: Volver a suspender los organoides en 500 μL de metanol helado. Incubar a -20 °C durante 10 min. Este paso puede ser necesario para la tinción de marcadores centrosomales específicos.
  6. Opcional (si se realizó el paso 5): Lavar los organoides con 1 mL de PBS durante 3 min. Girar a 350 x g durante 30 s. Retire el sobrenadante. Repita una vez.
  7. Bloquee los sitios de unión de anticuerpos no específicos en organoides resuspendiéndolos con 500 μL de tampón bloqueante (PBS, 5% suero de cabra, 0,1% Tween 20). Incubar 1 h y 30 min a temperatura ambiente. Girar a 350 g durante 30 s. Retire el sobrenadante.
  8. Lavar los organoides resuspendiéndolos con 1 mL de PBS e incubar durante 3 min. Girar a 350 x g durante 30 s. Retire el sobrenadante.

4. Etiquetado

  1. Vuelva a suspender los organoides con 200 μL de tampón bloqueante con anticuerpos primarios diluidos e incube durante la noche a 4 °C con una agitación suave (60 rpm en un agitador horizontal). Coloque los tubos en un ángulo de 45° con el plano horizontal del agitador. Mantendrá los organoides en la parte inferior de los tubos en el tampón de tinción.
  2. Lavar los organoides resuspendiéndolos con 1 mL de PBS e incubar durante 5 min. Girar a 350 x g durante 30 s. Retire el sobrenadante. Repita dos veces.
    NOTA: Algunos organoides en el último paso pueden adherirse al costado del tubo, lo que resulta en pérdida de organoide durante la aspiración del sobrenadante después de la centrifugación, agregar 0.2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) al PBS en los pasos de lavado puede reducir la pérdida de organoides.
  3. Volver a suspender los organoides con 200 μL de tampón bloqueante con anticuerpos secundarios e incubar durante 1 h y 30 min con una agitación leve (60 rpm en un agitador horizontal). Coloque los tubos en un ángulo de 45° con el plano horizontal del agitador. Mantendrá los organoides en la parte inferior de los tubos en el tampón de tinción.
    NOTA: Hoechst (u otros colorantes nucleares, como DAPI o DRAQ5) se pueden añadir al tampón con anticuerpos secundarios.
  4. Lavar los organoides resuspendiéndolos con 1 mL de PBS e incubar durante 5 min. Girar a 350 x g durante 30 s. Retire el sobrenadante. Repita dos veces.
    NOTA: Algunos organoides en el último paso pueden adherirse al costado del tubo, lo que resulta en la pérdida de organoides durante la aspiración del sobrenadante después de la centrifugación, agregar 0.2% (p/v) de BSA al PBS en los pasos de lavado puede reducir la pérdida de organoides.

5. Preparación de la muestra de agarosa para la obtención de imágenes

  1. Derrita el medio de montaje de la lámina ligera incubándola a 65 °C. Una vez que el medio se haya derretido, incubarlo a 37 °C durante 5 min.
  2. Vuelva a suspender los organoides en 100 μL de medio de montaje utilizando una punta de 200 μL, con la extremidad de la punta cortada (tamaño mínimo de la extremidad: 1,5 mm), pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces.
  3. Aspirar el medio de montaje con los organoides en un capilar de vidrio (capilar verde, diámetro interior: 1,5 mm) utilizando un émbolo. Incube el capilar a temperatura ambiente durante 5 minutos para que el medio de montaje se solidifique.
    PAUSA: El capilar puede almacenarse en PBS a 4 °C durante una semana antes de la toma de imágenes.

6. Imágenes

  1. Con un microscopio de lámina de luz (por ejemplo, ZEISS Lightsheet Z.1), obtenga imágenes de los organoides con objetivos de inmersión en agua de 20x o 40x.
    1. Coloque el capilar de vidrio en la cámara de observación. Localice el capilar con la cámara frontal y coloque la punta del capilar de vidrio en el límite superior del objetivo de detección.
    2. Seleccione la muestra y establezca el enfoque óptimo utilizando la punta del capilar de vidrio en iluminación de campo claro. Empuje la muestra de agarosa lentamente desde el capilar y ubique los organoides dentro de la agarosa solidificada.
    3. Mantenga los organoides que se van a obtener cerca de la punta del capilar, para reducir los movimientos de la muestra de agarosa en el PBS. Gire el capilar para establecer la orientación óptima de la muestra y definir el zoom deseado.
    4. Seleccione el modo de adquisición. Defina los canales a la imagen, establezca las orientaciones adecuadas de la hoja de luz, configure la potencia del láser para cada canal (para reducir el fotoblanqueo, use una potencia láser baja), establezca el tamaño de la imagen y los lados de iluminación deseados. Ejemplo de parámetros de imagen: Tamaño de imagen 1920 x 1920, iluminación: doble cara.
    5. Defina la pila Z a la imagen estableciendo los extremos Z de la pila utilizando el módulo Z-stack y establezca el tamaño del paso Z en óptimo.
  2. Procese el archivo de salida utilizando el módulo de procesamiento de imágenes del software del microscopio para navegar en la muestra, obtener una proyección Z y una representación en 3D.
  3. Girar la muestra y adquirir una nueva imagen desde un ángulo diferente o imagen de otros organoides.
  4. Analice imágenes con un software de análisis de imágenes de microscopía interactiva (por ejemplo, Imaris) que permita (i) la visualización de la muestra en 3D, (ii) la segmentación de objetos, (iii) la identificación y el análisis cuantitativo de objetos.

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Resultados

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Los métodos de organogénesis ex vivo están transformando nuestras capacidades para estudiar el desarrollo de tejidos de mamíferos y el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos en una placa. El análisis de los mecanismos moleculares y celulares que regulan estos procesos, incluida la ciliogénesis primaria y la señalización ciliar, se basa en la capacidad de obtener imágenes de organoides en tres dimensiones.

El protocolo descrito anteriormente permite la tinción de organoides mam...

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Discusión

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El protocolo detallado presentado aquí permite la tinción y la obtención de imágenes de organoides mamarios de ratón que crecen en medio semisólido. Este protocolo es presumiblemente aplicable a la tinción de organoides que imitan la arquitectura de varios tejidos que crecen en medios semisólidos y sólidos. Para los organoides que crecen en 100% Matrigel con medio en la parte superior, los pasos de recuperación y fijación difieren ligeramente. El medio de cultivo debe retirarse del pozo ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos a Xavier Pinson por su ayuda en el desarrollo de la microscopía de lámina ligera; el centro de biotecnología Biosit, que incluye MRic, Arche, las instalaciones centrales de citometría de flujo, y SFR Santé F. Bonamy, incluida la instalación central MicroPICell, para el soporte técnico. Este trabajo ha contado con el apoyo de la Fondation ARC, Cancéropôle Grand Ouest, Université de Rennes 1, Fondation de France. M.D. contó con el apoyo de una beca de posgrado de la Universidad de Rennes. V.J.G. contó con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación ARC.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anti-ratón IgG1 647Thermo-FisherA21240
Anti-ratón IgG2A 488Thermo-FisherA21131
Anti-conejo 546Thermo-FisherA11035
Arl13bNeuroMab73-287
EMS 16% Paraformaldehído Solución acuosa, EM GradoEM Ciencias de la Microscopía Electrónica15710
FBSThermo-Fisher10270106
gtubulinaSigma-AldrichT5326
Hoechst 33342Thermo-Fisher62249
Integrina a6Biolegend313616
Light Sheet CapilarZeiss701908
Light Émbolo de láminaZeiss701998
Low binding Tubos de microcentrífugaBioScience27210
Solución bloqueadora de suero de cabra normalLaboratorios vectorialesS-1000
PBSSigma-Aldrichp3587
de señalización de células9585
Triton-X100Sigma-AldrichT9284
Tween-20Euromedex9005-64-5
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo-Fisher16520050
Tecnología de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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