Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

Summary

Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.

Abstract

Las especies de micobacterias pueden diferir entre sí en la tasa de crecimiento, la presencia de pigmentación, la morfología de la colonia mostrada en los medios sólidos, así como otras características fenotípicas. Sin embargo, todas tienen en común el carácter más relevante de las micobacterias: su pared celular única y altamente hidrofóbica. Las especies de micobacterias contienen un complejo unido a la membrana covalente que incluye arabinogalactano, peptidoglicano y cadenas largas de ácidos micólicos con tipos que difieren entre las especies de micobacterias. Además, las micobacterias también pueden producir lípidos que se localizan, no unidos covalentemente, en sus superficies celulares, como los dicicocerosatos de fteocerol (PDIM), los glicolípidos fenólicos (PGL), los glicopptidolípidos (GPL), las aciltrehalosas (AT) o los narizidos de fosfatidil-inositol (PIM), entre otros. Algunos de ellos se consideran factores de virulencia en micobacterias patógenas, o lípidos antigénicos críticos en la interacción huésped-micobacterias. Por estas razones, existe un interés significativo en el estudio de los lípidos micobacterianos debido a su aplicación en varios campos, desde la comprensión de su papel en la patogenicidad de las infecciones por micobacterias, hasta una posible implicación como agentes inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades infecciosas y otras patologías como el cáncer. Aquí, se presenta un enfoque simple para extraer y analizar el contenido total de lípidos y la composición de ácido micólico de las células de micobacterias cultivadas en un medio sólido utilizando mezclas de solventes orgánicos. Una vez obtenidos los extractos lipídicos, se realiza cromatografía de capa fina (TLC) para monitorizar los compuestos extraídos. El experimento de ejemplo se realiza con cuatro micobacterias diferentes: mycolicibacterium brumae y Mycolicibacterium fortuitum de rápido crecimiento ambiental, el bacilo atenuado de crecimiento lento Mycobacterium bovis Calmette-Guérin (BCG) y el patógeno oportunista de rápido crecimiento Mycobacterium abscessus, lo que demuestra que los métodos mostrados en el presente protocolo se pueden utilizar para una amplia gama de micobacterias.

Introduction

Mycobacterium es un género que comprende especies patógenas y no patógenas, caracterizadas por tener una pared celular altamente hidrofóbica e impermeable formada por sus peculiares lípidos. Específicamente, la pared celular micobacteriana contiene ácidos micólicos, que son ácidos grasos α-alquilo y β-hidroxi, en los que la rama α es constante en todos los ácidos micólicos (excepto en la longitud) y la cadena β, llamada cadena de meromycolate, es una cadena alifática larga que puede contener diferentes grupos químicos funcionales descritos junto con la literatura (α-, α'-, metoxi-, metoxi-, κ-, epoxi-, carboxi-, y ω-1-metoxi-micolatos), produciendo así siete....

Protocol

1. Extracción del total de lípidos no ligados a covalentes de micobacterias (Figura 1)

1. Rasque 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y agréguelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE). Añadir una solución compuesta por 5 ml de cloroformo y 10 ml de metanol (cloroformo:metanol, 1:2).
   NOTA: Cuando se utilizan disolventes orgánicos, solo se debe usar un recipiente de vidrio. No se permiten envases de plástico. Además, se necesitan tapones de rosca de revestimiento de PTFE para botellas.
   PRECAUCIÓN: El cloroformo es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente pel....

Results

Con el objetivo de mostrar una amplia gama de lípidos presentes en diferentes especies de micobacterias, se seleccionó M. bovis BCG por tratarse de micobacterias rugosas y de crecimiento lento. En el procedimiento se añadieron M. fortuitum y M. brumae rugosas y de rápido crecimiento y, finalmente, también se incluyó el morfotipo liso de M. abscessus. Estas cuatro especies nos permiten visualizar un amplio espectro de lípidos derivados de micobacterias como aciltrehalosas (AT), GGL, PD.......

Discussion

Se presenta un protocolo simple considerado como el método estándar de oro para la extracción de compuestos lipídicos no unidos covalentemente de la pared celular micobacteriana. Se muestra una visualización adicional por TMIC unidimensionales y bidimensionales de los lípidos extraídos de cuatro micobacterias diferentes.

Dos mezclas combinadas consecutivas de cloroformo y metanol para recuperar el contenido lipídico de las células micobacterianas es la mezcla de disolventes más utilizada

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido acético Merck		100063	PRECAUCIÓN. Anhidro para análisis EMSURE® ACS, ISO, Reag. ph eur
acetona	carlo erba	400971N	PRECAUCIÓN. ACETONA RPE-ACS-ISO PARA ANALYS ml 1000
Anthrone	Merck	8014610010	Anthrone para síntesis.
Benceno	, Carlo Erba		426113 PRECAUCIÓN. Benceno RPE - Para análisis - ACS 2,5 l
Tubo de vidrio capilar	Merck	BR708709	BRAND®   desechable BLAUBRAND®   micropipetas, Cloroformo intraMark
Carlo	Erba	412653	PRECAUCIÓN. Cloroformo RS - Para HPLC - Grado isocrático - Estabilizado con etanol 2,5 L
Calentador de bloque seco	J.P. Selecta	7471200
Diclorometano	Carlo Erba	412622	PRECAUCIÓN. Diclorometano RS - Para HPLC - Grado isocrático - Estabilizado con amileno 2,5 L
Éter dietílico	Carlo Erba	412672	PRECAUCIÓN. Éter dietílico RS - Para HPLC - Grado isocrático - No estabilizado 2,5 L
Acetato de etilo	Panreac	1313181211	ATENCIÓN. El acetato de etilo (Reag. USP, Ph. Eur.) para el análisis, ACS, ISO
Alcohol etílico absoluto	Carlo Erba	4146072	PRECAUCIÓN. Etanol absoluto anhidro RPE - Para análisis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Embudo de vidrio	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
Tubo de vidrio	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	Tubo de vidrio con tapón de PTFE recuperado
Metanol	Carlo Erba		412722 ATENCIÓN. Metanol RS - Para HPLC - ORO - Grado ultragradiente 2,5 L
Hidrato de ácido molibdatofosfórico	Merck	51429-74-4	ATENCIÓN.
Reactivo de aerosol azul de molibdeno, 1.3%	Sigma	M1942-100ML	PRECAUCIÓN.
n-hexano	Carlo Erba		446903 PRECAUCIÓN. n-Hexano 99% RS - ATRASOL - Para análisis de trazas 2.5 L
n-nitroso-n-metilurea	Sigma	N4766	PRECAUCIÓN
Plataforma de agitación orbital	DDBiolab 995018		NB-205L incubadora de agitación de sobremesa
Éter de petróleo (60-80º C)	Carlo Erba	427003	PRECAUCIÓN. Éter de petróleo 60 - 80° C RPE - Para análisis 2,5 L
Pulverizador	VidraFOC	712/1
Sulfato de sodio anhidro	Merck	238597
Ácido sulfúrico 95-97%	Merck	1007311000	ATENCIÓN. Cámara de ácido sulfúrico 95-97%
TLC	Merck	Z204226-1EA	Tanques de desarrollo TLC rectangulares, L y tiempos completos; H y tiempos; W 22 cm y veces; 22 cm y tiempos; Placa TLC de 10 cm
	Merck	1057210001	TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
Calentador de placas TLC	CAMAG	223306	CAMAG Calentador de plataforma TLC III
Tolueno	Carlo Erba	488551	ATENCIÓN. Tolueno RPE - Para análisis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
Vortex	Fisher Scientific	10132562	IKA  Agitador IKA vó rtex 3
1-naftol	Sigma-Aldrich	102269427	PRECAUCIÓN.