En este protocolo, presentamos los procedimientos experimentales de un ensayo de propagación celular que se basa en microscopía de células vivas. Proporcionamos una herramienta computacional de código abierto para la segmentación imparcial de células etiquetadas fluorescentemente y análisis cuantitativos de dinámicas de lamellipodia durante la propagación celular.
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Artículo de método
Análisis cuantitativo de la dinámica del borde celular durante la propagación celular
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En este artículo
Resumen
Resumen
La propagación celular es un proceso dinámico en el que una celda suspendida en medios se adhiere a un sustrato y se aplana de una forma redondeada a una forma delgada y dispersa. Después del apego de sustrato celular, la célula forma una fina lámina de lamellipodia que emana del cuerpo celular. En la lamellipodia, los monómeros de actina globular (G-actin) polimerizan en una densa malla de actina filamentosa (F-actin) que empuja contra la membrana plasmática, proporcionando así las fuerzas mecánicas necesarias para que la célula se propague. En particular, los actores moleculares que controlan la polimerización de actina en lamellipodia son esenciales para muchos otros procesos celulares, como la migración celular y la endocitosis.
Dado que las células de dispersión forman lamellipodia continua que abarca toda la periferia celular y se expanden persistentemente hacia afuera, los ensayos de propagación celular se han convertido en una herramienta eficiente para evaluar la cinética de las protuberancias lamellipodiales. Aunque se han desarrollado varias implementaciones técnicas del ensayo de propagación celular, actualmente falta una descripción detallada del flujo de trabajo, que incluiría tanto un protocolo paso a paso como herramientas computacionales para el análisis de datos. Aquí, describimos los procedimientos experimentales del ensayo de propagación celular y presentamos una herramienta de código abierto para el análisis cuantitativo e imparcial de la dinámica del borde celular durante la propagación. Cuando se combina con manipulaciones farmacológicas y/o técnicas de silenciamiento de genes, este protocolo es apto para una pantalla a gran escala de jugadores moleculares que regulan las protuberancias lamellipodiales.
Introducción
Las protuberancias lamellipodiales son estructuras citoesqueléticos prominentes formadas en la parte delantera de una célula migratoria. En lamellipodia, la polimerización de actina con la ayuda del complejo Arp2/3 y las fímínas crea una malla actin ramificada de rápido crecimiento que empuja contra la membrana plasmática1,2. La fuerza de empuje generada por el trabajo de malla actin impulsa físicamente la celda hacia adelante1,3,4,5. El agotamiento del complejo Arp2/3 o la interrupc....
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Protocolo
1. Siembra celular
NOTA: El protocolo de propagación celular descrito se realizó utilizando fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que expresan PH-Akt-GFP (un marcador fluorescente para PIP3/PI(3,4)P2). Esta línea celular fue generada mediante la integración genómica de una construcción de expresión para PH-Akt-GFP (Addgene #21218) mediante la edición de genes mediados por CRISPR. Sin embargo, otros marcadores fluorescentes que se expresan de forma transitoria o integrado en el genoma también se pueden utilizar en este ensayo. Para una segmentación óptima de la imagen, recomendamos utilizar marcadores fluorescentes que....
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Resultados
El protocolo anterior describe los procedimientos experimentales para la toma de imágenes de células vivas de células de dispersión y una herramienta computacional para el análisis cuantitativo de la dinámica de propagación celular. La herramienta computacional se puede utilizar en un formato de bajo o alto rendimiento para identificar los reproductores moleculares que regulan la maquinaria de polimerización actin en el borde de ataque celular.
La representación esquemática de los procedimient.......
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Discusión
El ensayo de propagación celular descrito permite el seguimiento continuo de los cambios morfológicos(por ejemplo, el tamaño y la forma de la célula) y los movimientos del borde celular(es decir, la velocidad de protuberancia y la frecuencia de retracción), que son características que faltan en la mayoría de los protocolos de propagación celular19,24. Si bien los ensayos de propagación de células de punto final utilizados comúnmente permiten la .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Premio Connaught Fund New Investigator a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subvenciones RGPIN-2015-05114 y RGPIN-2020-05881), University of Manchester y University of Toronto Joint Research Fund, y University of Toronto XSeed Program.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina (0,05%), 0,53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Placa de Petri, Poliestireno, Tratada TC, Ventilada | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL Tubo de Centrífuga PP de Alta Claridad, Fondo Cónico, con Sello de Cúpula Tapón de rosca, | Falcon | 352097 | |
| 1 pocillo Chamlide CMS para cubreobjetos de 22 mm x 22 mm | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| Plato de cultivo celular de fácil agarre con tratamiento TC de 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tubo de centrífuga de 50 ml, transparente, | nido | 602002 | |
| placas de cultivo celular de 6,0 cm tratadas para aumentar la fijación celular, estériles | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Inhibidor del complejo I, CK-666 | 182515 | Millipore Sigma | |
| , Prime 95B-25MM | Fotometría | ||
| Dimetilsulfóxido, Estéril | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4,5 g/L Glucosa, con L-Glutamina, Piruvato de Sodio y Rojo Fenol | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, Rojo Sin Fenol | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Suero fetal bovino | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Proteína purificada de fibronectina en plasma humano 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Aceite de inmersión | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamina Solución (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cubreobjetos, Cuadrado, Nº 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| , CFI Plan Apo Lambda 60X Aceite | Nikon | MRD01605 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma | P4333 | |
| Disco giratorio, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubadora | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prisma | Pinzas GraphPad | ||
| , Estilo 2 | Ciencias de Microscopía Electrónica | 78326-42 |
Referencias
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T.
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Reimpresiones y permisos
