Preparación y caracterización de microburbujas dirigidas

Resumen

El objetivo de este protocolo es preparar, purificar y caracterizar microburbujas llenas de gas (agentes de contraste dirigidos para la obtención de imágenes moleculares por ultrasonidos). Se describen dos sistemas de dirección: burbujas biotiniladas adheridas a la estreptavidina y microburbujas cíclicas de péptidos RGD que se unen a α_{vβ 3}, un conocido biomarcador de neovasculatura tumoral.

Resumen

La selección de microburbujas (agentes de contraste de ultrasonido para imágenes moleculares) se ha investigado durante más de dos décadas. Sin embargo, los métodos de preparación de microburbujas y de fijación de ligandos dirigidos son engorrosos, complicados y largos. Por lo tanto, es necesario simplificar el procedimiento de preparación de microburbujas para acercarlo a la traslación clínica. El propósito de esta publicación es proporcionar una descripción detallada y una explicación de los pasos necesarios para la preparación de microburbujas específicas, la caracterización funcional y las pruebas. Se presenta una secuencia de los procedimientos optimizados y simplificados para dos sistemas: un modelo de par de biotina-estreptavidina dirigido y un péptido RGD cíclico dirigido a la proteína recombinante α_{vβ 3}, que se sobreexpresa en el revestimiento endotelial de la neovasculatura tumoral.

Aquí, mostramos lo siguiente: acoplamiento covalente del ligando objetivo a un anclaje lipídico, evaluación de la calidad del reactivo y pruebas que confirman la finalización exitosa de la reacción; preparación del medio precursor acuoso que contiene los componentes de la cubierta de microburbujas, seguida de la preparación de microburbujas por amalgamación; evaluación de la eficacia de la transferencia de lípidos a la cubierta estabilizadora de microburbujas; ajuste de la distribución del tamaño de las microburbujas mediante flotación a la gravedad normal para eliminar las microburbujas más grandes que podrían ser perjudiciales para el uso in vivo; evaluación de la distribución del tamaño de las microburbujas mediante detección de electrozonas; evaluación de la unión dirigida de las microburbujas a la superficie recubierta de receptores en una prueba de ensayo de unión estática (en una placa invertida); y la evaluación de la unión dirigida de las microburbujas a la superficie recubierta del receptor en una prueba de cámara de flujo de placa paralela.

Introducción

Las imágenes moleculares con microburbujas dirigidas han estado en investigación y pruebas durante más de dos décadas. El concepto general es sencillo: se inyectan por vía intravenosa microburbujas llenas de gas que poseen afinidad selectiva con el biomarcador molecular específico del endotelio vascular en el área de la enfermedad. Estas partículas circulan y se acumulan en el objetivo (por ejemplo, la neovasculatura tumoral o el área de lesión inflamatoria isquémica). A continuación, las microburbujas adherentes se detectan mediante ecografía de contraste. Los primeros esfuerzos de investigación conceptual del siglo pasado ^1,2 están progresando gradualmente hacia la adopción clínica: han alcanzado la etapa de ensayo clínico de escala media hace solo unos años ^3,4. El propósito de este manuscrito es proporcionar una explicación detallada sobre la preparación y caracterización de dichas microburbujas dirigidas, a partir de dos ejemplos publicados ^1,5.

El procedimiento para la preparación de péptido-PEG-fosfolípido, un componente crucial para la formulación de estas microburbujas dirigidas, se complementa con la descripción del control de calidad del reactivo, según sea necesario para la finalización exitosa de la reacción. Desafortunadamente, algunos proveedores de reactivos lipídicos de éster activo proporcionan material que se hidroliza a su llegada y, por lo tanto, no puede participar en la formación de un enlace amida. Se proporciona la información sobre la cantidad de material lipídico que se transfiere a la cubierta de microburbujas desde el medio acuoso durante la preparación de las microburbujas, así como la técnica para obtener esta información.

Es importante preparar microburbujas con una distribución de tamaño de partícula relativamente estrecha: la copresencia de microburbujas grandes en el medio inyectable para las pruebas intravasculares in vivo puede provocar la obstrucción de la microvasculatura; La acumulación inespecífica de microburbujas que evitan las derivaciones pulmonares podría causar un realce tisular inespecífico falso positivo⁶, que se evita mediante la eliminación de microburbujas de mayor tamaño. Por lo tanto, se presenta un procedimiento simple para lograr la selección del tamaño de partícula, complementado con la descripción de un método para evaluar la concentración de partículas y la distribución del tamaño con un contador de partículas.

El primer protocolo de prueba para la evaluación de la selección de microburbujas, que se presenta a continuación, describe un sistema puramente modelo, con microburbujas biotiniladas dirigidas a la superficie recubierta de estreptavidina¹. El segundo protocolo se basa en un manuscrito que describe la preparación simplificada de microburbujas dirigidas a péptidos, decoradas con un péptido RGD cíclico que posee afinidad específica hacia α_{vβ 3}, un biomarcador molecular de la neovasculatura^{tumoral 5}. Se ha demostrado que las microburbujas decoradas con este cíclico, es decir, el péptido c(RGDfK) mediante la técnica presentada, se dirigen a la neovasculatura tumoral y logran imágenes moleculares de ultrasonido en un modelo de tumor murino.

Protocolo

1. Acoplamiento covalente del péptido al NHS-PEG-DSPE

1. Disuelva el péptido c(RGDfK) con el ε-aminogrupo primario de la lisina sin protección y disponible para el acoplamiento, en dimetilsulfóxido (DMSO, 10 mg/mL). Prepare una solución de metanol o cloroformo de éster de N-hidroxisuccinimida de poli(etilenglicol)-3400-distearoyl fosfatidiletanolamina (NHS-PEG-DSPE, 200 mg/mL) y agregue hasta 1 mg de péptido en DMSO. Añadir 3 μL de N,N-diisopropil etilamina (DIPEA).
   1. Mantenga una proporción de péptidos a molares NHS-PEG-DSPE de al menos 1:1,2, para que todos los grupos amino primarios puedan reaccionar. Mantenga una proporción molar DIPEA:péptido de al menos 2:1 para asegurar las condiciones básicas del medio.
      PRECAUCIÓN: El cloroformo, el metanol y el DIPEA son materiales peligrosos. Use la protección adecuada, como guantes, bata de laboratorio, gafas y capucha de gases.
      NOTA: Se puede usar cualquier otro péptido o mimético con un grupo amino primario en lugar de c(RGDfK), con N-terminal desprotegido o una lisina ubicada fuera del sitio de unión. Para que la reacción continúe, todos los componentes (es decir, el ligando objetivo y el lípido) deben ser solubles en una mezcla de DMSO y cloroformo. También se pueden probar solventes alternativos, como la dimetilformamida o sus mezclas. También es posible la reacción en medios acuosos, pero el rendimiento de acoplamiento será mucho menor debido a la rápida hidrólisis del éster activo.
2. Después de la incubación nocturna a temperatura ambiente, elimine el material orgánico volátil por evaporación (use una corriente de gas nitrógeno o un evaporador rotativo, seguido de una evaporación nocturna bajo una bomba de alto vacío, para eliminar el DMSO). Vuelva a disolver el residuo no volátil en cloroformo a 1 mg/mL para un muestreo controlado.
3. Confirme la finalización de la reacción mediante cromatografía en capa fina (revele placas TLC en medios solventes de cloroformo: metanol, 2:1 v/v). Confirme la presencia o ausencia del grupo amino primario con ninhidrina en aerosol al calentar la placa en un bloque calefactor a 150 °C.
   PRECAUCIÓN: La ninhidrina es un material peligroso. Utilice la protección adecuada, como se ha descrito anteriormente. El tratamiento del bloque calefactor de las placas TLC debe realizarse en una campana extractora. El bloque calefactor es un peligro potencial de incendio.
4. Antes de la preparación de la microburbuja, alícuota una muestra de péptido-PEG-DSPE de cloroformo (por ejemplo, 1 mL de solución de 1 mg/mL), evapore el cloroformo hasta la sequedad en una corriente de gas nitrógeno, con la posterior incubación con bomba de alto vacío, y agregue solución salina a 1 mg/mL, para lograr una solución micelar transparente.
   1. Si es deseable una mayor purificación de la mezcla de reacción, vuelva a disolver en solución salina normal. A continuación, someter la mezcla micelar resultante a diálisis (corte de peso molecular de 6-8 kDa, o similar), primero contra solución salina normal y, a continuación, contra varios cambios de agua desionizada.
   2. Confirme la finalización de la diálisis mediante un control de la conductividad del dializado. Retire el material dializado de la bolsa de diálisis, colóquelo en un vial con masa conocida y liofilicelo hasta que se seque por completo.
      NOTA: Existe una reacción covalente alternativa para unir el ligando al extremo del lípido PEG (por ejemplo, una reacción de maleimida-PEG-DSPE con ligando tiol). La principal ventaja de este enfoque es el acoplamiento orientado, si se dispone de un solo tiol en la molécula del ligando ⁷. La principal preocupación es la estabilidad a largo plazo: el vínculo resultante entre la maleimida y el tiol puede ser propenso a la degradación por una reacción retro-Michael, dependiendo de las condiciones de almacenamiento ⁸.
      NOTA: La calidad de los reactivos de éster activo varía mucho de un fabricante a otro: puede depender de las condiciones de transferencia y almacenamiento (si el material no se almacena o transporta correctamente, el éster activo se hidrolizará y no podrá acoplarse con el péptido). En consecuencia, existe un sentimiento de obligación de describir un procedimiento (véase más adelante) para la determinación del grado de degradación de NHS-PEG-DSPE, un reactivo para la unión covalente de ligandos dirigidos a las microburbujas. El NHS-PEG-DSPE, suministrado en forma de polvo seco bajo argón, se almacena en congelador. Un vial se lleva a temperatura ambiente (para evitar la condensación de humedad), se pesa una muestra, utilizando una balanza analítica, y se disuelve en metanol o DMSO. Un vial con reactivo seco a granel debe cerrarse bajo argón y devolverse a la congelación, en un recipiente sellado con desecante, hasta su uso posterior.
   3. Preparar una solución micelar acuosa de péptido-PEG-DSPE (Paso 1.4), así como biotina-PEG-DSPE, mediante la simple adición de reactivo seco a solución salina acuosa e incubación. Se forman pequeñas micelas esféricas. Para acelerar la transferencia del reactivo del estado a granel a la forma micelar, se puede aplicar la sonicación y el baño de agua caliente.
5. Evalúe la calidad del reactivo del éster activo NHS-PEG-DSPE.
   1. Confirme que el NHS presente en el reactivo se encuentra en forma de éster activo, para poder realizar la reacción de acoplamiento con la formación de enlaces amida.
   2. Coloque 0,99 mL de tampón tetraborato de sodio 0,1 M, pH 9,2, en una cubeta de cuarzo o plástico transparente a los rayos ultravioleta (no de vidrio) en un espectrofotómetro, y ponga a cero a una longitud de onda de 260 nm.
   3. Añadir a la cubeta 10 μL de la solución recién preparada de 200 mg/mL de NHS-PEG-DSPE en metanol. Al mismo tiempo, pon en marcha el cronómetro. Mezcle rápida y vigorosamente el contenido de la cubeta para lograr uniformidad. Coloque la cubeta en el fotómetro, cierre la tapa e inicie la medición.
   4. Al comienzo de la medición del espectrofotómetro, marque la hora del inicio del registro y realice continuamente mediciones fotométricas de absorbancia a 260 nm cada 10 s durante ~ 10 minutos, o hasta la estabilización del valor de absorbancia.
   5. Traza la curva cinética, comprueba los puntos de tiempo iniciales A₂₆₀ y extrapola la curva a la hora de inicio de la reacción (es decir, averigua A₂₆₀ en el punto en el que se añadió el reactivo al tampón acuoso y ha comenzado la reacción de hidrólisis). Supongamos que antes de la adición de NHS-PEG-DSPE al tampón en la cubeta, no se había producido ninguna hidrólisis en el disolvente orgánico debido a la falta de agua.
   6. Calcule la relación entre A₂₆₀ al comienzo de la reacción y al finalizar la hidrólisis; Representa la fracción del éster activo degradado. Utilice esta información para seleccionar la cantidad adecuada de NHS-PEG-DSPE para la modificación completa del grupo amino primario del péptido.

2. Preparación de microburbujas por amalgamación

1. Preparación de microburbujas biotiniladas
   1. Disuelva conjuntamente la distearoyl fosfatidilcolina (DSPC) y el estearato PEG en propilenglicol (PG, concentración de 10 mg/mL para cada uno en disolvente puro). Utilice un baño de agua caliente para solubilizar los materiales.
   2. Añadir 0,1 mL de esta solución caliente de PG a un vial que contenga 0,85 mL de solución salina normal caliente, mezclar rápidamente y añadir biotina micelar-PEG-DSPE (50 μL, 1 mg/mL en solución salina) en una proporción de masa de 1:20 a DSPC.
      NOTA: La solubilidad de los componentes lipídicos en PG depende de la temperatura, por lo que es necesario un baño de agua caliente. Es útil calentar el vial de vidrio que contiene solución salina en un baño de agua caliente antes de la adición de lípidos, para crear un medio uniforme sin partículas visibles.
   3. Lleve el vial a temperatura ambiente, coloque un tapón de goma en el vial, inserte hasta la mitad e inserte el tubo capilar de PTFE en el vial. Utilice el flujo de gas decafluorobutano para llenar el vial y luego cierre el tapón, mientras retira el capilar.
      NOTA: La temperatura del vial durante la amalgamación puede tener un efecto significativo en la distribución del tamaño de las microburbujas resultantes ⁹.
   4. Engarce el frasco tapado, a temperatura ambiente, y colóquelo en un aparato amalgamador. Inicie el amalgador. La unidad clínica utilizada está preconfigurada para funcionar a 4300 rpm durante 45 segundos.
   5. Cuando se complete la amalgama, retire el vial con las microburbujas resultantes del amalgamador. Preferiblemente, caracterice la distribución y composición del tamaño de las microburbujas y utilícelas varias horas después de la preparación.
2. Preparación de microburbujas decoradas con péptidos
   1. Disuelva conjuntamente DSPC y estearato de PEG en PG puro (concentración de 10 mg/mL para cada material). Use un baño de agua caliente para solubilizar. Añadir 0,1 mL de esta solución caliente en PG a un vial que contenga 0,85 mL de solución salina normal caliente, mezclar rápidamente y añadir péptido micelar-PEG-DSPE (50 μL, 1 mg/mL en solución salina) añadido en una proporción de masa de 1:20 a DSPC.
   2. Lleve el vial a temperatura ambiente, coloque un tapón de goma en la parte superior del vial, insertado hasta la mitad, e inserte un tubo capilar de politetrafluoroetileno (PTFE) en el vial. Utilice el flujo de gas decafluorobutano para llenar el vial y luego cierre el tapón, mientras retira el capilar.
   3. Engarce el frasco tapado y colóquelo en un amalgamador para mezclar. El vial con dispersión de microburbujas está listo en 45 s.
3. Preparación de microburbujas lipídicas de colorante para la evaluación de la transferencia de lípidos a la cubierta de la microburbuja
   1. Disuelva conjuntamente DSPC y estearato de PEG en PG puro, como se describe anteriormente (use un baño de agua caliente) (concentración de 10 mg/mL para cada material).
   2. Añadir 0,1 mL de esta solución caliente de PG a un vial con 0,89 mL de solución salina normal caliente, mezclar rápidamente, añadir 10 μL de solución de colorante DiI (1 mg/mL en PG puro) y mezclar. Lleve el vial a temperatura ambiente.
   3. Llene el espacio de cabeza del vial con gas decafluorobutano como se indicó anteriormente, tape el vial, engarce y amalgamante como se describe anteriormente.

3. Pruebe la transferencia de lípidos DiI desde el medio acuoso micelar a la cubierta de la burbuja

1. Para la confirmación microscópica de que el material lipídico fluorescente se ha transferido del medio acuoso a la cubierta de la microburbuja, tome una muestra de una alícuota de microburbujas del vial a través del tabique con una jeringa de insulina.
   1. A continuación, añade una gota a un portaobjetos de cristal y cúbrelo con un cubreobjetos estándar. Primero diluirlo con una gota de solución salina desgasificada.
   2. Realice microscopía con un microscopio de video, equipado con una epiiluminación de fluorescencia, un objetivo de aceite 100x y una cámara de video de alta sensibilidad.
2. Para determinar la eficacia de la transferencia de material lipídico desde el medio acuoso de solución salina/PG a la cubierta de burbujas durante la amalgamación, tome un vial sellado de microburbujas, inviértalo y colóquelo en un tubo cónico de 50 ml.
   1. Realice la centrifugación en un rotor de cangilón (10 min, 200 x g). Retire el vial de la centrífuga y manténgalo invertido.
   2. Inserte una aguja de una jeringa de insulina en el tabique del vial invertido. Aspire lentamente un pequeño volumen (~50 μL) de infranadante transparente.
      NOTA: La punta biselada de la aguja para la aspiración de infranadante desde el vial invertido después de la centrifugación debe ubicarse lo más cerca posible del tabique, para minimizar las posibilidades de ingesta de microburbujas.
3. Coloque las muestras de infranadante (2 μL), así como las muestras del medio lipídico-PG-salino original que se utilizó para generar microburbujas (2 μL) en una placa de 96 pocillos con 0,1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS):medio etanol 1:1 con Triton X-100 al 1%.
4. Mida la fluorescencia roja del colorante DiI (excitación de 555 nm, emisión de 620 nm) con un lector de microplacas de fluorescencia.
   1. Utilice placas negras con fondo no transparente para la espectroscopia de fluorescencia debido al fondo más bajo y la falta de transferencia de señal entre pocillos, lo que puede convertirse en un problema para las placas transparentes.
   2. Asegúrese de que la señal de fluorescencia esté dentro del rango de calibración lineal: una concentración excesiva de colorante en los pocillos puede provocar una atenuación de la luz y una señal infrainformada.
      NOTA: A veces puede ser conveniente eliminar el material residual de la cáscara que permanece en el medio acuoso después de la amalgamación. Para hacer esto, después de la centrifugación por flotación con microburbujas, extraiga todo el volumen del infranadante por aspiración lenta del vial invertido y reemplácelo por solución salina normal desgasificada. Para evitar un cambio excesivo de la presión ambiental en el vial debido a la extracción o adición de líquido, inserte una aguja larga adicional en el tabique para llegar a la fase gaseosa dentro del vial. Para mantener la fase gaseosa dentro del vial, primero, conecte la aguja a una jeringa llena de gas fluorocarbono, para evitar el contacto del aire con la preparación de microburbujas.

4. Ajuste de la distribución del tamaño de las microburbujas

1. Utilice la flotación por gravedad normal en un vial estático invertido para ajustar la distribución del tamaño de las microburbujas, es decir, para eliminar las microburbujas más grandes de forma rápida y eficaz ^5,10.
2. Tome un vial de microburbujas inmediatamente después de la preparación, tal como se describe en la sección 2. Invierta y colóquelo boca abajo sobre una superficie estable que no vibre durante 15-20 minutos.
3. Después de esta incubación, inserte una aguja de jeringa de insulina en el tabique del vial, mientras aún está invertida, y recoja suavemente 300-500 μL de microburbujas de la capa inferior.
   NOTA: La aguja de la jeringa debe permanecer cerca de la superficie interna del tabique para evitar la acumulación de burbujas más grandes presentes más cerca de la parte superior del líquido en el vial.
   1. Tire lentamente del émbolo de la jeringa para evitar la turbulencia y la expansión hidrostática de las burbujas en el cuerpo de la jeringa. Cuando la muestra recolectada se saque de la jeringa, evite la sobrepresión para evitar el colapso de las burbujas.
4. Transfiera la dispersión de microburbujas de la jeringa a un vial de pequeño volumen. A continuación, llene con gas perfluorado, tapón y engarzado, para el almacenamiento a corto plazo, el recuento de partículas (ver más abajo) y el uso posterior.
   1. Si el muestreo se realiza directamente desde la jeringa, manténgala horizontalmente y gírela para evitar la flotación de burbujas y lograr la uniformidad de la muestra.

5. Evaluación de la distribución del tamaño de las microburbujas

1. Utilice un contador de partículas (basado en el principio de detección de electrozona u oscurecimiento de la luz) para evaluar la distribución y la concentración del tamaño de las partículas. Alternativamente, use un hemocitómetro y un microscopio.
   1. Brevemente, agregue una alícuota de muestra de microburbujas en solución salina normal o isotono en una cámara de mostrador (por lo general, volumen de 60-100 mL) y cuente. Compare las distribuciones del tamaño de las microburbujas antes y después de la purificación por flotación.
      NOTA: Someta el vial a una mezcla suave (no a vórtice) inmediatamente antes de la toma de muestras, para lograr mediciones representativas y reproducibles. Muestra del centro del volumen ensayado.
   2. Llene un vaso de precipitados de 100 ml con al menos 60 ml de diluyente de solución salina al 0,9 % y colóquelo en la platina del instrumento emisor de electrozona. Levante la etapa para que el tubo, la placa de electrodo exterior y el agitador estén completamente sumergidos en el diluyente y el agitador pueda girar.
      NOTA: El volumen del diluyente en el vaso de precipitados se puede determinar con precisión utilizando su masa, con una escala (la densidad salina es cercana a 1). Alternativamente, se puede utilizar una bomba dosificadora. Los electrodos durante el estudio de detección de electrozona deben estar completamente sumergidos.
   3. Registre el volumen de electrolito diluyente en el software de control de la unidad. El contador de detección de electrozona está equipado con un orificio de 50 μm, que permite la medición de partículas de entre 1 y 30 μm de diámetro. Realice primero una ejecución en segundo plano; se espera que tenga menos de 5000 recuentos en 0,5 mL de diluyente en blanco. Los mejores niveles de fondo pueden ser inferiores a 100 recuentos.
   4. Ajuste el volumen de la muestra en el software de control de la unidad para tener en cuenta el factor de dilución. Añada 10-20 μL de la mezcla de microburbujas al vaso de precipitados y realice la segunda ejecución.
   5. Utilice los datos de distribución del tamaño del fondo para tener en cuenta mediante el uso de la función "restar ejecución en segundo plano" dentro del software. Obtener la concentración de las partículas en la muestra de microburbujas original como número de partículas/mL; Incluye el factor de dilución.
      1. La superficie exterior de la punta de la pipeta también puede estar cubierta de burbujas durante el muestreo; Asegúrese de limpiarlo antes de insertar la punta en el medio de conteo. No toque el orificio de la punta de la pipeta con una toallita.
      2. Evite diluciones insuficientes de partículas de muestra durante el recuento, para minimizar los problemas con la corrección de coincidencias, donde más de una partícula a la vez está dentro del orificio del sensor: el sistema puede subestimar la concentración de partículas.
         NOTA: El diámetro del orificio para el conteo de partículas puede variar. La selección del orificio de 50 μm permite la detección de microburbujas con un diámetro de hasta 1 μm, pero no es tan propenso a obstruirse como las opciones de diámetro más pequeño.
      3. Calibre el contador de detección de electrozona para el mismo medio de prueba de diluyente (por ejemplo, solución de irrigación salina normal filtrada estérilmente) que se utiliza en las pruebas reales. Una alternativa de oscurecimiento láser a la detección de electrozona tiene la ventaja de no necesitar solución salina filtrada con concentración de sal y conductividad eléctrica controladas.

6. Pruebe la segmentación de microburbujas in vitro en un ensayo de adhesión/retención

1. Prepare la superficie del receptor de biomarcadores para la orientación de microburbujas a las placas de Petri.
   1. Tome platos de poliestireno de 35 mm de diámetro para utilizarlos como superficie objetivo. Aproveche la adhesión inespecífica de las proteínas a la superficie de la placa de poliestireno a partir de solución salina normal. Utilice una proteína modelo, la estreptavidina, para probar la diana de las burbujas biotiniladas que contienen biotina-PEG-DSPE como parte de la cáscara.
   2. Coloque una gota de solución de estreptavidina (0,2 mL, 10 μg/mL en PBS) en el centro de cada placa de Petri y cúbrala con un cubreobjetos de plástico de 22 mm x 22 mm para permitir un recubrimiento uniforme de la superficie de la placa. Después de la incubación durante la noche a 4 °C en un ambiente cerrado y húmedo para evitar que la placa se seque, retire los cubreobjetos.
   3. Lavar inmediata y exhaustivamente las placas con agua, PBS, y bloquearlas mediante incubación con albúmina sérica bovina (BSA) al 1,5% en PBS durante al menos 4 h para minimizar la adherencia inespecífica de las microburbujas a la superficie no recubierta. Utilice las placas de cultivo limpias bloqueadas con 1,5% de BSA como controles.
   4. Alternativamente, use una solución recombinante de receptor α_Vβ₃ (por ejemplo, a 4 μg/mL en PBS)⁵ en lugar de estreptavidina. Dirija las microburbujas a este biomarcador a través del ligando del péptido RGD cíclico unido a la cubierta de la microburbuja.
   5. Mantenga húmeda la placa con el receptor diana depositado: la proteína receptora puede inactivarse si se seca.
      NOTA: Es importante utilizar proteínas receptoras libres de portadores que no contengan proteínas portadoras ni tensioactivos en el medio, ya que su presencia inactivará la adhesión.
2. Adhesión de microburbujas en una pequeña gota: compruebe rápidamente la adherencia selectiva en condiciones estáticas.
   1. Deposite una gota de microburbujas (5-20 μL) desde abajo en la superficie objetivo (o solo BSA de control) en una placa de Petri que esté invertida al revés. Esto llevará las burbujas a la superficie recubierta del receptor por flotación.
   2. Después de 5-10 minutos de incubación del plato invertido en un ambiente húmedo, invierta el plato a una posición normal, llénelo con PBS y enjuague suavemente para eliminar las microburbujas libres. Realice microscopía de campo claro para evaluar la adherencia dirigida.
3. Adhesión de microburbujas en la superficie de la placa de Petri: realizar la orientación en una placa llena¹.
   1. Tome la placa, que tiene un recubrimiento superficial del receptor, y llénela completamente con tampón PBS-BSA desgasificado (más de 10 ml para la placa de 35 mm), de modo que el menisco del tampón se extienda sobre la parte superior de la placa y sea sostenido por fuerza capilar. Inyecte las burbujas (50 μL) en la mayor parte del tampón y mezcle rápidamente para lograr la homogeneidad. Evite la formación de burbujas de aire durante la mezcla.
   2. Coloque rápidamente sobre el plato un segmento de cinta adhesiva de embalaje transparente o una cinta selladora de placas de cultivo, respaldada con una pieza plana de plástico. Selle a presión la película al plato, invierta el "ensamblaje" y colóquelo boca abajo durante 30 minutos para permitir que las microburbujas floten hacia arriba, toquen la superficie objetivo y se adhieran.
   3. Invierta el "conjunto" del plato sellado a la configuración "hacia abajo", retire el sello y lave las microburbujas no adherentes enjuagando con una solución tampón desgasificada. Observe las microburbujas específicas mediante microscopía o ecografía.
      NOTA: Cuando se incuba el plato sellado invertido completamente lleno con la dispersión de microburbujas, se puede colocar en un ligero ángulo, de modo que si hay burbujas grandes, flotarán hasta el borde del plato, fuera de la región central de interés. El enjuague forzado con flujo rápido proveniente de una punta de micropipeta durante la microscopía se puede utilizar para evaluar la firmeza de las burbujas al objetivo (las burbujas se desprenden completamente de la superficie de control incluso en flujo lento) ¹¹. El tampón desgasificado es preferible para la dilución de burbujas, ya que el exceso de aire disuelto provocará un crecimiento incontrolado de microburbujas.

7. Pruebe la segmentación de microburbujas in vitro: evalúe los ensayos dinámicos de adhesión/retención en una cámara de flujo de placas paralelas

NOTA: Probamos la adhesión de las burbujas biotiniladas a la capa de estreptavidina con imágenes de ultrasonido.

1. Utilice una cámara de flujo de placa paralela disponible en el mercado con un soporte de inversor personalizado para observar la adhesión dirigida a una placa de Petri de 35 mm desde el medio que fluye. Después de la adsorción de la proteína objetivo en la placa (ver 6.1.1), inserte el cuerpo de la cámara con la junta preinstalada en la placa y séllela en el soporte. Utilice juntas con una altura de canal (es decir, espesor de la junta) de 0,127 mm y un ancho de canal de 2,5 mm.
   NOTA: Durante el montaje de la cámara de flujo de placa paralela, la cantidad de grasa de silicona utilizada en la junta debe ser mínima. No permita que la grasa entre en el área del canal: evite cubrir la superficie recubierta de proteínas del biomarcador con grasa. Para lograr un sellado adecuado, seleccione cuidadosamente los platos de 35 mm (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre la cámara y el plato).
2. Para el ensamblaje de la cámara de flujo, no atornille demasiado la tapa y el marco que sujeta la combinación de la cámara de flujo y el plato para evitar fugas.
3. Conecte el tubo de flujo a una bomba de jeringa que funcione en modo de extracción y, en el lado del alimentador, conecte un tubo delgado de polietileno (PE50) al vial con una dispersión de microburbujas diluidas, sometido a una mezcla constante con una barra de agitación a través de un agitador magnético¹². Controle el parámetro de velocidad de corte de pared (WSR) de la cámara ajustando el caudal volumétrico de la bomba según la fórmula 6Q/bh², donde Q es el caudal, 'b' es el ancho del canal y 'h' es la altura del canal.
   NOTA: Retire las burbujas de aire de todo el sistema antes de la perfusión del medio que contiene microburbujas o PBS, ya que cualquier burbuja de aire que pase a través del canal desalojará las microburbujas adherentes de la superficie objetivo e invalidará el experimento. La conexión entre el tubo de la cámara de flujo y la jeringa debe estar debidamente sellada.
4. Prepare una dispersión de microburbujas añadiendo un volumen calculado de burbujas concentradas al depósito de microburbujas (un vial de centelleo de 20 mL) para lograr una concentración de 10⁶ microburbujas/mL, en tampón PBS con 0,1% de BSA. Coloque el depósito de alimentación en un agitador de placa magnética. Inserte una barra de agitación magnética de 1 cm x 2 cm y revuelva a ~ 400 RPM para mantener la homogeneidad durante el transcurso del estudio.
5. Realizar imágenes de ultrasonido de la cámara de flujo en un tanque de agua¹³.
   1. Sumerja el conjunto de la cámara de flujo en agua desgasificada y manténgalo en su lugar con un peso para evitar el movimiento durante los experimentos.
   2. Coloque la sonda de imagen sujeta directamente sobre el canal e inclínela en un ángulo de 15° hacia atrás, así como en un ángulo de 5° en el sentido de las agujas del reloj para minimizar la reflexión especular de la superficie del plato. Coloque el canal de la cámara de flujo dentro del plano de imagen.
   3. Utilice las siguientes condiciones de imagen: transductor 15L8, modo de imagen específico del contraste, rango dinámico 50 dB, 7 MHz, índice mecánico (MI) = 0,18, ganancia CPS = 0. Mantenga la compensación de ganancia de tiempo uniforme en toda la imagen.
   4. Coloque la cara del transductor de modo que toque la superficie del agua, no profundamente sumergida. Alternativamente, use una funda protectora de goma llena de gel de ultrasonido.
      NOTA: Para garantizar un posicionamiento reproducible del sistema de cámara de flujo para la obtención de imágenes, los marcadores deben colocarse en la cuenca de agua o en la pantalla del sistema de ultrasonido.
6. Extraiga la dispersión de microburbujas del depósito a través de la cámara y dentro de la bomba durante 2 minutos.
   1. Cambie el flujo a PBS, para eliminar las burbujas no adherentes del canal y evaluar la retrodispersión acústica de las burbujas adherentes (dirigidas) restantes. Para obtener una imagen de fondo, aumente el IM a 1,9 para destruir las burbujas adherentes en el campo de visión de la imagen de ultrasonido.
      NOTA: La dispersión de microburbujas debe reemplazarse para ejecuciones repetidas: a alta dilución, las microburbujas se degradan gradualmente con el tiempo.
7. Exporte imágenes individuales desde la transmisión de video de grabación de pantalla: antes del lavado de PBS, después del lavado y después de la destrucción, para importarlas a ImageJ para su análisis fuera de línea. Seleccione la región de interés (ROI) para excluir las partes de entrada y salida de la cámara. Después de restar la señal de ROI de fondo, cuantifique la intensidad del eco como la intensidad media de píxeles dentro del ROI.
   NOTA: Como alternativa a la ecografía, la adhesión de las microburbujas a la superficie objetivo se puede observar mediante microscopía de vídeo, cuando el conjunto de la cámara de flujo de placa paralela en el soporte invertido se coloca en una platina de un microscopio compuesto, con grabación de vídeo 5,11,12,14. Esto es especialmente útil para obtener imágenes de la adhesión dirigida de microburbujas a los receptores de biomarcadores de la superficie celular en cultivos celulares, cuando las células que expresan receptores se cultivan en la placa de cultivo de tejidos, y el número de microburbujas unidas a cada célula objetivo se puede contar directamente.

Resultados

Acoplamiento covalente de péptido y lípido
La finalización de la reacción y la formación del producto deseado fueron confirmadas por TLC. Un control de péptido no reaccionado por separado no se movió hacia arriba durante la TLC: se retuvo al principio y su lugar fue positivo para el grupo amino primario, como se observó después de la pulverización de ninhidrina, al calentarse. Esta mancha peptídica libre positiva para ninhidrina ya no se observó en la mezcla después de la finalización de la reacción, después de la TLC de la muestra de mezcla de reacción, después de la eliminación de DIPEA, DMSO y la redisolución en cloroformo. En cuanto a la cuestión crucial de la calidad del reactivo del éster del NHS, la Figura 1 presenta la pista espectrofotométrica de la cinética de hidrólisis, con el punto de tiempo cero al comienzo de la reacción cuando el éster del NHS en un disolvente orgánico se añadió a la cubeta. Esto confirma la funcionalidad del éster activo NHS de carboxi-PEG-DSPE (ver Métodos, Sección 1). En el punto de tiempo cero, el A_{extrapolado 260} = 0,33 representa el material que ya se hidrolizó antes de la prueba. Al finalizar la reacción de hidrólisis, en exceso de 10-15 min, A₂₆₀ = 1,54 (cuando la absorbancia ya no aumenta considerablemente). Esto confirma la presencia de éster activo. También proporciona datos cuantitativos, que indican que más del 78% del material no es NHS prehidrolizado y, por lo tanto, se puede utilizar con éxito para el acoplamiento de péptidos, con el ajuste adecuado de la cantidad de reactivo.

Preparación y transferencia de material lipídico del medio acuoso a la cubierta de la burbuja: lípidos de fluorescencia
Las microburbujas para este estudio se prepararon para contener una cantidad mínima (menos del 1%) del colorante fluorescente DiI, con fluorescencia roja característica, que se agregó como solución en PG a la solución salina-PG de DSPC y estearato de PEG. Las microburbujas resultantes demuestran claramente la fluorescencia de la cáscara cuando se utilizan filtros de excitación de luz verde y de emisión roja en el microscopio (véase la Figura 2, izquierda). La microscopía de campo claro de la fase gaseosa de microburbujas (Figura 2, derecha) se puede comparar con la fluorescencia de la cáscara de microburbujas. Para la evaluación cuantitativa de la transferencia de material lipídico de la fase acuosa a la cubierta de la burbuja, las microburbujas flotaron mediante centrifugación y la señal de fluorescencia de la fase infranadante clara se comparó con la fluorescencia de la solución inicial, antes de la amalgamación de microburbujas. Se observó una reducción de la señal de casi un orden de magnitud (Figura 3), es decir, más del 85% del material lipídico se ha transferido a la cubierta de la microburbuja por amalgamación.

Preparación y corrección de la distribución del tamaño de las microburbujas
Las microburbujas generadas por amalgamación demostraron una distribución de tamaño típica, con alta concentración (por ejemplo, ~4,8 x 10⁹ partículas por mL para burbujas biotiniladas). La distribución del tamaño fue amplia, con partículas presentes dentro del rango medido (entre 1 y 30 μm); ~6,3% las microburbujas superan los 5 μm de diámetro (Figura 4, curva verde). La administración intravascular de microburbujas grandes puede provocar su acumulación inespecífica en los capilares sanguíneos y debe evitarse. Una flotación corta (15-17 min) del vial invertido en gravedad normal, con la posterior recolección de 0,3 mL cerca de la superficie del tabique, permite la eliminación completa de las microburbujas más grandes, con una pérdida menor en la concentración total del número de partículas, hasta ~4,6 x 10⁹: después de la flotación, solo el 0,01% de las partículas en la muestra purificada tienen diámetros superiores a 5 μm (Figura 4, curva roja).

Adhesión de microburbujas a la superficie recubierta de receptores: ensayo estático
Este procedimiento se ha descrito por primera vez en el siglo pasado¹, y se está utilizando como una prueba rápida que confirma la funcionalidad de las microburbujas dirigidas. Las microburbujas pueden entrar en contacto con la superficie de la placa portadora del receptor. Si se produce la interacción ligando-receptor, las burbujas pueden quedar retenidas en la superficie a pesar del lavado vigoroso. Se presenta un ejemplo de una prueba tan rápida de la adhesión funcional de microburbujas de c(RGDfK) sobre la superficie recubierta con α_{recombinante vβ 3}. La Figura 5 es una imagen representativa de microscopía de campo claro de microburbujas adherentes en la superficie del receptor en una placa de Petri, después de un lavado con PBS, para eliminar las burbujas no unidas. Las burbujas en este tipo de microscopía se presentan como patrones circulares oscuros. En condiciones similares, si la superficie solo está recubierta con albúmina (para bloquear la adhesión inespecífica), las microburbujas no se adherirán y se lavarán fácilmente incluso con un enjuague suave.

Unión de microburbujas del medio de flujo: cámara de flujo de placas paralelas
Este procedimiento se ha propuesto inicialmente como una herramienta para el estudio de la adhesión celular en un entorno de flujo controlado¹⁵ y se ha adaptado para el estudio de la focalización de microburbujas décadas más tarde¹¹. Las pruebas en un sistema de flujo continuo, a diferencia de un ensayo estático, son mucho más realistas para un escenario de imágenes clínicas, donde las burbujas circulantes en un flujo de sangre tocan brevemente la pared del vaso y pueden adherirse a ella si el receptor objetivo está presente. Se presentan dos ejemplos de este tipo de estudios. El primer ejemplo es un enfoque más tradicional, en el que la adhesión de las microburbujas decoradas con péptidos a la superficie recubierta del receptor se supervisa mediante microscopía de vídeo. La microscopía permite distinguir las microburbujas adherentes de las que fluyen. También permite cuantificar las microburbujas adherentes en el marco de imagen del microscopio: muchas más microburbujas de c(RGDfK) (columna izquierda) se adhieren a la superficie, en comparación con el control, donde se utiliza el péptido c(RADfK) codificado, o si la superficie solo está recubierta con BSA (Figura 6).

El segundo ejemplo es la ecografía de contraste de la placa de Petri recubierta de estreptavidina (Figura 7, lado derecho) a la que se adsorben con éxito las microburbujas biotiniladas del medio que fluye, y puede detectarse mediante ecografía de contraste después de un lavado con PBS. La superficie del plato de control no retiene ninguna microburbuja adherente del flujo, por lo que esencialmente toda la señal de contraste de ultrasonido se elimina con el flujo PBS. La cuantificación de la señal de contraste ecográfico muestra una fuerte significación estadística de la diferencia observada; La relación entre las señales de objetivo y de control superó un orden de magnitud.

Figura 1. Cinética de hidrólisis del éster activo NHS-PEG-DSPE, observada por liberación de NHS en medio alcalino mediante pruebas espectrofotométricas a una longitud de onda de 260 nm. El punto de tiempo cero es el tiempo de adición de NHS-PEG-DSPE en solvente orgánico al tampón de borato de 0,1 M, pH 9,2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Microscopía de microburbujas llenas de gas después de la amalgamación. Izquierda, microscopía de fluorescencia (excitación verde, emisión roja, colorante de cáscara lipídica DiI). Derecha, microscopía de campo claro (observación en fase gaseosa), mismo aumento. Ancho del marco, 85 mmm (micrómetro de etapa de 10 μm incrustado en la parte inferior derecha de cada imagen). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Espectroscopia de fluorescencia de una muestra de colorante lipídico DiI del medio de preparación de microburbujas antes de la amalgamación (derecha) y después de la amalgamación y eliminación de microburbujas por flotación centrífuga (izquierda). Excitación de fluorescencia - 555 nm, emisión - 620 nm. Los datos se presentan como Media ± Desviación Estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Distribución del tamaño de partícula del número de concentraciones de microburbujas después de la preparación de la amalgamación (verde), con la posterior flotación por gravedad normal para la eliminación de microburbujas grandes (rojo) y recuento de fondo solo diluyente (azul). Recuento de partículas con detección electrozonal en solución salina normal, orificio de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Microscopía de campo claro de microburbujas c(RGDfK) en una placa recubierta con α_{vβ 3}. El ancho del marco de la imagen es de 106 μm; la barra es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. La cámara de flujo de placa paralela in vitro dirige las microburbujas decoradas con péptidos a la superficie recubierta con α recombinante β₃. Las microburbujas decoradas con cRGDfK se adhirieron eficientemente al plato (izquierda), la fijación de las microburbujas cRADfK (codificadas, centro) de control no dirigidas fue mínima (p<0.00005), al igual que la retención de microburbujas en la superficie de control solo con albúmina (derecha, p<0.0025). Esfuerzo cortante de la pared de flujo de la cámara a 1 dyn/cm². Adhesión de microburbujas monitoreada por videomicroscopía; Se presenta el número de partículas en el campo de visión. El tiempo de acumulación es de 4 min. Los datos se presentan como Media ± Desviación Estándar. Reimpreso con permiso de⁵. Derechos de autor, 2018, American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Imágenes de ultrasonido de contraste de una cámara de flujo de placa paralela después de la adhesión dirigida y el lavado con tampón de microburbujas biotiniladas en la placa recubierta con estreptavidina (centro, microburbujas dirigidas adherentes, derecha, misma placa, después de una ráfaga de ultrasonido de alta IM), y placa de control recubierta solo con albúmina (izquierda). Dos minutos de perfusión de dispersión de microburbujas (PBS/BSA, 10⁶ partículas/mL) a una velocidad de cizallamiento de 450 ^s-1 , seguido de lavado con tampón. La cuantificación de la señal de ultrasonido se realiza a partir de las regiones de interés en los fotogramas de vídeo después de la sustracción de fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La importancia de una técnica sencilla para la preparación de microburbujas decoradas con ligandos es evidente. El uso de la técnica de amalgamación para la preparación de microburbujas, iniciada por Unger et ^al.16 , puede servir para este propósito por varias razones. La fabricación de microburbujas por amalgamator es fácil de realizar. Una unidad monofásica de escritorio de 120 V de tamaño pequeño está disponible y es económica. El procedimiento es rápido (45 segundos) y eficiente: se prepara de una sola vez 1 mL de dispersión de microburbujas en un medio acuoso. Contiene miles de millones de partículas por mL, más que suficientes para estudios de investigación. La fabricación se realiza en un vial sellado con espacio de cabeza de gas perfluorado. Si es necesario, el contenido del vial permanecerá estéril desde el momento del llenado aséptico, durante la fabricación (amalgamación) y hasta su uso. Esto hace que el enfoque sea relevante para el uso clínico, ya que no requiere preparaciones elaboradas en un entorno estéril dedicado en la clínica.

El procedimiento se basa en el autoensamblaje: durante la mezcla, a medida que se aplica un alto cizallamiento a la interfaz gas-agua dentro del vial en movimiento, se forman pequeños fragmentos de gas, que asumen una forma esférica debido a la acción de la tensión superficial. El PG, como cosurfactante, presente en el medio a alta concentración, reduce la tensión superficial y la energía requerida para generar la interfaz gas-agua durante el cizallamiento. A continuación, los tensioactivos más "clásicos", como los lípidos PEG y los fosfolípidos, que están presentes en concentraciones mucho más bajas, llegan a la interfaz, muy probablemente desplazando al PG y estableciendo una capa monomolecular en la superficie de la burbuja. Este caparazón es razonablemente estable; es probable que se deba a una combinación de un lípido "sólido" (la temperatura de transición de fase DSPC es de 56 °C, por lo que no es propenso a la fusión entre membranas) y una capa de cepillo PEG extendida que rodea las microburbujas e inhibe el contacto directo de la monocapa de las burbujas vecinas. Se puede especular que la presencia de una alta concentración de PG en el medio puede disminuir la estabilidad de la cubierta de la microburbuja. En su ausencia, las microburbujas son estables en los viales sellados bajo atmósfera de fluorocarbono durante muchos meses, con solo una fusión moderada entre las burbujas. Para uso clínico, con un pequeño dispositivo amalgamador al lado de la cama, el intervalo entre la preparación y el uso de las microburbujas puede ser corto, de minutos o de horas. Con PG presente en los medios, la concentración de microburbujas no muestra una caída significativa, al menos durante varias horas de almacenamiento refrigerado.

Una ventaja añadida del procedimiento descrito (asistido por el uso de cosurfactante PG en el medio de preparación de burbujas) es la alta eficacia (>85%) de la transferencia de lípidos a la cáscara, mientras que la sonicación tradicional proporciona una eficacia de ~20%⁵ y los métodos microfluídicos modernos aún más bajos¹⁷. El alto nivel de eficiencia de transferencia es importante no solo porque se reduce el desperdicio de material lipídico y el ligando costoso, sino porque también se minimiza la cantidad de ligando sin burbujas copresente en el medio. Entonces, es posible que el ligando libre no tenga la oportunidad de bloquear el receptor objetivo del biomarcador al que se espera que se unan las microburbujas a través del ligando en su superficie. La cantidad general del receptor del biomarcador en la vasculatura diana suele ser bastante alta, por lo que esto podría no ser de suma importancia. A partir de la literatura de patentes disponible¹⁸ , se podría sugerir que al menos el 50% del material de la cubierta lipídica y el ligando objetivo en las formulaciones de microburbujas en las pruebas clínicas pueden estar asociados con la cubierta de burbuja. Esto se puede comparar generalmente con los anticuerpos radiomarcados o péptidos que se utilizan ampliamente en los estudios de imágenes de receptores de medicina nuclear: la mayoría de los que se dirigen a las moléculas de ligando en realidad no transportan radioisótopos "calientes" ni siquiera para la actividad específica más alta reportada¹⁹, mientras que para las microburbujas dirigidas, el material de la cubierta en este estudio (incluido el ligando-lípido) se adhiere principalmente a las microburbujas.

Se demostró la adhesión selectiva de microburbujas dirigidas preparadas por esta técnica in vitro, en dos conjuntos de modelos de focalización: adhesión estática y un experimento de focalización en cámara de flujo. En un ensayo estático, las microburbujas dirigidas se adhirieron firmemente a la capa del receptor objetivo y no se desprendieron con el enjuague tampón, a diferencia de un entorno de control, donde las microburbujas se eliminaron de la superficie incluso con un enjuague suave. Del mismo modo, en una prueba de flujo, realizada en una cámara de flujo de placa paralela, las burbujas biotiniladas demostraron una adhesión estadísticamente significativa y excelente a la capa de estreptavidina en una placa de poliestireno, en comparación con la superficie de solo albúmina de control. Las microburbujas decoradas con péptido c(RGDfK) se adhirieron selectivamente a α_vβ superficie recubierta de₃, tanto en el ensayo de adhesión estática como en una cámara de flujo de placas paralelas.

Los siguientes problemas pueden considerarse como limitaciones del protocolo descrito. En primer lugar, el procedimiento no tiene en cuenta las partículas submicrónicas. El instrumento que se utilizó en el estudio no estaba configurado para detectar nanoburbujas (es decir, partículas de menos de 1 μm de diámetro). Estas partículas podrían haber estado presentes en la formulación. Aunque generalmente se sabe que su señal acústica de retrodispersión es baja, y no se observaron en este estudio por microscopía, aún se debe considerar la presencia de nanoburbujas. El segundo problema importante es la heterogeneidad del tamaño de las microburbujas. A pesar de la eliminación de partículas más grandes, el tamaño de las burbujas resultantes está lejos de ser uniforme. Esto debería ser una consideración y justificación para futuras investigaciones en el área de la formulación de microburbujas.

En conclusión, la narración dada en este manuscrito debe proporcionar un nivel suficiente de detalle técnico para fabricar microburbujas específicas de forma rápida y sencilla. Se proporcionan los pasos para realizar una purificación adicional (si es deseable), ajustar el tamaño y/o evaluar la pequeña cantidad de material de la cáscara que permanece en el medio acuoso. Se describen las herramientas analíticas detalladas para la evaluación de los parámetros de las microburbujas, como la distribución del tamaño y la concentración, y la capacidad in vitro de las microburbujas decoradas con ligandos para adherirse a los receptores objetivo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amalgamador	Lantheus, Billerica, MA.	Se	puede utilizar Vialmix, ESPE, Capmix, Wig-L-Bug u otro amalgamador capaz de 4300 rpm.
biotina-PEG3400-DSPE	Laysan Bio, árabe, AL.	Biotina-PEG-DSPE-3400
Albúmina sérica bovina (BSA)	Fisher Scientific, Waltham, MA	BP1600-100 o similar
PBS libre de Ca-Mg	Fisher Scientific, Waltham, MA	14190-144
Centrífuga con rotor de cangilón	IEC/Thermo, Fisher Scientific, Waltham, MA.	NH-SII	Cualquier centrífuga con rotor de cangilón
cloroformo	Fisher Scientific, Waltham, MA	C297-4
péptido cíclico (RGDfK)	AnaSpec, Fremont, CA	AS-61111
Decafluorobutano	F2 Chemicals, Preston UK	CAS 355-25-9
DiI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	468495-100MG
DIPEA	Sigma-Aldrich, San Luis, MO.
Cubeta UV desechable, 1,5 ml	BrandTech, Essex, CT.	759150
DMSO	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
Calentador de bloque seco, alta temperatura	Techne Cole Palmer, Staffordshire UK	DB-3A
DSPC	Lipoid, Ludwigshafen, Alemania	LIPOID PC 18:0/18:0
Lector de microplacas de fluorescencia	Molecular Devices, San José,   CA.	Spectramax Gemini XS	Ya no está disponible, reemplazado por Gemini XPS; cualquier lector de placas de fluorescencia con capacidad de detección de colorante rojo funcionará
Microscopio con epiiluminación de fluorescencia.	Leica	Laborlux 11	Ya no está disponible; cualquier microscopio de fluorescencia es suficiente; se requiere una cámara de vídeo de alta sensibilidad para la recogida
de imágenes NHS-PEG3400-DSPE	NOF-America, White Plains, NY.	SUNBRIGHT DSPE-034GS	Algunos de los fabricantes alternativos proporcionan material que es en su mayoría, o completamente, hidrolizado a la llegada
Spray de ninhidrina para placas TLC	BVDA, Haarlem, Países Bajos	AS-72177
Solución de irrigación salina normal (0.9% NaCl)	Baxter, Deerfield IL.	2F7124
Cámara de flujo de placa paralela, para placa de Petri Corning de 35 mm	Glycotech, Gaithersburg, MD.	31-001	Solo puede funcionar con placas de Petri Corning, pero no necesariamente con otros fabricantes, debido a las diferentes dimensiones
Sistema de dimensionamiento de partículas	Beckman Coulter, Hialeah, FL	Multisizer 3	Ya no está disponible, reemplazado por Multisizer 4, con un principio de detección de electrozona similar. Alternativamente, se pueden utilizar métodos ópticos, por ejemplo, Accusizer.
Monoestearato PEG 6000	Kessco Stepan, Joliet, IL.	CAS 9004-99-3
Placas de Petri, 35 mm de diámetro, 10 mm de altura	Corning, Corning, NY.
Cubreobjetos de plástico, 22x22mm	Cardinal Health, McGaw Park, IL.	M6100
Propilenglicol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	P4347
Alfavbeta3 murino recombinante, R	D Sistemas, Minneaposis, MN.	7889-AV-050
Tapones de goma, 13 mm	Kimble-Chase, Vineland, NJ	W017900
Viales de suero, 2 ml, 13 mm	Kimble-Chase, Vineland, NJ	223683
Placas de sílice TLC, F254	Analtech, Newark, DE	P02521
Tetraborato de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	S9640
Estreptavidina	AnaSpec, Fremont, CA	AS-72177
Bomba de jeringa,  opción de infusión/extracción	Harvard Apparatus, Holliston, MA	PHD2000, 70-2001
Sistema de imágenes de ultrasonido con modo específico de contraste.	Siemens/Acuson, Mountain View CA	Sequoia c512, sonda 15L8	vieja generación de Sequoia está fuera de producción desde hace más de una década. Disponible como equipo usado. El modo CPS debe estar desbloqueado para el transductor 15L8.
Espectrofotómetro UV	Beckman, Brea, CA.	DU640	Ya no está disponible, puede ser reemplazado por cualquier unidad con capacidad ultravioleta de 260 nm