Este estudio describe cómo diseccionar el saco endolinfático del oído interno del ratón a diferentes edades. El resultado de una disección similar se muestra en un modelo de ratón Slc26a4-null de agrandamiento del saco endolinfático. Un ratón transgénico con un indicador fluorescente expresado en el saco endolinfático se presenta como modelo para visualizar fácilmente el saco endolinfático, y herramienta educativa.
Artículo de método
Disección del saco endolinfático de ratones
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El estudio de modelos de ratones mutantes de trastornos de la audición y el equilibrio humanos ha desentrañado muchos cambios estructurales y funcionales que pueden contribuir a los fenotipos humanos. Aunque se han realizado avances importantes en la comprensión del desarrollo y la función de los epitelios neurosensoriales de la cóclea y la vestibula, se dispone de conocimientos limitados sobre el desarrollo, la composición celular, las vías moleculares y las características funcionales del saco endolinfático. Esto se debe, en gran parte, a la dificultad de visualizar y microdiseccionar este tejido, que es un epitelio compuesto por una sola capa celular. El estudio que se presenta aquí describe un enfoque para acceder y microdiseccionar el saco endolinfático del oído interno de ratón de tipo salvaje a diferentes edades. El resultado de una disección similar se muestra en un modelo de ratón deficiente en pendrina de agrandamiento del acueducto vestibular. Se presenta un ratón transgénico con un saco endolinfático fluorescente. Este ratón reportero se puede utilizar para visualizar fácilmente el saco endolinfático con disección limitada y determinar su tamaño. También se puede utilizar como herramienta educativa para enseñar a diseccionar el saco endolinfático. Estos procedimientos de disección deberían facilitar una mayor caracterización de esta parte poco estudiada del oído interno.
Introducción
El oído interno de los mamíferos está formado por la cóclea, el sáculo, el utrículo, tres canales semicirculares y el saco endolinfático (Figura 1A). Estos órganos comprenden un epitelio continuo lleno de líquido llamado laberinto membranoso, con órganos adyacentes que se conectan directamente o a través de pequeñas estructuras de canales como el conducto reunificado, el conducto sacular, el conducto utricular o el conducto endolinfático. En comparación con otros órganos del oído interno, el saco endolinfático tiene características únicas. En primer lugar, carece de células epiteliales sensoriales. En cambio, el saco endolinfático tiene células especializadas en el transporte de iones. En segundo lugar, aunque el laberinto membranoso está encerrado en el laberinto óseo, el saco endolinfático es una excepción, ya que sobresale parcialmente del hueso petroso y entra en la cavidad intracraneal. Esta morfología parece estar muy conservada durante la evolución del oído interno. En tercer lugar, el saco endolinfático es la primera estructura que se desarrolla a partir del otocisto en una etapa embrionaria temprana antes de la formación de otros órganos. Además, varias patologías se han asociado a un saco endolinfático agrandado o a un compartimento endolinfático anormal. La presencia de variantes patógenas en SLC26A4 (también conocida como gen pendrín) conduce a una forma comparativamente común de pérdida auditiva neurosensorial, causada por el agrandamiento del saco endolinfático asociado con la presencia de un acueducto vestibular agrandado (EVA)1. Cuando se asocia con bocio, se denomina síndrome de Pendred 2,3. Algunos también piensan que la enfermedad de Ménière está asociada con una anomalía del compartimento endolinfático (hidropesía)4. Las características únicas del saco endolinfático y las patologías asociadas con un cambio en su morfología son consistentes con un papel crítico para el desarrollo y mantenimiento del oído interno.
A pesar de su importancia, el conocimiento sobre el desarrollo, la composición celular, las vías moleculares y las características funcionales del saco endolinfático es todavía limitado. Esto se debe, al menos en parte, a la dificultad de visualizar y microdiseccionar este tejido. El saco endolinfático es una estructura en forma de bolsa, compuesta por una sola capa de células epiteliales, que a menudo es translúcida y muy difícil de identificar fuera del tejido conjuntivo que la rodea por estereoscopía óptica. A pesar de que un pequeño número de investigadores han desarrollado técnicas de disección de montaje completo y han publicado sus hallazgos experimentales 5,6,7,8,9,10, no existe ninguna publicación que se centre en los detalles técnicos de este procedimiento.
En este estudio, se describen los enfoques de microdisección desarrollados para acceder y aislar el saco endolinfático del oído interno del ratón de tipo salvaje a diferentes edades, en montaje completo. Los resultados de una disección similar se muestran en un modelo de ratón, que carece de expresión de SLC26A4, que tiene agrandamiento del conducto endolinfático y del saco. Se presenta el caso de una línea de ratón con un transgén que codifica una recombinasa Cre expresada en el saco endolinfático. En presencia de un indicador fluorescente de la expresión de Cre, en este caso tdTomato, la fluorescencia se puede utilizar para visualizar fácilmente el saco endolinfático con disección limitada y para obtener información sobre su tamaño. Esta línea de ratones reporteros también se puede utilizar como una herramienta educativa para practicar y perfeccionar las disecciones de sacos endolinfáticos. La capacidad de diseccionar el tejido del saco endolinfático debería facilitar una mayor caracterización de este componente esencial del oído interno, poco estudiado pero esencial.
Protocolo
Todos los experimentos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares/Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (#1264) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica y Dental de Tokio (A2020-058A).
NOTA: Ratones C57BL/6J (n.º de código RS 000664), ratones Pds-/-también conocidos como Slc26a4-/- (129S-Slc26a4 tm1Egr/AjgJ, n.º 018424) 11, B6; Los ratones CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm 12 y Ai9(LSL-RCL-tdT) (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze, no. 007909)13 están disponibles en el Laboratorio Jackson y bajo petición. Todos los procedimientos de genotipado han sido descritos previamente. B6; Los ratones CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm previamente retrocruzados con la cepa C57BL/6J durante al menos cinco generaciones, fueron criados para experimentos. Los animales de ambos sexos pueden ser estudiados con este enfoque sin una diferencia obvia. El primer día después del apareamiento nocturno se cuenta como día embrionario 0,5 (E0,5).
1. Extracción y fijación del oído interno intacto en el cráneo
- Aplicar la eutanasia a un animal de experimentación o a una madre embarazada utilizando un procedimiento aprobado institucionalmente, por ejemplo, mediante la inhalación de CO2 . Si es posible, trabaje bajo una campana extractora para evitar o minimizar la propagación de los alérgenos del ratón. Después de verificar la falta de respuesta a estímulos dolorosos como pellizcos de pata o cola, decapitar al animal. En el caso de una madre con embarazo prolongado, la luxación cervical puede utilizarse como alternativa a la decapitación si no se utilizan sus oídos internos para otros experimentos.
- Recolectar los embriones por laparotomía14 utilizando unas tijeras arteriales con punta de bola para proteger los embriones durante el proceso. Manipula los embriones con pinzas de anillo. Colocar los cuernos uterinos en PBS a 4 °C sobre hielo y aislar cada embrión como se describió anteriormente15 antes de decapitarlos.
- Divide la cabeza de atrás hacia adelante: primero haz una incisión en la parte superior de la cabeza haciendo una incisión en la piel, luego en la parte superior del cráneo, haciendo una incisión en aproximadamente un tercio de la misma con cada corte para que no se doble el cráneo. Luego corta la parte inferior del cráneo de una vez.
NOTA: Para los embriones, se recomienda el uso de una cuchilla afilada, en lugar de tijeras. Es fundamental que, a todas las edades, el cráneo no se deforme mientras se bisecta. - Sin tocar ni doblar el cráneo, retire con cuidado el hemicerebro para revelar el laberinto óseo (Figura 1B, Figura suplementaria 1A-B).
- Para ratones de día 5 o más posnatales, seccione el conducto auditivo externo y tire de la piel hacia adelante hacia la nariz. Recorte el cráneo alrededor del oído interno (Figura complementaria 1C).
- Transfiera los dos hemicráneos de cada animal con el oído interno, lo más intactos posible, a un vial o tubo de vidrio que contenga 10 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C diluido en 1x PBS y manténgalo en hielo bajo una campana extractora.
NOTA: No intente extraer el oído interno del cráneo en este paso, ya que esto puede dañar el conducto endolinfático y el saco mientras lo hace. - Incubar durante 1 h a 4 °C en un agitador oscilante. Si trabaja con tejido de un animal con un indicador fluorescente, mantenga el tubo que contiene la muestra en papel de aluminio o en una caja para minimizar la exposición a la luz.
NOTA: Si está interesado en estudiar los microtúbulos y las moléculas asociadas, la fijación del tejido debe realizarse a temperatura ambiente (RT) con fijador RT. - Deseche el PFA en un recipiente apropiado en una campana extractora. Lavar tres veces con 10 mL de 1x PBS durante 15 min cada vez en un agitador oscilante a RT para eliminar el fijador antes de la disección.
2. Microdisección del saco endolinfático
- Transfiera cada preparación del oído interno a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm que contenga 1x PBS.
- Coloque la preparación en el plato de modo que la raíz del 8º par craneal quede orientada hacia arriba. Sostenga el tejido en esta posición agarrando la cóclea con una pinza #4 (Figura 1C).
- Identifique los puntos de referencia importantes: el acueducto vestibular, los canales semicirculares anterior y posterior, el crus común y el seno sigmoideo (vena) (Figura 1D).
NOTA: El saco endolinfático en el ratón salvaje es translúcido y difícil de visualizar. Para una microdisección exitosa del saco endolinfático, es importante comprender su anatomía y localización (Figura 1E). - Incidir la duramadre y el acueducto vestibular, así como los tejidos conectivos subyacentes que rodean el saco endolinfático, utilizando una aguja de 27 G en una jeringa de 1 mL (Figura 1D,F).
NOTA: Para un ratón adulto, la descalcificación de la preparación con EDTA al 10% (pH 7,4) antes de la microdisección es útil, pero no esencial, para facilitar la incisión del acueducto vestibular. Para la disección del saco endolinfático abierto más antiguo que el día 5 postnatal, se recomienda colocar la línea de incisión en el acueducto vestibular ligeramente anterior para realizar una incisión en la luz del saco endolinfático (Figura 2A). - Sujetar con pinzas el tejido conectivo situado lateralmente al saco endolinfático y tirar del tejido hacia arriba para despegarlo del hueso temporal (Figura 1G).
- Retire con cuidado cualquier residuo restante. La preparación suele incluir el epitelio del saco endolinfático, los tejidos conectivos circundantes, una porción del acueducto vestibular y el seno sigmoideo (Figura 1H-I). Si es necesario, separar el epitelio del saco endolinfático de los tejidos circundantes (Figura 1J).
- (Opcional) Para la disección del saco endolinfático abierto, sujete la parte del tallo de la preparación de modo que se pueda observar la sección transversal de la luz. Inserte una aguja de 27 G en el lumen y muévala para cortar el saco endolinfático en dos hojas (Figura 2B-C). Sostenga el borde de cada tejido en forma de lámina con pinzas y sepárelos entre sí (Figura 2D-F).
3. Inmunohistoquímica
- Después de la microdisección, use las pinzas #5 para transferir los sacos endolinfáticos a una placa de vidrio puntual de 9 pocillos.
- Usando el microscopio para asegurarse de que los sacos endolinfáticos permanezcan intactos, use una pipeta de 200 μL para eliminar todo el PBS 1x excepto una gota que contiene el tejido. Añadir 200 μL de solución permeabilizante y bloqueante (1x PBS con 0,15% de Triton X-100 (PBS-TX) y 5% de albúmina sérica bovina (BSA)) e incubar durante 1 h a RT en un agitador orbital.
- Después de retirar toda la solución bloqueante, excepto una gota que contenga el tejido, añadir 200 μL de anticuerpos primarios e incubar durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos anti-pendrina6 diluidos 1:1000 en solución bloqueante se pueden utilizar para identificar las células ricas en mitocondrias del saco endolinfático, aunque también se observa una expresión débil en un subconjunto de células ricas en ribosomas16 (Figura 5).
- Después de tres lavados en 1x PBS durante 15 min en RT, incubar con anticuerpos secundarios. Para el etiquetado que aquí se presenta, incubar 200 μL de anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente, diluidos a partir de la culata comercial a 1:500 en solución de bloqueo, con el tejido en una plataforma oscilante durante 1 h a RT en la oscuridad. La faloidina conjugada con colorante fluorescente, que reconoce la β-actina (ACTB), se puede utilizar para resaltar la presencia del saco y el conducto endolinfáticos, así como el tejido conjuntivo que los rodea (Figura 5A, C, F-G).
- Monte los sacos endolinfáticos entre un portaobjetos de vidrio y un cubreobjetos utilizando un medio de montaje antidecoloración con DAPI. Después de dejar que los portaobjetos se sequen protegidos de la luz durante 1 h en RT, aplique esmalte de uñas transparente en la unión entre el cubreobjetos y el portaobjetos de vidrio para sellarlos y limitar la formación de burbujas de aire. Si se trata de visualizar la distribución diferencial de las proteínas en la superficie apical frente a la basolateral de las células epiteliales, se recomienda abrir el saco durante el paso de montaje haciendo una incisión en un borde y abriéndolo.
- Imagen con microscopio confocal. En primer lugar, visualice las preparaciones del saco endolinfático con un objetivo de 10x para proporcionar una visión global del etiquetado del saco (Figura 5A-D). A continuación, utilice un objetivo de 63x para obtener una visión detallada de la distribución de la proteína de interés en las células ricas en mitocondrias y ribosomas del saco endolinfático (Figura 5F-G).
Resultados
Cada paso de esta microdisección de un saco endolinfático de tipo salvaje de un ratón postnatal de día 5 (P5) se detalla en el video asociado y las instantáneas de los pasos clave de esta disección y apertura del saco endolinfático se presentan en la Figura 1 y la Figura 2.
Los resultados representativos de las disecciones del saco endolinfático con fluorescencia de tdTomato en el día embrionario 16.5 (E16.5), P5 y P30, siguiendo este protocolo, se presentan en la Figura 3 y en la Figura Suplementaria 1 y la Figura Suplementaria 2. Utilizando un microscopio de disección con fluorescencia, el saco endolinfático se puede visualizar fácilmente en el cráneo después de la extracción del cerebro en ratones portadores del transgén Tg(ATP6V1B1-Cre) en presencia del reportero de la expresión de Cre: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (ver Figura 3A-B, y Figura 1 Suplementaria para imágenes capturadas en luz incidente y fluorescencia tdTomato del saco endolinfático en diferentes etapas de la disección). En estos ratones, Cre se expresa como un mosaico en las células a lo largo del saco y el conducto endolinfático (Figura 3, véase también la Figura 2 suplementaria para la visualización del saco endolinfático con frente a sin reportero fluorescente). Aunque la expresión de este reportero no es específica para la expresión endógena de Atp6v1b1, que está restringida a las células ricas en mitocondrias del saco endolinfático16, uno de los dos tipos celulares de este epitelio (Figura 5E), es una ayuda útil para identificar y diseccionar el saco endolinfático.
En la Figura 4 se presentan los oídos internos disecados de un modelo de ratón para el agrandamiento del acueducto vestibular. En comparación con los compañeros de camada de control, los sacos endolinfáticos y los conductos de los ratones deficientes para SLC26A4 (pendrín) están agrandados.
En la Figura 5 se muestran imágenes representativas de la inmunohistoquímica del saco endolinfático intacto con y sin tejido conjuntivo. También se presentan los resultados de la inmunohistoquímica del saco endolinfático abierto de un ratón P5 de tipo salvaje (Figura 5F-G). El saco endolinfático está compuesto por una sola capa de epitelio plegada en una estructura en forma de bolsa, que contiene en su luz endolinfa. Este epitelio consta de dos tipos de células, células ricas en mitocondrias y células ricas en ribosomas (Figura 5E). Un saco endolinfático de toda la montura se aplanará porque la endolinfa ya no está presente. El saco aparecerá como dos capas entrelazadas de epitelio, lo que dificulta la determinación de la localización subcelular de las proteínas expresadas en este epitelio. Al abrir el saco endolinfático, se puede visualizar fácilmente el epitelio de una sola capa y se puede determinar de manera más definitiva la distribución relativa de las proteínas de interés, con respecto a la luz del saco endolinfático. Se puede determinar con mayor precisión un posible enriquecimiento apical (luminal, donde estaría la endolinfada) frente al basal de estas proteínas. A modo de ejemplo, SLC26A4 está enriquecido en el lado apical de las células ricas en mitocondrias (Figura 5F).
Figura 1. Disección del saco endolinfático de un ratón de tipo salvaje en el día 5 postnatal (P5).
(A) Esquema del laberinto membranoso del oído interno de un ratón desarrollado (derecha). Se indica la ubicación del saco endolinfático, la cóclea y las estructuras vestibulares. Esta cifra ha sido modificada a partir de Honda et al.16.
(B) Sección sagital media que muestra el hemicráneo izquierdo. Se indica la ubicación del saco endolinfático (flecha). (O, occipital; F, frontal)
(C) Cápsula ótica junto con la parte escamosa del hueso temporal.
(D) Puntos de referencia importantes superpuestos en el cuadro punteado en el panel C. (ES, saco endolinfático; DE: conducto endolinfático; VA: acueducto vestibular; ASC: canal semicircular anterior; PSC: canal semicircular posterior; CC, crus comunes; SS: seno sigmoideo)
(E) Ilustración esquemática de la sección transversal junto con la línea blanca continua en el panel D a través del saco endolinfático. El lado proximal del saco endolinfático está cubierto por un canal óseo llamado acueducto vestibular, junto con el conducto endolinfático. En el lado distal, el saco endolinfático, rodeado de tejido conjuntivo (TC), se extiende y sobresale hacia el exterior del laberinto óseo y se intercala entre la duramadre (DM) y el seno sigmoideo con la parte escamosa del hueso temporal (TB).
(F) Se utiliza una aguja fina para cortar alrededor del saco endolinfático (siguiendo las líneas amarillas punteadas en el panel D).
(G) La preparación se retira cuidadosamente del hueso temporal sosteniendo el tejido en la posición indicada por el asterisco (*, también mostrado en el panel E) y despegándolo.
(H) Un saco endolinfático completo aislado con los tejidos circundantes.
(I) Versión esquemática de este saco endolinfático aislado con los tejidos circundantes.
(J) Saco endolinfático aislado sin tejidos circundantes.
Barras de escala: 2 mm (B), 1 mm (J). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Disección del saco endolinfático abierto de un ratón P5 de tipo salvaje.
(A) En el paso 2.4, la línea de incisión en el acueducto vestibular se coloca ligeramente anterior (línea punteada roja) para hacer una incisión en la luz del saco endolinfático.
(B) Sostenga la parte del tallo de la preparación, inserte una aguja de calibre 27 en el lumen y muévala para cortar el saco endolinfático en dos hojas.
(C) Ilustración esquemática del panel B.
(D) Sujete el borde de cada hoja con pinzas y sepárelas unas de otras.
(E) Ilustración esquemática del panel D.
(F) El saco endolinfático se separa en dos láminas, incluyendo el epitelio y los tejidos circundantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Disección de R26LSL-RCL-tdT/+; Saco endolinfático de ratón Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn en E16.5, P5 y P30. Todas las imágenes presentadas muestran la fluorescencia de tdTomato obtenida utilizando un microscopio estereoscópico con un objetivo 1 x equipado para la detección de la fluorescencia de tdTomato.
(A, B) Sección sagital media del cráneo de un E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Ratón Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn antes de (A) y después de (B) extracción de la mitad del cerebro. La fluorescencia de tdTomato delinea la posición del oído interno. El saco endolinfático es fácilmente visible incluso sin disección (punta de flecha).
(C, E, G) Oídos internos aislados de ratones E16.5, P5 y P30, respectivamente.
(D, F y H) Imágenes de mayor aumento de los correspondientes sacos y conductos endolinfáticos microdisecados. En P30, el conducto endolinfático está encapsulado en el hueso, lo que hace que sea particularmente difícil de aislar. Barras de escala: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Anatomía macroscópica de la cápsula ótica con un saco endolinfático agrandado. Oídos internos de los ratones Slc26a4+/- (izquierda) y Slc26a4-/- (derecha) en P105. El acueducto vestibular y el saco y conducto endolinfático (líneas punteadas negras) están agrandados en el ratón Slc26a4-/- en comparación con los de un ratón Slc26a4+/- . Barra de escala: 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. SLC26A4 expresión de células ricas en mitocondrias en el epitelio del saco endolinfático en E16.5 y P5.
(A, B) Saco endolinfático aislado de ratón E16.5 marcado con anticuerpo anti-SLC26A4 (verde) y faloidina que marca β-actina (ACTB, rojo).
(C) Una imagen de baja ampliación de un saco endolinfático abierto de un ratón P5 marcado con un anticuerpo anti-SLC26A4 (verde). La faloidina (ACTB, rojo) se puede utilizar para resaltar la presencia del saco endolinfático, así como el tejido conjuntivo que lo rodea.
(D) Saco endolinfático aislado marcado con un anticuerpo anti-SLC26A4 (verde).
(E) Ilustración esquemática del epitelio del saco endolinfático destacando la presencia de dos tipos de células: las células ricas en mitocondrias, cuya superficie apical está cubierta de microvellosidades, y las células ricas en ribosomas.
(De F a G) Imágenes de gran aumento del epitelio del saco endolinfático en P5, después de abrir el saco endolinfático y marcarlo con un anticuerpo anti-SLC26A4 (verde) y faloidina (ACTB, rojo). Una imagen representativa a nivel de la membrana apical se muestra en G, y una sección transversal reconstruida de la pila z al nivel de la línea blanca punteada se muestra en F. El núcleo de las células está marcado con DAPI (azul).
Barras de escala: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1. Luz incidente e imágenes de fluorescencia tdTomato correspondientes de un P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn oído interno de ratón en tres pasos de la disección. El saco y el conducto endolinfático se pueden visualizar fácilmente mediante la fluorescencia de tdTomato.
(A-B) Región del oído interno en la parte posterior de la mitad del cráneo intacto de un P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Ratón Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn.
(C-D) La extirpación de la piel y parte del cráneo permite una mejor visualización de la región del saco endolinfático.
(E, F) Oído interno aislado con el saco endolinfático todavía asociado con tejido conjuntivo.
(A, C, E) Imágenes capturadas con luz incidente. (B, D, F) tdFluorescencia del tomate del tejido correspondiente. Barras de escala: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2. Comparación de la fluorescencia de sacos endolinfáticos aislados de R26LSL-RCL-tdT/+; Ratones compañeros de camada Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn y R26LSL-RCL-tdT/+ en E16.5 y P5. La fluorescencia del tomate tdTomato facilita enormemente el reconocimiento del saco y el conducto endolinfático.
(A-C) Sacos endolinfáticos microdisecados de E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) y ratones compañeros de camada R26LSL-RCL-tdT/+ (B, C).
(D-F) Sacos endolinfáticos microdisecados de P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) y ratones compañeros de camada R26LSL-RCL-tdT/+ (E, F).
(A, B, D, E) tdFluorescencia del tomate. (C, F) Imágenes de luz incidente correspondientes a B y E. Barras de escala: 500 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Muchos investigadores han utilizado secciones incluidas en parafina o congeladas para estudios morfológicos del saco endolinfático. La desventaja de las preparaciones seccionadas es que puede ser difícil observar completamente los complicados contactos de célula a célula porque el tamaño y la forma de cada célula epitelial en el saco endolinfático son extremadamente variables, formando una capa celular arrugada y pseudoestratificada. La inmunotinción de montaje completo y las imágenes de pila z, descritas en este protocolo, permiten una mejor visualización de la estructura tridimensional del saco endolinfático.
Para una microdisección exitosa, el punto crítico es visualizar mentalmente todo el contorno del saco endolinfático, incluso si es invisible en el ratón de tipo salvaje. La observación del indicador fluorescente que se muestra en la Figura 3 y en la Figura suplementaria 1-2 puede ser útil para reconocer la localización y el tamaño del saco endolinfático en ratones.
Si bien este método de disección de montaje completo se utilizó para la inmunotinción en el protocolo anterior, esta técnica también se puede usar para recolectar tejido de saco endolinfático para el análisis de expresión génica, como RT-qPCR, expresión de micromatrices e incluso secuenciación de ARN de una sola célula. Los resultados del análisis de secuenciación de ARN de una sola célula utilizando tejido preparado con este protocolo han sido reportados previamente16. Para el análisis de la expresión génica de las células epiteliales del saco endolinfático, es preferible recolectar epitelio aislado para que no haya contaminación con otros tejidos adyacentes. Aunque el saco endolinfático embrionario se puede separar de los tejidos conectivos adyacentes, es mucho más difícil hacerlo a edades más avanzadas. En el caso de muestras de ratones más viejos, se recomienda la incubación con colagenasa/dispasa durante 5 min a 37 °C y facilita el aislamiento del epitelio del saco endolinfático.
Uno de los inconvenientes de la inmunotinción de montaje completo descrita en este protocolo es que la estructura tridimensional original puede verse afectada por un traumatismo durante la disección o el montaje de la preparación entre el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos. Es necesario tener cuidado para evitar artefactos debidos a la manipulación.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramural de los NIH, NIDCD (NIH Intramural Research Funds Z01-DC000060 y ZIC DC000081 al Advanced Imaging Core). Agradecemos a los Dres. Raoul D. Nelson y R. Lance Miller (Universidad de Utah, Salt Lake City, UT) y a la Dra. Susan Wall (Facultad de Medicina de la Universidad de Emory, Atlanta, GA) por compartir los ratones Tg(ATP6V1B1-Cre) y al personal del centro de animales del NIDCD por cuidar de nuestros animales. Expresamos nuestro agradecimiento a la Dra. Philine Wangeman por la hermosa ilustración del oído interno. Agradecemos a los Dres. Thomas B. Friedman y Robert J. Morell por la revisión crítica de este manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| EDTA 0,5 M | Crystalgen | 221-057 | |
| Jeringa TUBERCULINA de 1 mL con BD 309623 | |||
| Placa de vidrio puntual de 9 pocillos | Pyrex | 13-748B | |
| Alexa Fluor 555-conjugada Faloidina | ThermoFisher Scientific | A34055 | |
| Arteria Tijeras - Punta de bola | Fine Science Tools | 14080-11 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cámara para capturar imágenes en luz incidente | Leica | DFC 495 | |
| Cámara para capturar imágenes fluorescentes | Leica | DFC 7000 GT | |
| Tubos de centrífuga 15 mL | Corning | 430053 | |
| Tubos de centrífuga 50 mL | Corning | 430829 | |
| Colagenasa/Dispasa | Roche | 10269638001 | |
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM 880 | |
| Cubierta de vidrio | Corning | 2940-223 | |
| Dumont #4 Pinzas | Herramientas de Ciencias Finas | 11241-30 | |
| Dumont #5 Pinzas | Herramientas de Ciencias Finas | 11251-20 | |
| Dumont #55 Pinzas | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Tijeras Bonn Extra Finas | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Alternativa: Tijeras de microdisección extrafinas; Recto; Puntas afiladas; Longitud de la hoja de 20 mm; 3 1/2" de longitud total | Roboz | RS-5880 | |
| Anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario conjugado ThermoFisher | Scientific | A11034 | |
| MicroSlides Superfrost | VWR | 48311-702 | |
| Agitador orbital, por ejemplo Mini Shaker | Daigger | 980275 | |
| Paraformaldehído (PFA) 16% Solución acuosa | Microscopía electrónica Sciences | 15710 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| ProLong Gold Mountant Antidecolorante con DAPI | ThermoFisher Scientific | P36931 | |
| Anticuerpos anti-Pendrin | para | Interno RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011) | |
| Pinzas de anillo | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| Agitador oscilante, por ejemplo Microscopio | Labnet | S0500 | |
| equipado con un objetivo PlanApo 1.0x | |||
| , .009" | GEM Personna | 62-0176 | |
| Plato de cultivo de tejidos 60 mm | Falcon | 353002 | |
| Esmalte | |||
| Triton X-100 | ACROS Orgánicos | 32737-1000 |
Referencias
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