Extracción, purificación y perfilado de gangliósidos

Resumen

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos portadores de ácido siálico que son particularmente abundantes en el cerebro. Su naturaleza anfipática requiere técnicas de extracción y purificación orgánicas / acuosas para garantizar una recuperación óptima y análisis precisos. Este artículo proporciona información general sobre la extracción de gangliósidos a escala analítica y preparativa, la purificación y el análisis de cromatografía de capa delgada.

Resumen

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico. Se encuentran en todas las células y tejidos de vertebrados, pero son especialmente abundantes en el cerebro. Expresados principalmente en la valva externa de las membranas plasmáticas de las células, modulan las actividades de las proteínas de la superficie celular a través de la asociación lateral, actúan como receptores en las interacciones célula-célula y son objetivos para patógenos y toxinas. La desregulación genética de la biosíntesis de gangliósidos en humanos da como resultado trastornos congénitos graves del sistema nervioso. Debido a su naturaleza anfipática, la extracción, purificación y análisis de gangliósidos requieren técnicas que han sido optimizadas por muchos investigadores en los 80 años transcurridos desde su descubrimiento. Aquí, describimos métodos a nivel de banco para la extracción, purificación y análisis cualitativos y cuantitativos preliminares de los principales gangliósidos de tejidos y células que se pueden completar en unas pocas horas. También describimos métodos para el aislamiento y purificación a mayor escala de las principales especies de gangliósidos del cerebro. Juntos, estos métodos proporcionan acceso a escala analítica y preparativa a esta clase de moléculas bioactivas.

Introducción

Los gangliósidos se definen como glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico1. Se expresan principalmente en la superficie celular con su fracción lipídica de ceramida hidrofóbica incrustada en la valva externa de la membrana plasmática y sus glicanos hidrófilos que se extienden hacia el espacio ^{extracelular2}. Aunque se distribuyen ampliamente en las células y tejidos de los vertebrados, son particularmente abundantes en el cerebro de los ^vertebrados3, donde fueron descubiertos y nombrados por primera ^vez4.

Las estructur....

Protocolo

La recolección de tejidos se realizó en condiciones autorizadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins.

1. Extracción de gangliósidos a pequeña escala y purificación parcial

PRECAUCIÓN: Use ventilación adecuada cuando trabaje con solventes volátiles y tóxicos. Evite el plástico en todas partes; los disolventes extraerán componentes químicos de muchos plásticos que interfieren con los análisis posteriores. El politetrafluoroetileno (PTFE) es una excepción; Se deben usar cierres revestidos de PTFE para tapar los viales de almacenamiento de vidrio.

1. Extracción
   1. Pesar un solo cere....

Resultados

Los métodos descritos en la sección 1 (pequeña escala) proporcionan gangliósidos en cantidad y pureza suficientes para la determinación cualitativa y cuantitativa de los principales gangliósidos cerebrales. La recuperación del cerebro del ratón es de ~ 1 μmol de gangliósido por g de peso húmedo cerebral (1 nmol / μL) cuando se prepara como se describe. La resolución TLC de 1 μL (1 nmol) utilizando la sección 3 proporciona un amplio material para la detección de resorcinol y resuelve todos los principales gangliósidos cer.......

Discusión

Los métodos para la extracción y el aislamiento de gangliósidos a pequeña y gran escala reportados aquí no son únicos: existen muchos enfoques diferentes de extracción y purificación con solventes que proporcionan excelentes ^resultados12. Los métodos reportados aquí para la purificación a pequeña escala del cerebro, de Fredman y Svennerholm13, demostraron optimizar la recuperación y han demostrado ser robustos y sencillos durante muchos años en nuestro laboratorio. El aisla.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cerebro bovino,	pelado PelFreez	57105-1
Ganglioside standards	Matreya	GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Frasco de vidrio con tapón revestido de PTFE	Fisher Scientific	02-911-739
Botella centrífuga de vidrio	Fisher Scientific	05-586B
Tubos de cultivo de vidrio, 16 x 125 mm	VWR	60825-430	para la recogida de fracciones de HPLC
Embudo separador de vidrio (2 L)	Pyrex	6400-2L
Jeringa de inyección - Hamilton 1750 estanco al gas 500 y micro; l	Hamilton	81265
p-Anisaldehído, 98%	Sigma-Aldrich	A88107
Potter-Elvhjem Homogeneizador	Fisher Scientific	08-414-14A	Elija la opción de volumen adecuada
Reprosil 100 NH2 10µ m Columnas de protección de 5x4mm	Analytics-Shop	AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μ m, 250 mm x 20 mm Columna de HPLC	Analytics-Shop	Empaquetado a medida	otros tamaños disponibles
Resorcinol	Sigma-Aldrich	30752-1
Evaporador rotativo	Buchi	R-300
Bucle de muestra para inyector modelo 7725 (5 ml)	Sigma-Aldrich	57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)	Aguas	WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Cartucho Corto, 400 mg		Jeringa Waters
Spotting - Hamilton 701N 10 µ l	Hamilton	80300
Tubos de ensayo de paredes gruesas de 13 mm de diámetro con tapas revestidas de PFTE	Fisher Scientific	14-933A
Viales roscados de 2 ml con tapas revestidas de PFTE	Fisher Scientific	14-955-323 Para placas TLC	almacenamiento de gangliósidos
, HPTLC Gel de sílice 60 F254 Multiformato	Fisher Scientific	M1056350001	La impregnación de fluorescencia (F254) estabiliza el sorbente pulverizador
reactivos TLC	Fisher Scientific	05-723-26A
Cámara de funcionamiento TLC para placas de 10 x 10 cm	Camag	22.5155
Waring 1 litro Acero inoxidable resistente a explosiones batidora	Waring	E8520